Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Como las células gliales en el cerebro, los astrocitos tienen diversos papeles funcionales en el sistema nervioso central. En presencia de estímulos nocivos, los astrocitos modifican sus propiedades funcionales y estructurales, una condición llamada astrogliosis reactiva. Aquí, se presenta un protocolo para la evaluación de las propiedades morfológicas de los astrocitos. Este protocolo incluye la cuantificación de 12 parámetros diferentes es decir, la superficie y el volumen del tejido cubierto por un astrocito (territorio de astrocitos), todo el astrocito incluyendo sucursales, cuerpo celular y núcleo, así como la longitud total y el número de sucursales, la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m 2). Para ello se crearon tres dimensiones (3D) imágenes microscópicas confocal, y la imagen 3D software de análisis, como se utilizó Volocity 6.3 para mediciones. Tejido cerebral de rata expuestos a beta amiloide 1-40 </se utilizó sub> (Aß 1-40) con o sin una intervención terapéutica para presentar el método. Este protocolo también se puede utilizar para el análisis morfométrico 3D de otras células a partir de ya sea in vivo o in vitro condiciones.
Introduction
En el sistema nervioso central saludable (CNS), los astrocitos desempeñan un papel importante en la regulación del flujo sanguíneo, el metabolismo energético, la función sináptica y la plasticidad, y el ion extracelular y neurotransmisor homeostasis a 1-3. Además, los astrocitos responden a diferentes estímulos nocivos y condiciones anormales, tales como trauma, infección, isquemia o la neurodegeneración a través de astrogliosis reactiva que se caracteriza por la hipertrofia, proliferación y remodelación funcional de astrocitos 4,5.
Astrogliosis reactiva puede diseñar la respuesta inflamatoria y proceso de reparación en el tejido y, por lo tanto, puede afectar a la evolución clínica de las intervenciones terapéuticas. En consecuencia, los astrocitos han recibido atención por parte de neurólogo durante las últimas décadas como objetivos potenciales para las intervenciones terapéuticas para una variedad de enfermedades que afectan el sistema nervioso central.
Los astrocitos tienen normalmente una forma estrellada con el bienestar dramas efined que se extienden alrededor del soma 6. En una condición de enfermedad en el cerebro, se convierten en las ramas de astrocitos enrevesada hinchados y muestran extremos 7, por ejemplo en la presencia de beta amiloide (Aß).
En este artículo se presenta un protocolo para el análisis de imágenes en 3D de astrocitos adquiridos por microscopía confocal. Se midieron doce parámetros cuantitativos diferentes para cada astrocito: las áreas superficiales y volúmenes de astrocito el territorio (el tejido cubierto por un astrocito), célula entera (incluyendo ramas), cuerpo de la célula, y el núcleo; la longitud total y el número de sucursales; la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos; y la densidad de los astrocitos (número / 1000 m 2). Para este fin, hemos utilizado las secciones del cerebro de ratas expuestas a intrahipocampal inyección de Aß 1-40 con o sin tratamiento genisteína como una sustancia anti-inflamatorio. El protocolo descrito se puede utilizar para una morfométricoÁLISIS de diferentes tipos de células in vitro o in vivo en diferentes condiciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el protocolo actual, hemos empleado morfometría confocal 3D para evaluar 12 parámetros diferentes que se asociaron con la morfología de astrocitos. Para este fin, el tejido del hipocampo de ratas con Aß 1-40 – se utilizaron astrogliosis inducida, con o sin pretratamiento genisteína como un agente anti-inflamatorio. Mediante el uso de imágenes en 3D y software morfométricos, hemos sido capaces de mostrar el efecto de la genisteína en astrogliosis es decir, la morfología de los astrocitos. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
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