Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Beyindeki glial hücreleri gibi, astrositler, merkezi sinir sistemindeki çeşitli işlevsel rolleri vardır. Zararlı uyaranların varlığında, astrositler işlevsel ve yapısal özellikler, reaktif astrogliasis denilen bir durum değiştirir. Burada, astrositler morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi için protokol verilmektedir. Bu protokol şube yüzey alanı ve bir astrosit (astrosit topraklarında) kapsamında dokusu, şube, hücre gövdesi ve nukleus dahil olmak üzere tüm astrosit, hacmi, yani 12 farklı parametrelerin ölçümü yanı sıra toplam uzunluğu ve numarasını içeren, şiddeti astrosit tespiti için kullanılan antikorların floresan immünoreaktivitesinin ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2) evi. Volocity 6,3 ölçümleri için kullanılmıştır gibi, bu amaç için, üç boyutlu (3D) odaklı mikroskopik resimleri oluşturulur, ve 3 boyutlu görüntü analizi yazılımı gibi bulundu. Amiloid beta 1-40 maruz Sıçan beyin dokusu </ya da terapötik bir müdahale olmaksızın alt> (Aβ 1-40) bir yöntem mevcut için kullanılmıştır. Bu protokol, aynı zamanda, in vivo ya da in vitro koşullarında ya da diğer hücre 3D morfometrik analizi için kullanılabilir.
Sağlıklı, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde, astrositler, kan akışı, enerji metabolizmasında, sinaptik fonksiyon ve plastisite ve hücre dışı iyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar ve nörotransmitter 1-3 homeostazı. Buna ek olarak, astrositler farklı zararlı uyaranlara ve hipertrofisi, çoğalması ve astrositler 4,5 fonksiyonel biçimlenme ile karakterizedir reaktif astrogliyozun yoluyla travma, enfeksiyon, iskemi veya nörodejenerasyon gibi anormal şartlarda cevap.
Reaktif astrogliasis terapötik girişimlerin klinik sonuçlarını etkileyebilir, bu nedenle, dokuda inflamatuar yanıtı ve onarım sürecini mühendis ve olabilir. Buna göre, astrocytes MSS etkileyen hastalıkların çeşitli terapötik müdahaleler için potansiyel hedefler olarak son yıllarda nörobilimci dikkati aldık.
Astrositler normalde iyi-d ile stellat şekli varsoma 6 çevresinde yayıldı efined dalları. Beyindeki hastalıklı durumda, astrosit dalları kıvrık hale gelir ve amiloid beta (Aβ) mevcudiyetinde, örneğin, şiş uçları 7 göstermektedir.
Bu makale konfokal mikroskobu ile elde edilen astrositlerin 3D görüntüleri analiz etmek için bir protokol sunar. Her astrosit için on iki farklı sayısal parametreler ölçüldü: yüzey alanları ve astrosit topraklarında (bir astrosit kaplı dokusu), (şubeler dahil) tüm hücre, hücre gövdesi ve nükleus hacimleri; Toplam uzunluğu ve şube sayısının; astrosit tespiti için kullanılan antikorların flüoresan yoğunluğu; ve astrositlerde yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2). Bu amaçla, ya da bir anti-enflamatuvar madde olarak genistein muamelesi olmadan Aβ 1-40 enjeksiyon intrahipokampal maruz farelerin beyin bölümleri kullanılır. Açıklanan protokol morfometrik An için kullanılabilirin vitro veya farklı koşullar altında in vivo olarak farklı hücre tipleri Analizi.
Geçerli protokol, astrosit morfolojisi ile ilişkili 12 farklı parametrelerini değerlendirmek için 3D konfokal morfometrisi kullandı. Bu amaçla, Aβ 1-40 olan sıçanların hipokamp dokusunda – ya da bir anti-enflamatuvar ajan olarak genistein, ön muamele olmaksızın uyarılan astrogliyozun kullanılmıştır. 3D görüntüler ve morfometrik yazılımını kullanarak, astrositlerde morfolojisi yani astrogliyozun üzerinde genistein etkisini göstermek başardık.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |