Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
В глиальных клеток в головном мозге, астроциты имеют различные функциональные роли в центральной нервной системе. В присутствии вредных раздражителей, астроциты изменять их функциональные и структурные свойства, состояние называется реактивной астроглиоз. Здесь протокол для оценки морфологических свойств астроцитов представлена. Этот протокол включает в себя количественную оценку 12 различных параметров, т.е. площади поверхности и объема ткани, покрытой астроцитов (астроцитов территории), всего астроцитов в том числе филиалов, теле клетки и ядра, а также общую длину и количество ветвей, интенсивность флуоресценции иммунореактивности антител, используемых для обнаружения астроцитов, и астроцитов плотности (номер / 1000 мкм 2). Для этого были созданы трехмерные (3D) изображения конфокальной микроскопии, и программное обеспечение для анализа 3D-изображения, такие как был использован Volocity 6.3 для измерений. Крыса ткани мозга подвергается бета-амилоида 1-40 </суб> (Ар 1-40) с или без терапевтического вмешательства была использована, чтобы представить способ. Этот протокол также может быть использован для анализа 3D морфометрического других клеток из или в естественных условиях или в пробирке условий.
Introduction
В здоровом центральной нервной системы (ЦНС), астроциты играют важную роль в регуляции кровотока, обмена веществ, энергии синаптической функции и пластичности, и внеклеточной иона и нейромедиатор гомеостаза 1-3. Кроме того, астроциты реагируют на различные стимулы и вредных аномальных условиях, таких как травма, инфекция, ишемии или нейродегенерации через реактивной астроглиоза которая характеризуется гипертрофией, пролиферации и функционального ремоделирования астроцитов 4,5.
Реактивный астроглиоз может разработать воспалительную реакцию и процесс ремонта в ткани и, следовательно, могут влиять на клинические результаты терапевтического вмешательства. Соответственно, астроциты получили внимание от невролога в течение последних десятилетий в качестве потенциальных мишеней для терапевтических вмешательств для различных заболеваний, влияющих на ЦНС.
Астроциты, как правило, имеют форму севрюга с хорошо дefined ветви, которые распространились по всему сомы 6. В болезненном состоянии в головном мозге, астроцитов ветвей становится запутанным и показать опухшие концы 7, например, в присутствии бета-амилоида (Ар).
Данная статья представляет собой протокол для анализа 3D изображения астроцитов, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Были измерены Двенадцать различных количественных параметров для каждого астроцитов: участки поверхности и объемы территории астроцитов (ткани, покрытой с помощью астроцитов), вся клеток (в том числе филиалы), клетки тела, и ядра; общая длина и количество ветвей; интенсивность флуоресценции антител, используемых для обнаружения астроцитов; а плотность астроцитов (номер / 1000 мкм 2). Для этого мы использовали срезы головного мозга у крыс, подвергшихся intrahippocampal инъекции А 1-40 с или без лечения генистеин как противовоспалительное вещество. Описанный протокол может быть использован для морфометрического ANalysis различных типов клеток в пробирке или в естественных условиях в различных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В текущем протоколе, мы использовали 3D конфокальной морфометрии оценить 12 различных параметров, которые были связаны с астроцитов морфологии. Для этой цели гиппокампа ткани крыс с A & beta; 1-40 – были использованы индуцированного астроглиоза, с или без предварительной обработки ге?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. . A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry – a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
