Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kemo-enzymatisk syntese af N- glycans for arrayet udvikling og HIV antistof profilering

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

En modulopbygning til syntese af N- glycans for vedhæftet fil i en aluminium oxid-belagt glas glide (ACG dias) som en glycan microarray er blevet udviklet og dets anvendelse til profilering af en HIV bredt neutraliserende antistoffer er blevet påvist.

Abstract

Vi præsenterer en meget effektiv måde til hurtig fremstilling af en bred vifte af N-forbundet oligosaccharider (skønnes for at overstige 20.000 strukturer), der er almindeligt forekommende på menneskelige glykoproteiner. For at opnå den ønskede strukturelle mangfoldighed, strategien begyndte med kemo-enzymatisk syntese af tre slags oligosaccharyl fluor moduler, efterfulgt af deres trinvis α-selektive glycosylations på den 3-O og 6-O holdninger af den mannose rester af den fælles core trisaccharide at have en afgørende β-mannoside kobling. Vi yderligere knyttet N- glycans til overfladen af en aluminium oxid-belagt glas (ACG) dias til at oprette en kovalent blandet array til analyse af hetero-ligand interaktion med en HIV-antistof. Især type bindende opførsel af en nyligt isolerede HIV-1 bredt neutraliserende antistof (bNAb), PG9, at blandingen af tætliggende mand5GlcNAc2 (mand5) og 2,6-di-sialylated bi-antennary kompleks N- glycan (SCT ) på arrayet ACG åbner en ny avenue for at guide de effektive immunogenerne design for HIV vaccine udvikling. Derudover indeholder vores ACG array et kraftfuldt værktøj til at studere andre HIV antistoffer for hetero-ligand bindende adfærd.

Introduction

N- glycans på glykoproteiner hænger kovalent sammen med asparagin (Asn) rester af konsensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, der påvirker flere biologiske processer såsom protein kropsbygning, antigenicity, opløselighed og lektin anerkendelse 1 , 2. den kemiske syntese af N-sammenkædede oligosaccharider repræsenterer en betydelig syntetiske udfordring på grund af deres enorme strukturelle mikro heterogenitet og stærkt forgrenede arkitektur. Omhyggelig udvælgelse af beskytte grupper for at tune reaktivitet af byggeklodser, at opnå selektivitet på anomere Centre og korrekt brug af promotor / activator(s) er centrale elementer i syntese af komplekse oligosaccharider. For at løse dette problem med kompleksiteten, en stor mængde af arbejde for at fremme N- glycan syntese blev rapporteret seneste3,4. Trods disse robuste tilgange, finde en effektiv metode til fremstilling af en bred vifte af N- glycans (~ 20.000) er fortsat en stor udfordring.

Hurtig mutation er i HIV-1 for at opnå den omfattende genetiske mangfoldighed og dens evne til at flygte fra neutraliserende antistof reaktion, blandt de største udfordringer at udvikle en sikker og forebyggende vaccine mod HIV-15,6 , 7. en effektiv taktik, som HIV bruger til at undgå immunrespons vært er den posttranslationelle glykosylering af kuvert glycoprotein gp120 med et mangfoldigt N-knyttet glycans stammer fra værten glykosylering maskiner8, 9. En nylig rapport om den præcise analyse af rekombinant monomere HIV-1 gp120 glykosylering fra menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T celler tyder på forekomsten af strukturelle microheterogeneity med en karakteristisk celle-specifikke mønster10 , 11 , 12. derfor forståelse glycan særegenheder af HIV-1 bNAbs kræver godt karakteriseret gp120 relateret N- glycan strukturer i en mængde tilstrækkelig til analyse.

Opdagelsen af glycan microarray teknologi forudsat høj overførselshastighed-baserede udforskning af særlige forhold i en bred vifte af kulhydrat-bindende proteiner, virus/bakteriel adhesins, toksiner, antistoffer og lectines13,14 . Den systematiske glycans arrangement i en klædt chip-baserede format kunne bestemme problematisk lav affinitet protein-glycan interaktioner gennem multivalent præsentation15,16,17,18. Denne chip-baserede glycan arrangement synes bekvemt at effektivt efterligner celle-celle grænseflader. For at berige teknologien og overvinde den ujævne problem forbundet med konventionelle array formater, udviklet vores gruppe for nylig en glycan array på en aluminium oxid-belagt glas (ACG) dias ved hjælp af phosphonic syre-ended glycans for at forbedre signal intensitet, homogenitet og følsomhed19,20.

For at forbedre den aktuelle viden om glycan epitoper af nyligt isolerede HIV-1 bredt neutraliserende antistoffer (bNAbs), har vi udviklet en yderst effektiv modulære strategi for udarbejdelsen af en bred vifte af N-knyttet glycans21 ,22 skal udskrives på en ACG slide (Se figur 1). Specificitet profilering studier af HIV-1 bNAbs på arrayet ACG tilbudt den usædvanlige påvisning af hetero-glycan bindende opførsel af højpotente bNAb PG9, der blev isoleret fra HIV smittede individer23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af D1/D2 Arm moduler22

  1. Forberedelse af mellemliggende 2
    1. Vejer starter materiale 1 (vist i figur 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) i en 15 mL tube og opløses i Tris buffer (25 mM, pH 7,5) indeholdende mangan dichloride (frihedsbevægelse2, 10 mM) at opnå en endelig glycan koncentration på 5 mM.
    2. Tilføj 2 ækvivalenter af uridine ud galactose (UDP-Gal).
    3. Tilføj 150 enheder af enzymet β-1, 4 galactosyl transferaser fra kvæg mælk, og Inkuber blanding på 37 oC for 15 h.
    4. Efter 15 h, udføre tyndtlagskromatografi (TLC) til at angive samlede forbrug af starter materiale ved at afdække reaktionsblandingen på en TLC plade, udvikle med n-butanol/eddikesyre/vand (H2O) i en 1:1:1 ratio og farvning af en løsning af 0,25 M cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme. Derefter slukke reaktionen ved opvarmning på 90 oC i 5 min.
    5. Centrifugeres reaktionsblanding ved en hastighed på 2,737 x g i 3 min, og indlæse supernatanten øverst på polyacrylamid gel kolonne (Se Tabel af materialer). Elueres kolonnen med destilleret afioniseret vand, og indsamle produkt med brøkdele af 1-2 mL.
    6. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC26, udvikle med n-butanol: H2O: eddikesyre i en 1:1:1 ratio, og farvning af en opløsning af cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme. Lyophilize27 produkt indeholdende brøker for at opnå mellemliggende 2 (115 mg, 86%) som hvidt pulver. Karakterisere produkt af NMR28 og masse spektroskopi29 (Se supplerende datafil).
  2. Forberedelse af mellemliggende 3
    1. Vejer starter materielle 2 (vist i figur 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)) i en 15 mL tube og opløses i Tris buffer (25 mM, pH 7,5) indeholdende frihedsbevægelse2 (10 mM) til at forberede en endelige glycan koncentration på 5 mM.
    2. Tilføj 2 ækvivalenter af Guanosinmonofosfat 5'-diphospho-β-L-fucose dinatriumsalt (BNP-Fuc).
    3. Tilføj 150 enheder af enzymet α-1, 3 fucosyl transferaser fra Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695), og der inkuberes blanding på 37 oC for 15 h.
    4. Følg trin 1.1.4.
    5. Følg trin 1.1.5.
    6. Følg trin 1.1.6 at opnå mellemliggende 3 (82 mg, 84%) som hvidt pulver. Karakterisere produktet ved NMR og masse spektroskopi (Se supplerende datafil).
  3. Forberedelse af modul 4 og 5
    1. Veje sammensatte 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g, 0.360 mmol) eller sammensatte 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.100 g, 0,125 mmol) i en 25 mL single-hals runde-bunden kolbe og tør under vakuum i 30 min.
    2. Fjern kolben fra vakuum, fylde det med nitrogen gas, tilføje en magnetisk røre bar, lægge loft over det med en gummi septum og vedhæfte en nitrogen ballon.
    3. Indsprøjtes 7 mL tør pyridin og 3 mL eddikesyreanhydrid (Ac2O) i kolben placeret på isbad på 0 oC. røre den resulterende reaktion i 12 timer ved stuetemperatur med en magnetomrører på 600-700 rpm. Fordamper opløsningsmidler ved hjælp af en roterende fordamper ved et vakuum Tryk på 0 - 10 mbar på 50 oC.
    4. Fortynd rå blandingen ved hjælp af 30 mL dichlormethan (DCM) og uddrag med mættede vandige natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) (2 x 20 mL) i en 50 mL skilletragt.
    5. Re uddrag den vandige lag med DCM (3 x 15 mL) og tør de kombinerede organiske lag over natrium sulfat. Fjerne natriumsulfat ved filtrering og vask med DCM (5 mL). Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper på 400 mbar vakuum pres på 40 oC.
    6. Indlæse løsningen af rå blanding i 2 mL af DCM oven på silica seng.
    7. Elueres kolonnen med en blanding, der indeholder toluen og acetone fra 0 - 20% acetone i toluen og indsamle brøkdele af 5-10 mL.
    8. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC (trin 1.1.4 og 1.1.6), udvikle med toluen/acetone (7/3), og farvning med en opløsning af cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme på en varm tallerken.
    9. Fordampe det produkt, der indeholder fraktioner ved hjælp af en rotationsfordamper til få ønskede produkter som hvide skum i 72% og 85% udbytte, henholdsvis.
    10. Opløse produkterne til 7 mL acetonitril: toluen: H2O i en 4:2:1 ratio i et 25 mL runde-bunden kolbe.
    11. Tilføje cerium ammoniumnitrat (2 ækvivalenter) mens køling til 0 oC ved hjælp af isbad. Rør reaktionen ved stuetemperatur i 3 timer ved ~ 500-800 rpm.
    12. Efter TLC angiver samlede forbrug af starter materiale (TLC udvikle med toluen/acetone (7/3) og visualisering af UV absorbans ved 254 nm eller ved farvning med en opløsning af cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme), fortyndes reaktionsblandingen med ethylacetat (30 mL) og ekstrakt med H2O (15 x 2 mL).
    13. Uddrag de kombinerede organiske lag med 5 mL mættet natriumchlorid (NaCl) løsning.
    14. Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper på 240 mbar vakuum pres på 40 oC.
    15. Indlæse løsning af rå vare i 2 mL af DCM oven på silica seng. Elueres kolonnen med en blanding, der indeholder toluen og acetone (0 - 20% acetone i toluen) og indsamle brøkdele af 5-10 mL. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC, udvikle med toluen/acetone (7/3).
    16. Fordampe de produkt-holdige fraktioner ved hjælp af en rotationsfordamper på 77 mbar vakuum og 40 oC at få ønskede produkter som hvidt skum.
    17. Opløses de respektive alkoholer i 10 mL af DCM i en 25-mL single-hals runde-bunden kolbe og afkøles til-30 oC.
    18. Tilføj diethylaminosulfur trifluoride (DAST, 2-ækvivalenter). Rør reaktionsblandingen på-30 oC i 2 timer.
    19. Efter TLC angiver forbrug af starter materiale (TLC udvikle med toluen/acetone (4/1) og visualisering af UV absorbans ved 254 nm eller ved farvning med en opløsning af cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme), fortyndes reaktionsblandingen med DCM (30 mL) , og vask med mættet NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Uddrag den kombinerede organiske lag med 5 mL mættet NaCl opløsning, tør det ved at tilføje vandfri magnesium sulfat, Filtrer blandingen efter en vask med DCM (5 mL), og samle det i et 100 mL single-hals runde-bunden kolbe.
    21. Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper på 400 mbar vakuum pres på 40 oC.
    22. Indlæse løsning af rå vare i 2 mL af DCM oven på silica seng. Elueres kolonne med en blanding af toluen og acetone (0-20% acetone i toluen) og indsamle brøkdele af 5-10 mL.
    23. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC, udvikle med toluen/acetone (7/3).
    24. Fordampe det produkt, der indeholder fraktioner ved hjælp af en rotationsfordamper til få ønskede produkter 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluorid (54% over 2 trin) og 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluorid (67% over 2 trin) som hvide legemer.
    25. Karakterisere produktet ved NMR og masse spektroskopi (Se supplerende datafil).

2. forberedelse af Glycan 10

  1. Forberedelse af intermidiate 7
    1. Afvejes sølv triflate (AgOTf) (0,039 g, 0,155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride (Cp2HfCl2) (0.041 g, 0.108 mmol) i en 25-mL single-hals runde-bunden kolbe, tør det under schlenk linje vakuum i 30 min, fjerne den fra den vakuum, og fyld den med nitrogen gas.
    2. Overføre de frisk tørret 4 Å molekylære sigter (0,2 g) i kolben indeholdende AgOTf og Cp2HfCl2, tilføje en magnetisk røre bar, cap med septum straks og tilføje a kvælstof ballon.
    3. Overfør 3 mL tør toluen i kolben med en tør glas sprøjte. Rør reaktionsblandingen i 1 time ved stuetemperatur og derefter afkøles til 0 oC.
    4. Indsprøjtes en opløsning af donor 4 (figur 2, 0.043 g, 0.046 mmol) og acceptor 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (figur 3, 0,045 g, 0.031 mmol) i 3 mL toluen i kolben gennem septum ved hjælp af en 10 mL sprøjte på 0 o C. røre reaktionsblanding ved stuetemperatur i 3 timer.
    5. Efter TLC angiver forbrug af raavarer (TLC, udvikle med DCM/acetone (8,5/1,5) og visualisering af UV absorbans ved 254 nm eller ved farvning med en opløsning af cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme), slukke reaktionen ved at indsprøjte 10 ækvivalenter af Triethylcitrat Amin.
    6. Filtrere de molekylære sigter gennem en celite seng i en 50 mL rundbundet kolbe, og yderligere skylles med 10 mL ethylacetat. Uddrag de kombinerede organiske lag med en mættet opløsning af vandige NaHCO3 (2 x 20 mL) i en 50 mL skilletragt. Uddrag den vandige lag med ethylacetat (3 x 15 mL).
    7. Uddrag de kombinerede organiske lag med mættet NaCl opløsning (5 mL), tør det ved hjælp af vandfri magnesium sulfat, Filtrer blandingen for at fjerne magnesium-sulfat, vask med ethylacetat (3 x 15 mL), og saml filtratet i et 100 mL rundbundet kolbe.
    8. Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper på 240 mbar vakuum pres på 40 oC.
    9. Indlæse løsningen af rå produkt i DCM på toppen af kolonnen silica seng. Elueres kolonnen med en blanding indeholdende DCM og acetone (0-10% acetone i DCM) og indsamle brøkdele af 5-10 mL.
    10. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC, udvikle med DCM/acetone (8,5/1.5). Fordampe de fraktioner, der indeholder produktet ved hjælp af en rotationsfordamper for at opnå intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0.052 g, 70%), som hvid skum.
    11. Karakterisere produktet ved NMR og masse spektroskopi (Se supplerende datafil).
  2. Forberedelse af intermidiate 8
    1. Afvejes hexasaccharide 7 (figur 3, 0.040 g, 0,016 mmol) i en 25-mL single-hals runde-bunden kolbe, tør det under vakuum til 1 h, fjerne det fra vakuum, fylde det med nitrogen gas, tilføje en magnetisk røre bar og lægge loft over det med en gummi septum.
    2. Overfør 3 mL af acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 ratio) i kolben.
    3. Tilføj Pedersen-toluen ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre monohydrat (0,001 g, 0,008 mmol) ind i reaktionskolben og røre reaktion på 800 rpm i 5 h.
    4. Efter TLC angiver comsumption starte materiale (TLC, udvikle med DCM/acetone (8,5/1,5), og visualisering af UV absorbans ved 254 nm eller ved farvning med en opløsning af cerium ammoniummolybdat efterfulgt af varme), slukke reaktionen ved at indsprøjte 10 ækvivalenter af Triethylcitrat Amin.
    5. Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper på 337 mbar vakuum pres på 40 oC.
    6. Opløse den rå blanding med ca. 2 mL af DCM og indlæse den på toppen af silica seng.
    7. Elueres kolonne med en blanding af DCM og acetone (0 - 10% acetone i DCM) og indsamle brøkdele af 5-10 mL. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC, udvikle med DCM/acetone (8,5/1.5). Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper på 400 mbar vakuum og 40 oC.
    8. Tørre rester under reduceret tryk at give mellemliggende 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetyl-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figur 3, 0,022 g, 57%) som en hvid solid. Karakterisere produktet ved NMR og masse spektroskopi (Se supplerende datafil).
  3. Forberedelse af intermidiate 9
    1. Forberedelse af intermidiate 9 (figur 3) blev udført ved hjælp af donor 5 (0,015 g, 13.2 µmol) og acceptor 8 (figur 3, 0,020 g, 8,80 µmol).
    2. AgOTf (0.011 g, 44,1 µmol) og Cp2HfCl2 (0.012 g, 30,8 µmol) blev brugt som en evalueringsudvalget.
    3. Udfør trin 2.1.1 til 2.1.10 at få mellemliggende 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-3-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-3-d-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-3-d-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as hvidt skum.
  4. Globale deprotection af intermidiate
    1. Afvejes sammensatte 9 (0.010 g, 2,9 µmol) i en 25-mL single-hals runde-bunden kolbe, tilføje en magnetisk røre bar, cap med en gummi septum, og Vedhæft en nitrogen ballon.
    2. 2 ml af 1, 4 dioxan: H2O (4:1) til kolben. Tilføje lithium hydroxid (LiOH) (0,005 g, 50% af wt.) i kolben. Reaktionsblandingen omrøres på 90-100 oC i 12 timer og lad det køle på RT.
    3. Fordamper opløsningsmidler ved hjælp af en rotationsfordamper og tørre kolben under vakuum for 1 h, fylde det med kvælstof, fjerne det fra den vakuum manifold og lægge loft over det med en gummi septum.
    4. Injicere 4 mL tør pyridin og 2 mL eddikesyreanhydrid i kolben gennem septum ved hjælp af en 10 mL sprøjte på 0 oC. røre reaktionsblandingen til 12 h på RT.
    5. Fordampe opløsningsmidler ved hjælp af en rotationsfordamper på 0-10 mbar vakuum pres på 50 oC.
    6. Opløse rå blandingen ved hjælp af 30 mL af DCM og uddrag løsningen med mættede vandige NaHCO3 (2 x 20 mL) i en 50 mL skilletragt.
    7. Re uddrag den vandige lag med DCM (3 x 15 mL). Fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper.
    8. Indlæse en opløsning af produktet i ca. 2 mL DCM på toppen af C18 silica seng. Elueres kolonne med en blanding af vand og methanol (0 - 100% af methanol i vand) og indsamle brøkdele af 5-10 mL.
    9. Indsamle produkt fraktioner og fordampe under reduceret tryk få ønskede produkt som hvidt skum.
    10. Opløses produktet i 5 mL tør methanol i et 25 mL rund bund kolbe og lægge loft over det med en gummi septum.
    11. Overfør 0,1 mL af natrium methoxide (Viki) methanol og kølig til 0 oC ved hjælp af isbad og rør blandingen i 12 timer.
    12. Fjerne opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper og tørre produkt under højt vakuum.
    13. Opløse de rå produkter i 5 mL methanol: H2O: eddikesyre (6:3:1).
    14. Tilføje palladium hydroxid (Pd(OH)2) (50% af wt) og omrøres reaktion under brint atmosfære ved hjælp af en hydrogen ballon for 15 h.
    15. Filtrer reaktion gennem en celite seng og vaske med 2 mL methanol efterfulgt af 2 mL dd vand.
    16. Fordampe opløsningsmidler ved hjælp af en rotationsfordamper.
    17. Opløse den rå blanding med ca. 1 mL vand og indlæse den på toppen af polyacrylamid gel seng (Se Tabel af materialer). Elueres produktet med vand og indsamle brøkdele af 1-2 mL.
    18. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC, udvikle med n-butanol: H2O: eddikesyre (1:1:1).
    19. Indsamle produkt fraktioner og lyophilize for at få den ønskede vare 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a hvidt pulver.
    20. Karakterisere produktet ved NMR og masse spektroskopi (Se supplerende datafil).

3. forberedelse af Glycans med Phosphonic syre hale19,22

  1. Vejer de respektive glycan (2-5 µmol) i en 5 mL runde-bunden kolbe, tilføje en magnetisk røre bar og lægge loft over det med en gummi septum.
  2. Overføre 400 µL af frisk tørret dimethylformamid.
  3. Tilføj [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) ethanol (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) karbonat] (10-25 µmol, forberedt i huset) til glycan løsning. Blandingen omrøres på 800 rpm i 5 h.
  4. Fordampe opløsningsmidler ved hjælp af en rotationsfordamper på 5-10 mbar vakuum pres på 40 oC.
  5. Opløse reaktionsblandingen i 0,5 mL vand og indlæse øverst på polyacrylamid gel seng (Se Tabel af materialer). Elueres produktet ved hjælp af vand og indsamle brøkdele af 1-2 mL.
  6. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC26. Spot reaktionsmiljøet på en TLC plade, og tilføje pletten løsning 0,25 M cerium ammoniummolybdat; følge af varme ved hjælp af en varmeplade. Indsamle produkt indeholdende fraktioner og lyophilize for at få den ønskede vare som et hvidt pulver.
  7. Opløses produkt i 2 mL vand og tilsættes Pd (OH)2 (50% efter vægt). Rør reaktionen på 800 rpm under brint atmosfære ved hjælp af en hydrogen ballon for 15 h.
  8. Filtrer reaktion gennem en flux-udglødet seng og vaske med 2 mL methanol efterfulgt af 2 mL destilleret afioniseret vand. Fordampe opløsningsmidler ved hjælp af en rotationsfordamper på 300 mbar vakuum pres på 40 oC.
  9. Opløse den rå blanding med ca. 1 mL vand og indlæse den på toppen af polyacrylamid gel seng (Se Tabel af materialer).
  10. Elueres produktet med vand og indsamle brøkdele af 1-2 mL. Overvåge de indsamlede fraktioner af TLC26. Lyophilize fraktioner (fryse produktet ved hjælp af flydende nitrogen og derefter placere på lyophilizer under et vakuum) at få det ønskede produkt som et hvidt pulver. Kendetegne produkterne af NMR og masse spektroskopi (Se supplerende datafil) ved hjælp af D2O som opløsningsmiddel.

4. Glycan Array

  1. Forberedelse af aluminium belagt glas dias (ACG dias) 19 , 20 , 22
    Bemærk: Fremstilling af aluminium-belagt glas dias blev gjort på tynde Film teknologi Division, Instrument Technology Research Center og nationale anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Pack belagt dias, vakuum-seal dem at forhindre dannelsen af NAO og holde lukket indtil den elektrokemiske reaktion for overflade anodization.
  2. Overflade anodization af aluminium belagt glas dias 19 , 20 , 22
    1. Sæt den temperatur-kontrolleret inkubator ved 4 ° C. Forberede 0,3 M oxalsyre vandig opløsning og holde det i isbad. Tage 500 mL bægerglas, tilføje en magnetisk omrører bar.
    2. Overføre 0,3 M oxalsyre til 500 mL bægerglas, og derefter placere en 10 cm lange platin rod som en katode i løsningen. Hold omrøring (på 300 rpm) oxalsyre i hele anodization processen.
    3. Tænde lab sporstof software, skal du klikke på "Konfigurer" knappen og derefter "fungere valg feje spænding." Indstille start og stop spænding til 25,8 V, antal point til 100, overholdelse til 1, og feje forsinkelse til 1.200 ms og klik "ok."
    4. Klemme aluminium-belagt glas side vender mod katoden. Klik på "Kør prøve". Observere den aktuelle måling (~ 8-10 mA).
    5. Efter overfladen anodization, vaske dias grundigt med dobbeltdestilleret vand, rense tør med nitrogen gas og derefter opbevares i en 30% relativ luftfugtighed salen indtil videre brug.
  3. Fabrikation af ACG glycan microarray 22
    1. Udarbejde 100 µL af alle monovalent glycans (I-XI) i ethylenglycol på 10 mM koncentration individuelt.
    2. Fortynd den ovenstående glycan med udskrivning buffer (80% ethylenglycol og 20% afioniseret vand) for at gøre 100 µM koncentration.
    3. For hetero-ligand undersøgelse, forberede 5 µL af individuelle jeg-XI glycans, og til hver tilføje 5 µL af mand5GlcNAc2 (1:1 ratio).
    4. Print microarrays af robot pin (Se Tabel af materialer) af aflejring af 0,6 nL af de tidligere parat glycans på ACG glider31.
    5. Gemme de udskrevne dias i en luftfugtighed kontrolleret tør boks før bindende assay.
  4. Kortlægning glycan epitoper af HIV-1 bredt neutraliserende antistof PG9 22
    1. Forberede 1 mL BSA indeholdt PBST buffer, 3% w/v.
    2. Forberede 70 µL af PG9 (50 µg/mL) i PBST buffer (BSA indeholdt PBST buffer, 3% w/v).
    3. Forberede 120 µL af sekundære fluorescerende tag antistof æsel-anti-humant IgG (Alexa Fluor 647 konjugeret) 50 µg/mL i PBST buffer (BSA indeholdt PBST buffer, 3% w/v) i mørke.
    4. Bland primære antistof (PG9) og sekundære fluorescerende tag antistof i forholdet 1:1 (60 µL). Inkuber forblandet antistoffer i 30 min. ved 4 ° C.
    5. Indlæse ACG dias i dias inkubation kammer, der er opdelt i 16 brønde. Overføre 100 µL af forblandet antistoffer til matrixen glycan og inkuberes ved 4 ° C for 16 h.
    6. Med pipette overfoeres ud forblandet antistoffer. Fjern dias inkubation kammer.
    7. Vask diasset først i PBST buffer (PBS og 0,05% Tween-20), efterfulgt af afioniseret vand og spin-tør på 2.000 x g.
    8. Åbn microarray billede analyse software (Se Tabel af materialer). Indsæt et dias med funktionerne klædt vender nedad.
    9. Klik på ""-indstillingsmenuen, angive billedopløsningen 5 µm per pixel, og bølgelængde på 635 nm med PMT450 og magt til 100%.
    10. Klik på "scan"-knappen for at starte imaging diaset.
    11. Klik på filikonet "" for at redde scan billedet i tif format.
    12. Udføre billedanalyse ved at følge den software bruger guide32.
    13. Beregne den samlede intensiteten af fluorescens og illustrere ved hjælp af billedbehandling software33 (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Her, den gennemsnitlige procentdel fejl for alle datapunkter præsenteres af fejllinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En modulær kemo-enzymatisk strategi for syntese af en bred vifte af N -glycans er præsenteret i figur 1. Strategien er baseret på det faktum, at mangfoldighed kan være lavet i begyndelsen af kemo-enzymatisk syntese af de tre vigtige moduler, efterfulgt af α-specifikke mannosylation på den 3-O og/eller 6-O mannose rester af fælles holdning kerne trisaccharide af N- glycans. I betragtning af den strukturelle mangfoldighed af bi-, tri- og tetra-antennary komplekse type N- glycan strukturer, vi troede, at et sæt oligosaccharyl donorer og core trisaccharider acceptor med forudinstallerede alkyl handlecould anvendes som udgangspunkt materialer til at generere den ønskede strukturelle mangfoldighed (figur 1). Anvendeligheden af glycosyl fluor donorer i opbygningen af komplekse glycan bibliotek har bevist tidligere21.

For at demonstrere effektiviteten af vores strategi, blev en bi-antennary isomer struktur (10, figur 3) udvalgt til syntese. D1 arm antenner 4 og D2 arm antenner 5 glycan 10 blev genereret på store skalaer med kemo-enzymatisk metoder. Især var disaccharid acceptor 1 enzymatisk galactosylated ved hjælp af β-1, 4-galactosyltransferase og uridine 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) til at danne trisaccharide 2. Næste, den mellemliggende 2 var fucosylated på GlcNAc 3 -O position i tilstedeværelse af α-1, 3-fucosyltransferase fra Helicobacter pylori (Hpα1, 3 FT) til at give den ønskede tetrasaccharide 3. For kemiske ligatur til core, byggeklodser 2 og 3 var første peracetylated, og den reducerende ende p- methoxy phenol gruppe blev fjernet. Endelig, fluor blev installeret i nærværelse af DAST at få den ønskede modul 4 og 5, henholdsvis (figur 2).

Har de ønskede moduler i hånden, vi derefter gå videre til stereoselective 3 -O glykosylering af 4 core trisaccharide 6 under katalyse af sølv triflate og hafnocene dichloride til at give de respektive hexasaccharide 7 (Figur 3). Bensylidencamphor beskyttelse at maskering 4, 6-OH blev fjernet ved hjælp af katalytisk p-toluen ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (p- TSA). At drage fordel af dens reaktivitet, primær 6-OH 8 blev reageret med fluor modul 5 på lignende eksperimentelle betingelser til at opnå den krævede decasaccharide 9. Omsider, blev globale deprotection udført for at få glycan 10, som blev yderligere karakteriseret ved hjælp af NMR og masse spektroskopi (se filen supplerende Data).

Glycans indeholdende en pentyl Amin hale på den reducerende ende blev ændret med phosphonic syre linkers og knyttet til ACG overflade gennem phosphonate kemi (figur 4). På sidste, HIV-1 bNAb blev PG9 screenet for sin glycan specificitet ved hjælp af homo - og hetero-glycans arrays til at demonstrere for første gang, at PG9 kommunikerede med tilstødende heteroglycans i V1/V2 loop af HIV-1 gp120 overflade (figur 5).

Figure 1
Figur 1: En generel modulære strategi for forberedelse af N- glycans. (A) antallet af N- glycans genereret af denne strategi, der almindeligvis forekommer på menneskelige glykoproteiner skønnes for at overstige 20.000. (B) tre typer moduler er udarbejdet af denne kemo-enzymatisk metode, der kan bruges til α-seletive glycosylations. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Chemoenzymatic syntese af moduler. jeg, UDP-galactose, β 1, 4-GalT, 15 h, 86%; ii, BNP-fucose, α 1, 3-FucT, 15 h, 84%; III, (1) Ac2O, pyridin, RT, 12t; (1) kan, ACN: toluen: H2O, (3) DAST, CH2Cl2,-30 oC. kan: Cerium ammoniumnitrat; DAST: Diethylaminosulfur trifluoride.
Produktnomenklatur: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→ 2)-α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-3-d-glucopyranosyl]-(1→2)-α-3-d-mannopyranoside - methoxyphenyl; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor; 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluorid venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kemiske glykosylering af D1/D2 arm moduler at core acceptor. jeg, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, toluen, 4 Å MS, 0 oC til RT, 70%; ii, p- TSA, acetonitril, RT, 57%; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, toluen, 4 Å MS, 0 oC til RT, 34%; iv, (1) LiOH, 1,4-dioxan: H2O; 90 oC, 12t; (2) Ac2O, pyridin, 12t; (3) Viki, MeOH, 12t; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36%. AgOTf: Sølv trifluromethanesulfonate; CP2HfCl2: Bis (cyclopentadienyl) hafnium dichloride, MS: Molekylær sigter, produktnomenklatur: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Glycan immobilisering på arrayet ACG. (A) kemisk modifikation af glycan med amino hale til en phosphonic syre halen for kovalente tilknytning til diasset ACG gennem phosphonate kemi. (B) fordeling af glycans på en ACG overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Glyan array analyse. (A) strukturer af syntetiske N- glycans, der er trykt på et ACG array. (B) bindende analyse af PG9 til individuelle glycans jeg-XI trykt på ACG array (venstre panel) og glycan blandinger af mand5 blandet med glycans jeg-XI (højre panel) med 100 µM koncentration. De molære koncentrationer i µM til PG9 får i forklaringen. Mean signal Støtteintensiteter og standardafvigelse beregnet for fem uafhængige replikater på arrayet er vist. Mellemværker viser fluorescens billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En klasse af HIV-1 bNAbs herunder PG9, PG16 og PGTs 128, 141-145 blev rapporteret at være yderst potent i neutralisere 70-80% af det cirkulerende HIV-1 isolater. Epitoper af disse bNAbs er meget bevaret blandt varianterne af den hele HIV-1 gruppe M, således de kan guide den effektive immunogenerne design for en HIV-vaccine, der kan fremkalde neutraliserende antistoffer23,24,25 . Som en del af vores igangværende bestræbelser på at identificere glycan epitoper af HIV-1 bredt neutraliserende antistoffer, rapporterede vi kemiske og enzymatiske syntesen af et panel af høj mannose, hybrid og komplekse type oligosaccharider til at danne en glycan array21, 22. Men de almindeligt anvendte glycan matrixer på N- hydroxysuccinimide-belagt (NHS) glas dias er afskåret fra opdager lav affinitet kulhydrat-protein interaktioner, sandsynligvis på grund af heterogene glycan distribution som følge af hydrolyse af reaktiv N- hydroxysuccimide funktionelle grupper på dens overflade. For at overvinde begrænsningerne af konventionelle array formater, har vi udviklet en glycan array på en aluminiumoxid belagt glas (ACG) dias. Vi yderligere udføres en ensartethed sammenligning mellem ACG array og almindeligt anvendte NHS array til at bevise, at matrixen ACG tilbudt en mere homogen glycan præsentation på dens overflade22. Vores foreløbige bindende analyse var ikke i stand til at observere bindingen af PG9 til nogen af glycans på NHS array (data ikke vist). Derfor, for at definere bindende specificiteten af PG9, glycans jeg-XI var knyttet til en phosphonic syre hale og trykt på diasset ACG med 100 µM af individuelle glycans (figur 4). Glycan immobilisering på en ACG slide gennem phosphonate kemi tilbudt en mere stabil og homogen fordeling. Hver af glycans var trykt med fem replikater og diasbilleder blev indhentet fra en fluorescens scanning efter DyLight649-konjugeret æsel-anti-humant IgG antistof inkubation. Bindende analyse af PG9 mod individuelle glycans trykt på ACG array (figur 5, venstre panel) tyder på at PG9 kommunikerede kraftigt med hybrid-type glycan (X). Samspillet blev også konstateret for højt mannose type Man5 (glycan IV) og kompleks-type glycan (XI).

De molekylære niveau interaktioner mellem PG9 og hybrid-type glycan (X) er vanskeligt at afgøre, på grund af deres fælles krystal strukturoplysninger. Hybrid-type glycan X består af en complex-type arm på 3-O placering af kernen og en trimannose arm knyttet til de 6-O position i den centrale trisaccharide. Bindingen af PG9 til hybrid glycan X tyder på, at PG9 kræver både mannose og sialic syre rester i tæt nærhed til høj affinitet interaktioner. For at identificere kombinationen glycan, der bedst passer ind i den PG9 bindende lomme, udført vi en blandet glycan array undersøgelse. Glycan IV var blandet med hver glycan fra jeg-XI i forholdet 1:1 muldvarp og spottet på en ACG array. Bindende analyse af PG9 til hver af blandingerne anført, at en kombination af mand5 og en SCT (IV + XI) resulterede i det højeste affinitet til PG9 i forhold til IV eller XI alene. Derudover registreret blandinger indeholdende mand5 og dem, der indeholder sialylated antenner, såsom glycans VIII og X blev også22. For første gang tilbudt disse resultater en array baseret bevis for hetero-glycans' bindende opførsel af PG9, som blev foreslået af krystal struktur studier af PG9 med HIV-1 gp120 V1/V2 domæne23.

Afslutningsvis har vi vist en effektiv modulære kemo-enzymatisk strategi for forberedelse af meget forskellige N-forbundet oligosaccharider, der forekommer på menneskelige glykoproteiner. Desuden giver udviklingen af en ACG matrix et effektivt middel til at bestemme ekstremt svage protein-kulhydrat interaktioner og endnu vigtigere, det samspil, der opstår gennem hetero-glycans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke tynde Film teknologi Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) og nationale anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Dette arbejde blev støttet af National Science Council (give nr. De fleste 105-0210-01-13-01) og Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Tags

Kemi sag 132 kemo-enzymatisk syntese ACG glycan arrays HIV neutraliserende antistoffer N- glycans specificitet profilering modulære tilgang
Kemo-enzymatisk syntese af <em>N</em>- glycans for arrayet udvikling og HIV antistof profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter