Summary
在巨噬细胞模型中测量血清或血浆的体外胆固醇流出能力是动脉粥样硬化的一个很有前途的工具。在本研究中, 我们优化和规范了荧光 nbd-胆固醇外排法, 并开发了一个使用96孔板的高通量分析。
Abstract
动脉粥样硬化导致心血管疾病 (cvd)。目前尚不清楚胆固醇-高密度脂蛋白 (chdl) 浓度是否在动脉粥样硬化的发展中起因果作用。然而, 动脉粥样硬化斑块形成早期的一个重要因素是胆固醇流出能力的 hdl (hdl 颗粒接受胆固醇从巨噬细胞), 以避免泡沫细胞的形成。这是避免胆固醇在内皮细胞中积累的关键一步, 也是通过肝脏消除胆固醇的反向胆固醇转运 (rct) 的一部分。巨噬细胞模型中的胆固醇流出能力对血清或血浆的影响是一种很有前途的工具, 可作为动脉粥样硬化的生物标志物。传统上, [3h]-胆固醇已用于胆固醇外排分析。在这项研究中, 我们的目标是开发一个更安全和更快的策略, 使用荧光标签胆固醇 (nbd-胆固醇) 在细胞检测, 以跟踪胆固醇的吸收和流出过程中的 thp-1 衍生的巨噬细胞。最后, 我们对 nbd-胆固醇流出法进行了优化和规范, 并开发了一种利用96孔板进行高通量分析的方法。
Introduction
根据世界卫生组织的数据, 全世界目前的主要死亡原因是缺血性心脏病和中风 (死亡总人数为 1 520万人) 1.两者都是心血管疾病 (cvd), 可在动脉粥样硬化和血管破裂 2, 3.
动脉粥样硬化是一种血管壁炎症性疾病, 其中巨噬细胞、t 细胞、肥大细胞和树突状细胞浸润内皮细胞并从血液中积累, 最终形成动脉粥样硬化斑块。动脉粥样硬化斑块呈现脂质核和胆固醇晶体, 证明了高分辨率 b 超测量颈动脉内膜介质厚度4,5。在巨噬细胞中, 胆固醇流出对脂质受体颗粒是通过 atp 结合盒 (abc) 受体 abca1, atp 结合盒子家族 g 成员 1 (abcg1), 和清除剂受体 sr-bi 进行的。巨噬细胞中胆固醇流入和流出的不平衡被认为是动脉粥样硬化发生的一个关键过程6。胆固醇流出被认为是消除胆固醇从外周组织到血浆和肝脏的关键一步, 这个过程被称为反向胆固醇转运 (rct)。胆固醇主要从巨噬细胞转移到高密度脂蛋白 (hdl) 颗粒表面发现的载脂蛋白 a1 (apoa1)。然后, 高密度脂蛋白将胆固醇输送到肝脏进行排泄和再利用7,8,9。
传统上, (3h) 放射性标记的胆固醇已被用于胆固醇排出10。放射性同位素发射信号高度敏感10;然而, 放射性标记的胆固醇存在明显的障碍, 如长期的规程、电离辐射照射的风险, 以及需要特殊的放射性设施和设备来确保安全处理放射性排放。相反, 荧光已成功地纳入诊断技术, 因为它在荧光信号检测简单, 荧光种类繁多, 并具有安全性11。几种荧光标记的甾醇已被用于研究胆固醇代谢, 包括脱氢雌酚 (具有内在荧光)、丹西胆固醇、4, 4-二氟-3, 4adia-s-indacene (body y)-胆固醇和 22-(n-(7-硝基苯甲酸-2-oxa-1, 3-diazol-4-基)-23, 24-bisnor-5 choren-3β-ol (nbd-胆固醇)。特别是, nbd 胆固醇在人的细胞中具有有效的吸收12。目前有两种不同的 nbd 标签胆固醇:22-(n-(n-(7-硝基苯-2-o理事会-1, 3-二唑-4-基) 氨基)-23, 24-双苯-5-胆碱-3b-ol (22-nbd) 和 25-(n-[(7-硝基苯-2-氧-1, 3-二唑-4-基)-甲基] 氨基)-27-不高胆固醇 (25-nbd;图 1)。标记为22-nbd 的胆固醇可能最适合胆固醇外排研究, 而25-NBD-cholesterol 胆固醇主要用于细胞膜动力学研究13,14。
细胞系通常用于体外胆固醇排出分析是单核细胞样细胞, 如人类白血病衍生的 thp-1 细胞, 小鼠原始264.7 细胞15, 或 j774.1。所有这些细胞都可以用 phorbol 12-mristate 13 乙酸 (pma) 在体外分化为巨噬细胞, 但 thp-1 衍生巨噬细胞 (dthp-1) 最能反映和模仿人类巨噬细胞16。
在本研究中, 我们利用22-NBD-cholesterol 胆固醇作为 [3h]-胆固醇的替代品, 优化和规范荧光高通量法, 以确定 dmthp-1 上血清样品的胆固醇流出能力。此外, 我们还将优化后的荧光技术与标准放射性模拟技术进行了比较。
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Protocol
为这项研究, 获得了道德委员会的批准 (巴塞罗那医院诊所, 刑事调查委员会; 批准号 hcb/2012-0756) 和所有主体的书面知情同意。
1. nbd-胆固醇制剂
- 将 nbd 胆固醇 (mM 494.63; 见材料表) 中溶解, 以获得库存 (2 mm)。对于10毫克小瓶, 将整个小瓶中的整个小瓶中的乙醇体积溶解, 以获得 2 mm 的库存。
- 从 rpmi 1640 中的库存中稀释 nbd 胆固醇, 再加上10% 的胎牛血清和5% 的胎体血氧基霉素 (r10 培养基), 达到5μm 的最终浓度 (例如,在5μm 的最终浓度下获得10毫升的 nbd 胆固醇)。在 r10 培养基中稀释25μl 的 nbd-胆固醇 (2mm)。这个体积对于96孔板来说是足够的。
2. 细胞培养和播种 (第2天)
- 在37°c、5% co2的 r10 培养基中培养 thp-1 细胞。每3天调整到 0.3 x10 6 细胞。
- 将细胞播种在一个白色的96孔板与一个平坦的, 明确的底部在 0.2 x10 6 细胞/井在 r10 中等 (100μl 每井)。
- 用 100 nm phorbol 12-myristate 13 醋酸 (pma; 从10μm 库存) 治疗细胞 48–72 h, 在37°c 孵育, 5% co 2, 将 thp-1 细胞分化为 dthp-1.
请注意:建议在500μl 的 r10 介质中使用5μl 的 pma 库存 (10μm)。在此之前, 将冻干的1克小瓶溶解在10毫升的二甲基亚甲基亚硫醚 (dmso)、脂肪和-20°c 的库存中, 制备 10μm pma 库存。 - 或者 (建议) 结合步骤2.2 和 2.3, 以实现更好的同质化。在15毫升管中制备10毫升的 thp-1 细胞, 加入200μl 的 pma 库存 (10μm), 轻轻搅拌, 并立即将100μl 的粒细胞送入板材。如步骤2.3 所述, 对细胞进行培养。
3. 载脂蛋白 b 耗尽血清 (abds) 准备 (第2天或第3天)
- 要制备聚乙二醇 (peg) 溶液, 将甘氨酸稀释 10% pbs (无菌 h2o), 在ph 值7.4 时浓度为 200 mm。将 200 mm 甘氨酸的40毫升添加到10克 peg 8000 中, 以获得 peg 20% (w/v)。大力混合溶液, 使其均匀化。
- 在 1.5 ml 管中的每个血清/血浆样品上应用每10个份血清中20% 的聚乙二醇, 并将混合物放在冰上 25分钟 17分钟 (例如, 对于100μl 的血浆或血清, 加入40μl 的 20% peg 溶液).
- 在4°c 条件下, 以 13, 000 x g 离心聚乙二醇 b 沉淀15分钟。
- 丢弃沉淀物。将上清液转移到新管中。
请注意:我们建议在第3天 (新鲜) 准备 abds。如果无法做到这一点, 准备 abds 在第2天, 并保持在4°c 过夜。
4. nbd-胆固醇细胞负荷 (第2天)
- 丢弃 dmthp-1 的培养基, 用1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞两次。
- 将 5μm nbd 胆固醇 (每口井 100μl) 装入 r10 培养基中, 在 37°c 5% co 2 下孵育过夜。
5. 使用胆固醇受体孵化 (第3天)
- 丢弃培养基, 用 pbs 清洗细胞两次。
- 用 2-5% abds 或纯化脂质受体 (hdl、apa、apoe 等) 所需浓度在37°c 下用无色 rpmi 1640 培养基 (每口 100μl) 稀释4-6小时的细胞。
注: 包括一个负对照 (c-), 包括无色 rpmi 1640 介质 (无受体和阳性对照 (c +) (例如, 来自健康供体池或纯化的 hdl 的 abds)。请注意, 阳性对照尤其适用于分析患者样本 (疾病状况) 的情况 (补充图 1)。 - 准备细胞裂解溶液 1 (50 mm tris 缓冲液、150 mm 氯化钠、h2o) 的 200 ml 库存.将细胞裂解溶液1与纯乙醇比的 1:1 (v: v) 混合, 得到裂解溶液2。
6. 荧光信号捕获 (第3天)
-
培养基 nbd-胆固醇检测
- 从板上取出细胞介质, 并将其收集在一个新的白色96孔板与一个不透明的平底。
- 为了在介质样品中进行最佳荧光信号检测, 在每个介质样品中加入100μl 纯乙醇, 以获得96孔白板中的1:1 比。
- 将板材与经过处理的介质保持在一起, 以进一步测量发光计中 463/536 nm (激发/发射) 波长下的荧光强度 (fi)。
-
细胞内 nbd-胆固醇检测
- 用 pbs 清洗细胞两次。
- 为了获得细胞内的胆固醇, 用100μl 的裂解溶液2将细胞裂解, 并在室温 (rt) 下摇晃板25分钟。
- 为了在细胞裂解液样品中获得最佳荧光信号检测, 请捕获细胞裂解物在同一白色96孔板中的荧光强度, 该板具有清晰的平底 (在步骤2.2 中播种细胞的同一板)。
- 6.3 测量光表中的荧光强度 (fi), 同时将软件中的灵敏度参数调整为 50 (见材料表)。
7. 结果分析
- 将样本的胆固醇流出率作为公式计算的百分比表示:
- 从给定样品的 ce 中减去负对照的 ce (含有 nbd-胆固醇但使用无色 rpmi 1640 培养基孵育, 不含胆固醇受体的样品), 获得胆固醇流出 (ce) 的最终指标:
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Representative Results
胆固醇流出法的目的是在体外测定含有 hdl 颗粒的特定血清、血浆或上清液的胆固醇流出能力。该方法包括将标签胆固醇加载到标准巨噬细胞系的培养中, 并诱导与与细胞稀释为无 fbs 介质的测试样品接触。最后, 在培养基和细胞裂解液中测量 nbd 的荧光水平。为了优化测量, 从细胞到培养基的流出胆固醇与含有乙醇的溶剂的一个体积混合。在测量之前, 细胞中残留的 nbd 胆固醇会重新悬浮到含有乙醇或洗涤剂的溶剂中。最后, 确定了总唇部胆固醇的比例。为了建立这项技术, 使用了来自健康供体池的载脂蛋白 b-耗尽血清 (abds)。
研究了 mbd-胆固醇在培养基和乙醇中的最佳稀释条件。我们在几种溶剂环境中测试了游离 nbd 胆固醇的荧光行为, 包括乙醇和无色 rpmi 1640 的不同比率。在水溶液中稀释的 nbd-胆固醇的荧光强度 (fi) 显示出最低的 fi 值, 而在纯乙醇中的 nbd 胆固醇发出的 f之内数最高。这表明, 22-NBD-cholesterol-胆固醇分子的荧光发射在很大程度上依赖于它所包含的介质。因此, 当放置在含有乙醇的介质中时, 22-nbd-胆固醇的荧光信号要高得多。我们观察到, 在1:1 介质的比率: 乙醇, 荧光强度信号增加比例与胆固醇类似物的浓度在0.5–50μm 的范围内, 这表明在这种情况下, 探针的适当行为 (图 2).线性行为在1:1 情况 (媒介: 乙醇) 由以下等式代表: y = 20.88 x + 14.6.7 与 r2 = 0.9341。
这种方法的一个关键步骤是花在用胆固醇受体培育被加载的细胞上的时间, 这样胆固醇就能排出。为了确定所需的孵育时间, 在不同的时间点 (1 至 24小时;图 3)。0 ~ 6小时范围内的胆固醇流出呈线性进化 (p < 0.0001; y = 18.2 x + 127.3), 且与时间有关。在将 abds 添加到细胞后, 捕获的最大信号为6小时。6小时后, 胆固醇失去规律性的流出, 因此变异性增加后6小时与 abds 孵育 (图 3)。
我们还通过测量不同百分比的含 hdl 介质 (abds) 的 ce, 测试了应用于人类 abds 的饱和阈值和动态范围。高通量测定 (96 孔板) 中的 nbd 胆固醇流出在 1-7% abds 内线性进化, fi 与 abds 以与浓度相关的方式增加, 在 7% abds 时达到胆固醇流出能力的峰值 (图 4)。在浓度高于7% 的情况下, fi 与 abds 百分比呈反比关系下降。这可能是因为胆固醇从培养基中存在的 nbd-胆固醇负载 hdl 重新进入细胞。
测量胆固醇流出的标准方法使用无线电标记 (3h) 胆固醇16。为了评估我们的荧光基方法的性能, 我们执行和比较了荧光和无线电标记技术。我们发现, 传统的放射性技术和我们的 nbd-胆固醇方法是高度相关的 (pearson 的 r = 0.97; p < 0.97) 使用不同浓度的 abds (1-8%;图 5)。总的来说, 这表明我们的荧光方法可能是比放射性技术更安全的替代品。
最后, 我们将我们的方法与不同于 nbd 的荧光探针进行了比较。我们将我们的方法与一种商业高通量细胞检测试剂盒进行了比较, 该检测试剂盒旨在确定细胞中的胆固醇流出 (胆固醇排出试剂盒; 细胞基检测试剂盒)。本组开发的方法对 ce 值 (c3% abds) 在 5% ~ 15% 之间的升高敏感。然而, 按照制造商的指示执行的商业套件, 导致 ce 措施低于5% 沿 abds 检测的范围;因此, 当 abds 增加时, 生成的 ce 基本上不受影响 (图 6)。
图 1: 天然胆固醇 (a)、22-NBD-cholesterol-胆固醇 (b) 和 25-NBD-cholesterol-胆固醇 (c) 的分子结构.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 不同乙醇和无色 rpmi 1640 介质比例的 nbd-胆固醇荧光强度 (fi).在 1: 0, 3: 1, 1, 1, 1 乙醇: 水介质比率在0.5 和 50μm. fi 信号的水介质比率被稀释在 1: 0, 3, 1, 和0:1 乙醇: 由计压计检测到, 灵敏度参数设置为70在荧光软件中。用96孔白板测量了培养基和细胞裂解液的 fi 信号。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: th-1 衍生巨噬细胞中的时间进展 nbd 胆固醇外排.dmthp-1 富含 5μm nbd 胆固醇, 并与 5% abds 孵育。在不同时间点 (1-24小时) 的白色96孔板中测量了细胞介质。这些数值被表示为四井的均值±标准偏差。在荧光仪软件中, 用灵敏度参数设置为70的计时器检测到 fi 信号。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 不同浓度 abds 96 孔板 thp-1 衍生巨噬细胞中的 nbd 胆固醇外排.对 dmthp-1 细胞采用 5μm nbd 胆固醇处理, 用不同比例的 abds 孵育, 用乙醇裂解。在 1:1 (乙醇: 裂解溶液 1) 的荧光仪中, 用一个96孔的白色板测量了介质和细胞裂解液的 fi 信号。在所提供的水平上减去了阴性控制的措施 (abds 未经处理的介质)。这些数值被表示为三段井的均值±标准偏差。在荧光仪软件中, 用灵敏度参数设置为50的计时器检测到 fi 信号。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: th-1 衍生巨噬细胞中 nbd-胆固醇与 [3h]-胆固醇外排的相关性.遵循 dmthp-1 与相应的标签胆固醇6小时。使用 1-8 abds 测定胆固醇流出量。对于 nbd-胆固醇样本, 在1:1 乙醇: 裂解溶液1的荧光仪中, 使用白色96孔板检测荧光信号。在荧光仪软件中, 用灵敏度参数设置为50的计时器检测到 fi 信号。对于 [3h]-胆固醇样本, 按照 low 等人描述的协议, 使用100μl 的中等和细胞裂解物与闪烁鸡尾酒混合, 并在闪烁计数器中检测到红色的放射性信号.利用皮尔逊的相关系数确定了相关效率。从所提供的荧光和放射性水平中减去了阴性对照 (abds 未经处理的介质) 的测量值。这些数值被表示为三段井的均值±标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 高通量 nbd-胆固醇外排分析与商业化的荧光细胞检测试剂盒的比较.根据所述协议, 使用溶解溶剂乙醇 (50%) 或 tween 80 (1%) 对 abds 的胆固醇流出量进行了评估。基于荧光细胞的检测试剂盒是根据制造商在试剂盒中的协议进行评估的。这些数值被表示为三段井的均值±标准偏差。在荧光仪软件中, 灵敏度参数设置为50的计时器检测到 fi 信号请点击此处查看此图的较大版本.
图 7: 工作流程图.请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 艾滋病毒感染者血清样本的 nbd-胆固醇外排和标准阳性对照 (c++).显示了适用于一组艾滋病毒感染者的 nbd-胆固醇外排法的个体间变异。积极的内部控制 (c++) 代表了从8名健康患者的血清样本中流出的 nbd 胆固醇。误差条显示标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
荧光标记胆固醇是分析和研究天然胆固醇体外特性和代谢的一种很有前途的策略。它的主要优点是, 它可以被细胞吸收, 允许细胞内和膜内的分布研究, 并可以应用于胆固醇外排检测, 如在本协议中 (图 7)。一些被荧光标记的甾醇允许在体外跟踪胆固醇, 包括身体胆固醇, 丹西胆固醇, 脱氢雌酚,和 22-和25-nbd-低压12。特别是, 22-nbd-胆固醇是适当的研究不同细胞类型的胆固醇动态, 并作为无线电标记胆固醇18的替代品.在胆固醇流出法检测荧光信号方面没有一致的方法来评估荧光信号。song 等14收获培养基和细胞裂解物分别测量 fi;刘等人 14将培养基转移到其他板材, 并在培养板中直接测量细胞内荧光信号;张等人15 使用裂解缓冲液裂解细胞, 然后纯化荧光胆固醇, 将其稀释在纯乙醇中, 并检测荧光强度信号19。在我们的胆固醇外排分析中, 在培养基和细胞中使用相同的最终溶剂组合物可以有效地实现细胞介质的均质化和裂解液的测量。
本研究分析了 nbd-胆固醇的流出随着时间的推移, 并发现了一个时间依赖性的进展, 直到6小时与受体 abds 孵化, 类似于 song 等人 14和 liu 等人,和不同的是, 张等人使用了1小时的潜伏期与脂质受体19。我们发现, 经过6小时的孵育, 流出的胆固醇失去了线性;因此, 最重要的是不超过6小时。加入受体后, 我们的最佳胆固醇排出范围在3至6小时之间。我们建议与胆固醇受体孵育4小时的细胞。其他关键步骤是使用无色介质应用受体, 以避免背景, 播种半融合的细胞培养层, 并确保这些细胞培养层正确粘附在板上。需要注意的是, 在逆光显微镜下跟踪细胞的白色板的清晰底部是有用的。
大多数胆固醇流出试验是使用纯化脂质受体在胆固醇流出试验中进行的。本技术是为从人血清或血浆样品中获得胆固醇流出能力而开发的。我们使用血清中存在的内在胆固醇受体, 但去除含有载脂蛋白 b 的颗粒至关重要, 这将使细胞20、21内的胆固醇分子循环。纯化后的 apoai 和 hdl 也可用作受体。此外, 人类 thp-1 以外的细胞系已成功地用于荧光胆固醇外排分析, 如原始264.7 或 j774a1 巨噬细胞, 因此很可能在我们的方法15,22中工作。
这种方法的主要局限性在于, 结果取决于特定的细胞系, 即标准的细胞系, 但无细胞的方法将有利于作为生物标志物使用。此外, 用于标准化此方法的血清被冻结;胆固醇的 nbd 对胆固醇的生理影响小于无线电标记的部分, 其摄取量不同于内源性胆固醇;我们测试了一组过程的最终结果 (即涉及血清颗粒 、细胞系、胆固醇可能的酯化、胆固醇扩散或同时流出和流入过程)。然而, 作为一种优势, 基于荧光的技术已被证明具有很高的潜力, 可以替代传统的无线电标记技术, 并以荧光标记的分子取代 [3h]-胆固醇来监测胆固醇外排检测方法14。
胆固醇流出可能作为动脉粥样硬化的生物标志物 23, 因为它与未来的心血管事件 24,25相关。研究巨噬细胞在动脉粥样硬化中的作用的可能性是通过纯化的 hdl 及其组成;然而, hdl 的净化是一个艰巨而耗时的过程。此外, 在纯化过程中, 其他具有动脉粥样硬化作用的血清成分可能会被低估或丢失。为此, 选择 abds 作为脂质受体。通过用闪烁计数器代替板式读取器, 测量同一培养板 (在细胞裂解的情况下) 中的荧光信号, 并将协议缩短两天, 实现了高通量的规模和时间的减少。此外, 这种技术显示更高的敏感性时, 细胞接触不同浓度的血清比从一个商业化的工具包, 以评估胆固醇流出的措施。
最后, 介绍了一种与传统放射性方法相关的 nbd-胆固醇外排试验方法。我们确定了以 abds 的形式从人体样本 (血清或血浆) 中培养脂质受体的最佳时间。我们优化了该技术的细胞播种、分化、动态范围和饱和点。至于其主要新颖性, 我们优化了用于测量的溶剂组合, 以获得高强度和改进的线性范围。
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Disclosures
作者希望声明, 他们是专利申请的发明者 (epo; 18382336-1118; 2018年5月17日), 题为 "基于此方法确定胆固醇排出的方法"。
Acknowledgments
这项工作得到了西班牙马德里 salud carlos iii 研究所 fis (ps12/00866) 研究赠款的部分支持;fondo euroo para el desarrollo 区域 (fder);red de research ación en sida (ris)、isciii-retic (rd16/h500/0002) 和 cerca 方案/generalitat de catalunya。作者感谢生物研究研究所的逆转录病毒学和病毒免疫病理学实验室。我们感谢特塞兹帕、罗维拉和 c. hurtado 的协助, 并感谢知识和技术转让办公室的 s. cufí在保护发明方面的指导。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
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