Summary
Misurazione della capacità di efflusso di colesterolo in vitro di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente come biomarcatore per aterosclerosi. Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di efflusso di colesterolo-NBD fluorescente e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.
Abstract
Aterosclerosi conduce alla malattia cardiovascolare (CVD). Non è ancora chiaro se la concentrazione di colesterolo-HDL (cHDL) ha un ruolo causale nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, un fattore importante nelle prime fasi della formazione di placche di ateroma è capacità di efflusso di colesterolo di HDL (la capacità delle particelle di HDL di accettare di colesterolo dai macrofagi) al fine di evitare la formazione delle cellule della gomma piuma. Si tratta di un passaggio chiave nella evitando l'accumulo di colesterolo nell'endotelio e una parte del trasporto inverso del colesterolo (RCT) per eliminare il colesterolo attraverso il fegato. Capacità di efflusso di colesterolo di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente che può essere utilizzato come biomarcatore per aterosclerosi. Tradizionalmente, [3H]-colesterolo è stato utilizzato nelle analisi di efflusso di colesterolo. In questo studio, puntiamo a sviluppare una strategia più sicura e veloce utilizzando fluorescente etichettati-colesterolo (colesterolo-NBD) in un'analisi cellulare per rintracciare il processo di assorbimento e di efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. Infine, ottimizzare e standardizzare la metodica di efflusso di colesterolo-NBD e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.
Introduction
Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, le correnti principali cause di morte nel mondo sono la cardiopatia ischemica e ictus (contabilità per un totale di 15,2 milioni di morti)1. Entrambe sono malattie cardiovascolari (CVD) che possono essere precedute da aterosclerosi e la rottura delle placche di ateroma nei vasi sanguigni2,3.
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria parete vaso in cui i macrofagi, linfociti T, mastociti e cellule dendritiche infiltrano l'endotelio e si accumulano dal sangue, alla fine formano placche aterosclerotiche. Le placche aterosclerotiche presentano un lipide cristalli core e colesterolo, evidenziati da misure di ecografia B-mode ad alta risoluzione della carotide intima media spessore4,5. Nei macrofagi, efflusso di colesterolo verso particelle lipidiche accettore è effettuato con mezzi dei recettori ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro sottofamiglia G trifosfato di adenosina 1 (ABCG1) e il recettore scavenger SR-BI. Lo squilibrio del colesterolo afflusso e deflusso nei macrofagi è considerato un processo chiave nella aterosclerosi iniziazione6. Efflusso di colesterolo è considerata un passo fondamentale nell'eliminazione del colesterolo dal tessuto periferico al plasma e nel fegato in un processo chiamato trasporto inverso del colesterolo (RCT). Colesterolo viene trasferito dai macrofagi principalmente ad apolipoproteina A1 (ApoA1) presenti sulla superficie delle particelle della lipoproteina ad alta densità (HDL). HDL trasportano quindi il colesterolo al fegato per escrezione e reimpiego7,8,9.
Tradizionalmente, colesterolo radiomarcato trizio (3H) è stato utilizzato in efflusso di colesterolo10. Il segnale di emissione dei radioisotopi è altamente sensibile10; Tuttavia, il colesterolo radiomarcato presenta evidenti svantaggi quali protocolli lunghi, rischio di esposizione a radiazioni ionizzanti e la necessità speciali radioattività strutture e attrezzature garantire l'uso sicuro dell'emissione radioattiva. Al contrario, fluorescenza è stato integrato con successo nelle tecniche diagnostiche grazie alla sua semplicità nella rilevazione del segnale fluorescente, l'ampia varietà di fluorofori disponibili e relativi di sicurezza11. Diversi steroli fluorescenti-etichettati sono stati usati per studiare il metabolismo del colesterolo compreso dehydroergosterol (con fluorescenza intrinseca), colesterolo di dansile, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterolo e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-OL (NBD-colesterolo). In particolare, NBD-colesterolo presenta un assorbimento efficiente in cellule umane12. Due differenti NBD etichettati-colesterolo sono attualmente disponibili: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterolo etichettato con parte 22-NBD soddisfino al meglio gli studi di efflusso di colesterolo, mentre 25-NBD-colesterolo pricipalmente è utilizzato nella membrana cellulare dinamica ricerca13,14.
Le linee cellulari in genere utilizzate nelle analisi di efflusso di colesterolo in vitro sono cellule monocito-come ad esempio cellule THP-1 leucemia-derivate essere umano, murino 264,7 cellule15o J774.1. Tutte queste cellule possono essere differenziate in macrofagi in vitro facendo uso di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), ma THP-1-macrofagi derivati (dmTHP-1) migliori riflettono e imitano i macrofagi umani16.
Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di alto-rendimento fluorescente per determinare la capacità di efflusso di colesterolo di campioni di siero su dmTHP-1, utilizzando 22-NBD-colesterolo come alternativa a [3H]-colesterolo. Inoltre, mettiamo a confronto la tecnica fluorescente ottimizzata con l'analogico standard radioattivo.
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Protocol
Per questo studio, approvazione del comitato etico (Comitato Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcellona; numero di omologazione di HCB/2014/0756) e consenso informato scritto da tutti i soggetti sono stati ottenuti.
1. preparazione NBD-colesterolo
- Sciogliere il NBD-colesterolo (MW 494.63; Vedi Tabella materiali) in etanolo puro per ottenere il brodo (2 mM). Per un flaconcino da 10 mg, sciogliere il contenuto di intero flaconcino in un volume di 10,1 mL di etanolo per ottenere uno stock di 2 mM.
- Diluire il NBD-colesterolo da stock in RPMI 1640 completati con 10% fetale bovino del siero e 5% penicillina/streptomicina (R10 medium) per raggiungere una concentrazione finale di 5 μM (ad es., ottenere 10 mL di NBD-colesterolo alla concentrazione finale di 5 μM) di diluire 25 μL di brodo NBD-colesterolo (2 mM) nel mezzo di R10. Questo volume è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.
2. cellula di coltura e semina (2 ° giorno)
- Cellule THP-1 e di cultura in mezzo R10 a 37 ° C, 5% CO2. Regolare a 0,3 x 106 cellule/mL ogni 3 giorni.
- Seme le cellule in una piastra a 96 pozzetti bianca con un fondo piatto e chiaro a 0,2 x 106 cellule/pozzetto in mezzo R10 (100 μL per pozzetto).
- Trattare le cellule con 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA; da uno stock di 10 μM) per 48-72 h, incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per differenziare THP-1 cellule in dmTHP-1.
Nota: Si consiglia di utilizzare 5 μL di stock PMA (10 μM) in 500 μL di R10 medium. Prima di questo, preparare un 10 μM PMA brodo sciogliendo un flaconcino di liofilizzato 1 g in 10 mL di solfossido dimetilico (DMSO), aliquota e magazzino a-20 ° C. - In alternativa (suggerimento) combinano passi 2.2 e 2.3 per migliore omogeneizzazione. Preparare 10 mL di cellule THP-1 in una provetta da 15 mL, aggiungere 200 µ l di brodo PMA (10 μM), mescolare delicatamente e immediatamente seme 100 μL per pozzetto sulla piastra. Incubare le cellule come descritto al punto 2.3.
3. apolipoproteina B impoverito preparazione del siero (anime) (giorno 2 o 3)
- Per preparare una soluzione di glicole polietilenico (PEG), diluire glicina in PBS 10% (con sterile H2O) a una concentrazione di 200 mM a pH 7,4. Aggiungere 40 mL di glicina di 200 mM a 10 g di PEG 8000 per ottenere PEG 20% (p/v). Miscelare la soluzione vigorosamente per omogeneizzare.
- Applicare 4 parti del 20% PEG per 10 parti di siero/plasma su ogni campione di siero/plasma in una provetta da 1,5 mL e lasciare la miscela sul ghiaccio per 25 min17 (ad esempio, per aggiungere 100 μL del plasma o siero, 40 μL di 20% PEG soluzione).
- Centrifugare il precipitato di PEG-apolipoproteina B a 13.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Eliminare il precipitato. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
Nota: È consigliabile preparare le anime il giorno 3 (fresco). Se non è possibile, preparare le anime il giorno 2 e mantenerlo durante la notte a 4 ° C.
4. NBD-colesterolo cellulare carico (giorno 2)
- Scartare il terreno di coltura del dmTHP-1 e lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
- Caricare le celle con 5 μM NBD-colesterolo (100 μL per pozzetto) nel mezzo di R10 e incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.
5. incubazione con accettori di colesterolo (giorno 3)
- Eliminare il terreno e lavare le cellule due volte con PBS.
- Incubare le cellule con 2 – 5% anime o la concentrazione desiderata di accettore di lipide purificato (HDL, ApoA, ApoE, ecc.) diluiti in incolore medium RPMI 1640 (100 μL per pozzetto) per 4-6 h a 37 ° C.
Nota: Includere un controllo negativo (C-) costituito da incolore RPMI 1640 medium senza accettori e un controllo positivo (C +) (ad es., anime da un pool di donatori sani) o HDLs purificata. Nota che il controllo positivo si applica specialmente quando i campioni dei pazienti (condizioni di malattia) sono analizzati (complementare figura 1). - Preparare un brodo di 200 mL della soluzione di lisi cellulare 1 (tampone Tris 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). Mescolare il rapporto di soluzione 1 a 1:1 (v: v) di lisi delle cellule con etanolo puro per ottenere la soluzione di lisi 2.
6. acquisizione segnale fluorescente (giorno 3)
-
Rilevamento dei supporti NBD-colesterolo
- Rimuovere il mezzo di cella delle placche e raccoglierlo in una piastra a 96 pozzetti bianca nuova con un fondo piatto opaco.
- Per un rilevamento del segnale di fluorescenza ottimale nei campioni media, aggiungere 100 μL di etanolo puro al 100 μL di ciascun campione medio per ottenere un rapporto di 1:1 della piastra 96 pozzetti bianco.
- Tenere la piastra con i media trattati per ulteriore misura l'intensità della fluorescenza (FI) alla lunghezza d'onda di nanometro (eccitazione/emissione) 463⁄536 il luminometro.
-
Rilevamento di NBD-colesterolo intracellulare
- Lavare le cellule due volte con PBS.
- Per ottenere il colesterolo intracellulare, lisare le cellule di incubarle con 100 μL di soluzione di lisi 2 per pozzetto e scuotere la piastra a temperatura ambiente (TA) per 25 min.
- Per catturare un rilevamento del segnale di fluorescenza ottimale nei campioni lysate delle cellule, l'intensità della fluorescenza dei lisati cellulari nello stesso bianco piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente piatto (nello stesso piatto in cui le cellule sono state seminate nel passaggio 2.2).
- 6.3 misura l'intensità di fluorescenza (FI) sul luminometro regolando il parametro di sensibilità a 50 nel software (Vedi Tabella materiali).
7. Risultati analisi
- Esprime la quantità di efflusso di colesterolo di un campione come percentuale calcolata con la formula:
- Ottenere la misura finale di efflusso di colesterolo (CE) sottraendo il CE del controllo negativo (campione caricato con NBD-colesterolo ma incubate con medium RPMI 1640 incolore, senza accettori di colesterolo) dalla CE di un dato esempi:
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Representative Results
Il dosaggio di efflusso di colesterolo mira a determinare in vitro la capacità di efflusso di colesterolo di un dato del siero, il plasma o il supernatante contenente particelle di HDL. Il metodo consiste di caricamento etichettati-colesterolo in una cultura di una linea cellulare del macrofago standard e inducendo il contatto con il campione di prova diluito in media FBS-liberi con le cellule. Infine, i livelli fluorescenti dal NBD sono misurati nei media e lysate delle cellule. Per ottimizzare le misure, il effluxed di colesterolo dalle cellule ai media è mescolato con un volume di un solvente contenente etanolo. Il NBD-colesterolo restanti nelle cellule è risospeso in un solvente contenente etanolo o detergenti prima di misurazioni. Infine, il rapporto effluxed/totale etichettati-colesterolo è determinato. Per impostare la tecnica, è stato utilizzato dell'apolipoproteina B-vuotati del siero (anime) da un pool di donatori sani.
Le migliori condizioni di diluizione per il NBD-colesterolo medio sia etanolo sono state studiate. Abbiamo testato il comportamento fluorescente di NBD-colesterolo libero in diversi ambienti di solventi, tra cui diversi rapporti di etanolo e incolore RPMI 1640. L'intensità di fluorescenza (FI) di NBD-colesterolo diluito in soluzione acquosa ha mostrato i valori più bassi di FI, mentre NBD-colesterolo all'interno di etanolo puro emesso il FI più alto. Ciò suggerisce che l'emissione di fluorescenza della molecola 22-NBD-colesterolo dipende fortemente dal mezzo in cui è contenuto. Di conseguenza, il segnale di fluorescenza del 22-NBD-colesterolo è significativamente più alto quando sono immessi in un etanolo contenente media. Abbiamo osservato che un rapporto di 1:1 media: etanolo, il segnale di intensità di fluorescenza aumenta proporzionalmente con la concentrazione del colesterolo analogico nella gamma di 0.5-50 μM, suggerendo un comportamento appropriato della sonda in questo caso (Figura 2 ). Il comportamento lineare nella condizione di 1:1 (media: etanolo) è rappresentato dall'equazione seguente: y = 20,88 x + 146,7 con R2 = 0.9341.
Un passo fondamentale in questo metodo è il tempo trascorso incubando le cellule caricate con accettori di colesterolo: il colesterolo è in grado di efflusso. Al fine di determinare il tempo di incubazione richiesto, media delle cellule è stato raccolto in diversi punti temporali (1-24 h; Figura 3). L'efflusso di colesterolo nella gamma di 0-6 h si è evoluta in modo lineare (p < 0,0001; y = 18,2 x + 127,3) in un modo dipendente dal tempo. Il massimo segnale catturato era a 6 h dopo anime è aggiunto alle cellule. Dopo 6 h, il colesterolo perso regolarità nel deflusso, così la variabilità è aumentato dopo 6 h di incubazione con l'anime (Figura 3).
Abbiamo inoltre verificato la soglia di saturazione e gamma dinamica applicati agli anime umane misurando CE alle diverse percentuali di supporti contenenti HDL (anime). L'efflusso di colesterolo-NBD nel dosaggio elevato throughput (piastra a 96 pozzetti) si è evoluta in modo lineare entro 1 – 7% anime, dove FI aumentato in un modo dipendente dalla concentrazione con l'anime, raggiungendo l'apice della capacità di efflusso di colesterolo alle anime 7% (Figura 4). A concentrazioni superiori al 7%, FI diminuito in una relazione inversa con la percentuale di anime. Questo potrebbe essersi verificato perché il colesterolo è stato dover reimmettere necessari che caricato le cellule da NBD-colesterolo HDL presente nei media.
Il metodo standard per misurare l'efflusso di colesterolo utilizza radio-marcato (3H) colesterolo16. Per valutare le prestazioni del nostro metodo fluorescenza-basata, abbiamo eseguito e confrontato tecniche fluorescenti e radio-marcato. Abbiamo trovato che la tecnica tradizionale di radioattività e il nostro metodo NBD-colesterolo erano altamente correlati (r di Pearson = 0,97; p < 0,001) utilizzando diverse concentrazioni di anime (1 – 8%; Figura 5). Nel complesso, questo suggerisce che il nostro metodo fluorescente può essere un sostituto più sicuro rispetto alla tecnica radioattivo.
Infine, abbiamo confrontato il nostro metodo di sonda fluorescente diverso da NBD. Abbiamo confrontato il nostro metodo per un kit commerciale ad alta velocità basati su cellule test voluto a determinare l'efflusso di colesterolo nelle cellule (kit di dosaggio efflusso di colesterolo;)) basati su cellule. Il metodo sviluppato nel nostro gruppo era sensibile ad un aumento della concentrazione di accettore (% anime) all'interno dei valori di CE tra 5 e 15%. Tuttavia, il kit commerciale, eseguito seguendo le istruzioni del produttore, ha provocato misure CE sotto il 5% lungo la fascia di anime analizzati; così, la CE risultante era essenzialmente inalterato quando anime è stato aumentato (Figura 6).
Figura 1: strutture molecolari di naturale del colesterolo (A), 22-NBD-colesterolo (B) e 25-NBD-colesterolo (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'intensità di fluorescenza di NBD-colesterolo (FI) con differenti rapporti di etanolo e incolore medium RPMI 1640. NBD-colesterolo è stato diluito in 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 e 0:1 etanolo: rapporti di media acquosi alle concentrazioni di colesterolo-NBD tra 0,5 e 50 µM. FI segnale è stato rilevato dal luminometro con il parametro di sensibilità impostato a 70 nel software fluorimetro. Il segnale FI di media e lysate delle cellule è stato misurato utilizzando bianche piastre da 96 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: deflusso del tempo-progressione NBD-colesterolo in macrofagi derivati THP-1. DmTHP-1 sono stati caricati con 5 µM NBD-colesterolo e incubati con anime di 5%. Media delle cellule sono stati misurati in una piastra a 96 pozzetti bianca timepoints diversi (1-24 h). I valori sono presentati come media ± deviazione standard di pozzi quadruplicate. Con il parametro di sensibilità impostato a 70 nel software fluorimetro FI segnale è stato rilevato il luminometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: deflusso NBD-colesterolo in macrofagi THP-1-derivati in piastra a 96 pozzetti con differenti concentrazioni di anime. Le cellule dmTHP-1 sono state trattate con 5 µM NBD-colesterolo, incubate con differenti percentuali di anime e lisate con etanolo. Il segnale FI di media e lysate delle cellule è stato misurato utilizzando una piastra a 96 pozzetti bianca nel fluorimetro a 1:1 (soluzione di etanolo: Lisi 1). Le misure di controllo negativo (anime media non trattati) sono stati sottratti ai livelli previsti. I valori sono presentati come media ± deviazione standard di pozzi triplici. Con il parametro di sensibilità impostato a 50 nel software fluorimetro FI segnale è stato rilevato il luminometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Correlazione di NBD-colesterolo e [3H]-efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. DmTHP-1 seguente con il corrispondente etichettati-colesterolo per 6 h. L'efflusso di colesterolo è stato misurato usando anime 1-8%. Per i campioni NBD-colesterolo, il segnale fluorescente è stato rilevato usando bianche piastre da 96 pozzetti nel fluorimetro alle soluzione di 1:1. etanolo: Lisi 1. Con il parametro di sensibilità impostato a 50 nel software fluorimetro FI segnale è stato rilevato il luminometro. Per [3H]-campioni di colesterolo, il segnale radioattivo è stato rilevato usando 100 µ l di terreno e cella lysato mescolato con la scintillazione cocktail e rosso del contatore di scintillazione, seguendo il protocollo descritto da basso et al.17. Efficienza di correlazione è stata determinata utilizzando il coefficiente di correlazione r di Pearson. Le misure di controllo negativo (anime media non trattati) erano sottratti da entrambe la fluorescenza e livelli di radioattività forniti. I valori sono presentati come media ± deviazione standard di pozzi triplici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: confronto tra analisi di efflusso NBD-colesterolo alto-rendimento e un kit di analisi basati su cellule fluorescenti commercializzato. Efflusso di colesterolo dalle anime è stata valutata seguendo il protocollo descritto, usando come Lisi solvente etanolo (50%) o Tween 80 (1%). Il kit di analisi basati su cellule fluorescenti è stato valutato secondo il protocollo del produttore nel kit. I valori sono presentati come media ± deviazione standard di pozzi triplici. Segnale FI è stato rilevato dal luminometro con il parametro di sensibilità impostato a 50 nel software fluorimetro Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: diagramma di flusso di lavoro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: efflusso di colesterolo-NBD di campioni di siero dei pazienti HIV-infettati e un controllo positivo standard (C +). È indicata la variazione interindividuale del NBD-colesterolo efflusso metodo applicato a un insieme di pazienti HIV-infettati. Un controllo positivo interno (C +) rappresenta il deflusso de NBD-colesterolo da un pool di campioni di sieri di 8 pazienti sani. Barre di errore indicano deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fluorescenti-etichettati colesterolo è una strategia promettente per analizzare e studiare le proprietà e il metabolismo del colesterolo naturale in vitro. I suoi principali vantaggi sono che può essere preso dalle cellule, permette per intracellulare e gli studi di distribuzione di membrana e può essere applicato a dosaggi efflusso di colesterolo come in questo protocollo (Figura 7). Alcuni steroli fluorescenti-etichettati consentono colesterolo monitoraggio in vitro BODIPY-colesterolo, colesterolo-dansile, dehydroegrosterol e 22 e 25-NBD-colesterolo12. In particolare, 22-NBD-colesterolo è appropriato per lo studio delle dinamiche di colesterolo con diversi tipi di cellule e come sostituto di radio-marcato colesterolo18. Non esiste un metodo di consenso per valutare il segnale fluorescente in un'analisi di efflusso di colesterolo. Canzone et al.14 raccolto medio e cella lisati per misurare FI separatamente; Liu et al.14 trasferito il mezzo per altri piatti, e il segnale fluorescente intracellulare è stato misurato direttamente nella piastra di coltura; e Zhang et al.15 usato un tampone di lisi per lisare le cellule, seguite da purificazione del colesterolo fluorescente per diluirlo in etanolo puro e rilevare la fluorescenza intensità segnale19. Nella nostra analisi di efflusso di colesterolo, utilizzare la stessa composizione finale solvente nei media e cellule consentite l'omogeneizzazione dei mezzi di comunicazione cellulare e misurazioni di lisato in modo efficiente.
Lo studio presente ha profilato l'efflusso di colesterolo-NBD nel tempo e trovato una progressione temporale fino a 6 h di incubazione con i ricettore anime, simile alla canzone et al.14 e Liu et al.14 e a differenza di Zhang et al, che ha usato un periodo di incubazione di 1 h con i lipidi accettori19. Abbiamo trovato che dopo 6 h di incubazione, il colesterolo effluxed perso linearità; Pertanto, è fondamentale non deve superare 6 h. La nostra gamma ottima di efflusso di colesterolo era tra 3-6 h dopo l'aggiunta del accettori. Suggeriamo che incubando le cellule per 4 h con i ricettori del colesterolo. Ulteriori passaggi critici sono uso dei media incolori per applicare i ricettori per evitare sfondo, semina un strato di coltura delle cellule semi-confluenti e garantendo una corretta aderenza di quelli alla piastra. Dovrebbe essere notato che il fondo chiaro della piastra bianca è utile seguire le cellule al microscopio luce inversa.
Maggior parte dei saggi di efflusso di colesterolo sono effettuati utilizzando accettori di lipide purificato nel test di efflusso di colesterolo. La tecnica attuale è stata sviluppata per ottenere la capacità di efflusso di colesterolo da campioni di plasma o siero umano. Usiamo gli accettori intrinseci colesterolo presente nel siero, ma è fondamentale per rimuovere le particelle contenenti apolipoproteina B, che sarebbe ricircolare le molecole di colesterolo all'interno di cellule20,21. Come modifiche, purificata ApoAI e HDL utilizzabile anche come accettori. Inoltre, linee cellulari diverso da umane THP-1 sono state utilizzate con successo nelle analisi di efflusso di colesterolo fluorescente, quali i macrofagi Raw 264.7 o J774A1 e così sarebbero probabile lavoro nel nostro metodo15,22.
Le principali limitazioni di questo metodo è che risultati dipendono la linea cellulare specifico, una linea cellulare standard ma senza cellula metodo sarebbe vantaggioso utilizzare come biomarcatore. Inoltre, i sieri utilizzati per standardizzare questo metodo è stato congelato; la frazione NBD sul colesterolo è meno fisiologica di quella radio-marcato e relativo assorbimento differisce dal colesterolo endogeno; e abbiamo testato il risultato finale di un insieme di processi (cioè che coinvolge particelle di siero, , una linea cellulare, possibile esterificazione del colesterolo, la possibile diffusione di colesterolo o processi simultanei di deflusso e afflusso). Tuttavia, come un vantaggio, tecniche basate sulla fluorescenza hanno dimostrato di avere elevato potenziale come sostituti per le tradizionali tecniche di radio-marcato e la sostituzione di [3H]-colesterolo, da una molecola fluorescente-etichettati per monitorare efflusso di colesterolo dosaggi14.
Efflusso di colesterolo può agire come biomarcatore di aterosclerosi23, come correla con eventi cardiovascolari futuri24,25. La possibilità di studiare il ruolo dei macrofagi nell'aterosclerosi è attraverso HDLs purificata e la sua composizione; Tuttavia, HDLs purificazione è un processo arduo e che richiede tempo. Inoltre, durante la purificazione, altri componenti del siero con effetto atherogenic possono essere sottovalutati o perso. Per questo motivo, anime è stato scelto come accettore del lipido. La scala di alto-rendimento e riduzione del tempo sono stati resi possibili sostituendo il contatore di scintillazione per un lettore di piastra, misurando il segnale fluorescente nella piastra di coltura stesso (nel caso il lysate delle cellule), e ridurre il protocollo entro due giorni. Inoltre, questa tecnica dimostra maggiore sensibilità quando le cellule sono esposte a diverse concentrazioni di siero rispetto alle misure ottenute da un kit commercializzato per valutare l'efflusso di colesterolo.
In conclusione, un saggio di efflusso NBD-colesterolo che correla con il tradizionale metodo radioattivo è stato descritto. Abbiamo determinato il momento ottimale per incubare accettori del lipido dai campioni umani (siero o plasma) in forma di anime. Abbiamo ottimizzato la semina delle cellule, differenziazione, gamma dinamica e punto di saturazione della tecnica. Per quanto riguarda la novità principale, abbiamo ottimizzato una combinazione solvente utilizzata nelle misurazioni per ottenere alte intensità e una migliore gamma lineare.
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Disclosures
Gli autori desiderano dichiarare che essi sono gli inventori della domanda di brevetto (EPO; 18382337.6-1118; 17 maggio 2018) dal titolo "Metodo per la determinazione di efflusso di colesterolo" basato su questo metodo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di studio la ricerca FIS (PS12/00866) dall'Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; El di para di Fondo Europeo sviluppo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) e CERCA programma / Generalitat de Catalunya. Gli autori ringraziano la Retrovirology e virale Immunopathology laboratorio di progetto l'Institut Investigacions agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Ringraziamo Escribà T., c. Rovira e C. Hurtado per la loro assistenza e S. Cufí dalla conoscenza e dall'ufficio di trasferimento tecnologico per la sua guida nel proteggere l'invenzione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
