Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/59321
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2,4, 2,4, 1,2
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

Summary

يسمح هذا البروتوكول بالتحويل السريع والفعال للخلايا الجذعية مستحث المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية ذات الهوية الشوكية أو الجمجمة ، عن طريق التعبير البعيد عن عوامل النسخ من ناقلات الحمل المحبله.

Abstract

ونحن نقدم هنا وصفا لطريقه للحصول علي الخلايا العصبية الحركية العمود الفقري والجمجمة الوظيفية من المستحث البشرية المستحثة (iPSCs). يتم الحصول علي التحويل المباشر إلى الخلايا العصبية الحركية عن طريق التعبير عن الوحدات البديلة لعوامل النسخ ، وهي Ngn2 ، Isl1 و Lhx3 (NIL) أو Ngn2 ، Isl1 و Phox2a (خطه البرامج الخاصة). وتحدد هذه الخطة ، علي التوالي ، هويه الخلايا العصبية للمحركات الشوكية والجمجمة. يبدا البروتوكول الخاص بنا بإنشاء خطوط iPSC المعدلة التي يتم فيها دمج الصفر أو النعناع البشري بشكل ثابت في الجينوم عن طريق ناقل ترانسباك. ثم يتم الحث علي التعبير عن الجينات عبر الدوكسيسيكلين ويؤدي ، في 5 أيام ، إلى تحويل iPSCs إلى المبتدئين MN. النضج اللاحق ، لمده 7 أيام ، يؤدي إلى السكان متجانسة من MNs الشوكي أو القحفيه. طريقتنا يحمل العديد من المزايا علي البروتوكولات السابقة: انها سريعة للغاية ومبسطه. انها لا تتطلب العدوى الفيروسية أو مزيد من العزلة MN; فانه يسمح توليد مختلف السكان الفرعيين MN (العمود الفقري والجمجمة) مع درجه ملحوظة من النضج ، كما يتضح من القدرة علي إطلاق النار القطارات من إمكانات العمل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الحصول علي عدد كبير من الخلايا العصبية الحركية دون تنقيه من السكان المختلطة. ويمكن استخدام الخلايا العصبية المستمدة من iPSC العمود الفقري والجمجمة الحركية في النمذجة في المختبر من التصلب الجانبي الضموري والامراض العصبية الأخرى من الخلايا العصبية الحركية. وقد تمثل الخلايا العصبية الحركية المتجانسة موردا هاما لفحوصات المخدرات الخاصة بنوع الخلية.

Introduction

العصبية الحركية (MN) انحطاط يلعب دورا مسببا في الامراض البشرية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وضمور العضلات الشوكي (SMA). ويعد إنشاء نظم نموذجيه للخلايا المختبرية المناسبة تلخص تعقيدات المليون البشري خطوه هامه نحو وضع نهج علاجيه جديده. الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (ipscs) ، والتي هبت مع خصائص تمايز التعددية الرائعة ، قد تم اشتقاقها الآن من عدد من المرضي المصابين بامراض الخلايا العصبية الحركية1،2. وقد تم توليد خطوط iPSC اضافيه تحمل طفرات المسببة للامراض المرتبطة بامراض MN عن طريق تحرير الجينات ، بدءا من السيطرة "صحية" مستحث الخلايا الجذعية3. وتمثل هذه الخطوط أدوات مفيده لنمذجة الامراض في المختبر وفحص المخدرات ، شريطه توافر الأساليب المناسبة لتمايز iPSC في MNs. والأساس المنطقي وراء تطوير هذه الطريقة هو تزويد المجتمع العلمي المهتم بامراض MN ببروتوكول تفاضلي سريع وفعال يؤدي إلى MNs وظيفية ناضجه. الميزة الاولي لهذا الأسلوب هو الإطار الزمني للتنفيذ. نقطه أخرى ذات صله من قوه ياتي من القضاء علي اي خطوه تنقيه. وأخيرا ، يمكن استخدام البروتوكول لتوليد اثنين من السكان متميزة من الخلايا العصبية الحركية.

امكانيه توليد أنواع فرعيه مختلفه من MNs هي ذات الصلة بشكل خاص لنمذجة امراض MN. ليس كل الأنواع الفرعية MN عرضه بنفس القدر في ALS و SMA وظهور الاعراض في وحدات المحركات المختلفة يؤثر بشكل كبير علي التكهن. في ALS, بداية العمود الفقري مع اعراض بدءا من الأطراف العلوية والسفلية يؤدي إلى الموت في حوالي 3-5 سنوات4. علي العكس من ذلك ، بداية بولبار ، بدءا من انحطاط MNs القحفيه ، لديه اسوا تكهن. وعلاوة علي ذلك ، فان النسبة المئوية لبداية بولبار اعلي بكثير في المرضي الذين يعانون من طفرات في البروتينات الريبية النيبالية ملزمه TDP-43 من الافراد الذين يعانون من طفرات SOD15. يعتمد تقريبا مجموع بروتوكولات التمايز MN البديلة علي نشاط حمض الريتينويك (RA) ، الذي يضفي علي الحرف الفقري التفريق بين ipscs6،7،8. وهذا يحد من امكانيه دراسة العوامل الجوهرية ، التي يمكن ان تكون وقائية في الأنواع الفرعية المحددة من الملايين9،10.

وتمشيا مع العمل السابق في الخلايا الجذعية الجنينية الفئران11, وقد أظهرنا مؤخرا ان في الإنسان ipscs التعبير عن Ngn2, Isl1 و LHX3 (NIL) يدفع هويه العمود الفقري MN, في حين ان Ngn2 و Isl1 زائد Phox2a (الخطة الخاصة) تحديد الجمجمة MNs12. التالي قمنا بتطوير بروتوكول فعال ، مما يؤدي إلى إنتاج MNs البشرية التي وهبها خصائص وظيفية في تحول 12 يوما. والغرض من هذه الطريقة هو الحصول ، في اطار زمني قصير ودون الحاجة إلى تنقيه (علي سبيل المثال ، من قبل FACS) ، والسكان الخلايا المخصبة للغاية ل MNs مع العمود الفقري أو الجمجمة الهوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صيانة iPSCs البشرية

  1. اعداد لوحات مصفوفة مغلفه
    1. ذوبان واحد 5 مل قارورة من مصفوفة (انظر جدول المواد) في 4 °c بين عشيه وضحيها. المخزونات الاصليه مصفوفة تاتي في تركيزات الأسهم المختلفة ويتم اجراء الارصفه وفقا لعامل التخفيف المشار اليه في ورقه البيانات ، محدده للكثير الفردية. من المهم الحفاظ علي القارورة والأنابيب الباردة الجليد لمنع البيع المبكر للمصفوفة. الاستغناء عن مصفوفة في الارصفه في البرد قبل المبردة علي الجليد. تجميد الارصفه غير المستخدمة عند-20 درجه مئوية.
    2. ضعي واحده علي الثلج لمده 2 ساعة لأذابه الجليد.
    3. تمييع قسامه من مصفوفة مع 20 مل من dmem الباردة/F12 في أنبوب مخروطي 50 ml.
    4. تخلط جيدا والاستغناء 1 مل من مصفوفة المخفف في اطباق 35 مم (تعادل المبالغ لكل مساحة السطح من الاطباق الأخرى).
    5. حافظ علي الاطباق التي تحتوي علي مصفوفة مخففه لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة للسماح بالطلاء.
      ملاحظه: الاطباق ، مختومه مع parafilm ، يمكن تخزينها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.
  2. اعداد حل الأسهم (20 مل) و 1x العمل القسامات من كاشف التفكك الخلية لطيف (انظر جدول المواد).
    1. تذوب مسحوق إلى 10 ملغ/مل في الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/mg2 + مجانا).
    2. تصفيه تعقيم من خلال غشاء فلتر 0.22 μm.
    3. اعداد 20 الارصفه (1 مل لكل منهما) وتخزين في-20 درجه مئوية.
    4. قبل الاستخدام ، تمييع قسامه واحده في الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/mg2 + مجانا) إلى 1 ملغ/مل (1x العمل قسامه).
      ملاحظه: يمكن تخزين 1x العمل القسامات في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.
  3. المرور iPSCs الإنسان.
    1. قبل البدء: إذا تم تخزينها في 4 درجه مئوية ، قبل الحارة مصفوفة المغلفة لوحات في الحاضنة في 37 درجه مئوية لمده 20-30 دقيقه. قبل الحارة في درجه حرارة الغرفة مقدار iPSC الإنسان المتوسطة (انظر جدول المواد) اللازمة. قبل الحارة DMEM/F12.
    2. شفط الثقافة المتوسطة.
    3. شطف iPSCs مع تلفزيوني (Ca2 +/Mg2 + مجانا).
    4. أضافه 1x حل التفكك لطيف (0.5 mL لطبق 35 مم). احتضان في 37 درجه مئوية حتى حواف المستعمرات تبدا في فصل من لوحه ، وعاده ما 3-5 دقيقه.
    5. يستنشق حل التفكك لطيف ، والحرص علي عدم فصل مستعمرات iPSC.
    6. غسل الخلايا مع DMEM/F12 (2 مل لطبق 35 مم) ويستنشق الحرص علي عدم فصل الخلايا. كرر هذه الخطوة مره أخرى.
    7. أضافه الإنسان iPSC المتوسطة (1 مل لصحن 35 mm).
    8. فصل بلطف المستعمرات قباله مع رافع الخلية ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    9. كسر كتل الخلايا بلطف عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 3-4 مرات.
    10. يستنشق ماده طافي من لوحه (ق) مصفوفة المغلفة.
    11. بذره الخلايا في المناسبة ثقافة حجم من [أبسك] انسانيه متوسطه. يمكن ان تختلف نسبه تقسيم من خط إلى خط وحوالي 1:4-1:8. تغيير المتوسطة يوميا.

2-توليد خطوط iPSC المحفزة لنيل الصفر والنعناع الخاص

  1. الخلية الناقلة.
    1. شطف الخلايا مع الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/Mg2 + مجانا).
    2. أضافه كاشف التفكك الخلية (انظر جدول المواد) (0.35 mL لطبق 35 مم) واحتضان في 37 درجه مئوية حتى يتم فصل الخلايا المفردة (5-10 دقيقه).
    3. بلطف إكمال فصل الخلايا عن طريق التعبئة صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 3-4 مرات.
    4. جمع في أنبوب 15 مل وأضافه تلفزيوني (Ca2 +/Mg2 + مجانا) إلى 10 مل. عد الخلايا.
    5. بيليه 106 خلايا وأعاده التعليق في 100 ميكرولتر من R العازلة (المدرجة في الخلية الكهربائية عده ، انظر جدول المواد).
    6. أضافه الحمض النووي البلازميد للتنميل: 4.5 ميكروغرام من ناقلات ترانسسيابل (epb-bsd-tt-النيل أو epb-bsd-tt-الخطة الخاصة12) و 0.5 ميكروغرام من الحشرات ترانسميد البلازما13.
    7. Transfect مع نظام الكهرباء الخلية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكما هو موضح سابقا3 مع المعلمات التالية: 1,200 V الجهد ، 30 مللي عرض ، 1 نبض. بذره الخلايا في الإنسان iPSC المتوسطة تستكمل مع 10 μM Y-27632 (المانع روك ، انظر جدول المواد) في طبق المغلفة مصفوفة 6 مم.
  2. اختيار مع المضادات الحيوية.
    1. بعد يومين من التحويل ، أضف 5 ميكروغرام/مل من بلاستيديبين إلى الوسط الثقافي.
    2. معظم الخلايا غير المتحولة سوف يموت في غضون 48 h من الاختيار بلتكيدبين. الحفاظ علي الخلايا في بلاستيديبين لمده لا تقل عن 7-10 يوما لمكافحه-تحديد الخلايا التي لم تدمج الجينات المتحولة في الجينوم.
    3. الحفاظ علي الخلايا المقسمة بشكل ثابت كمجموعه سكانية مختلطة ، تتكون من خلايا ذات عدد مختلف من الجينات المتحولة ومواقع التكامل المختلفة ، أو تعزل المستنسخات المفردة.
    4. اعداد طبق إضافي للتحقق من التعبير الفعال عن الجينات ، علي 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين التعريفي ، بواسطة RT-PCR مع الإشعال الخاصة transgenes لNgn2 (إلى الامام: TATGCACCTCACCTCCCCATAG ؛ العكس: GAAGGGAGGAGGGCTACT) ، كما هو موضح سابقا12.
    5. في هذه المرحلة ، تجميد المخزون من الرواية الصفرية وخطوط النعناع الكتروني في تجميد المتوسطة لل Ipsc البشرية (انظر جدول المواد).

3. الحركية العصبية التمايز

  1. انفصال الخلايا مع كاشف تفكك الخلية كما هو موضح (الخطوات 2-1-1.-2-1-3.). جمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 15 مل وتمييع مع 5 مجلدات من DMEM/F12. بيليه الخلايا وأعاده التعليق في الإنسان iPSC المتوسطة تستكمل مع مثبطات الصخور 10 μM. عد الخلايا والبذور علي الاطباق المغلفة مصفوفة في كثافة 62,500 الخلايا/سم2.
  2. في اليوم التالي, استبدال المتوسطة مع DMEM/F12, تكمله 1x مستقره L-الجلوتامين التناظرية, 1x الأحماض الامينيه غير الاساسيه (NEAA) الملحق ثقافة الخلية و 0.5 x البنسلين/ستربتومايسين, وتحتوي علي 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين. هذا اعتبرت بما ان يوم 0 من تمييز. في اليوم 1 ، وتحديث المتوسطة ودوكسيسيكلين.
  3. في اليوم 2 ، تغيير المتوسطة إلى Neurobasal/B27 المتوسطة (المتوسطة العصبية تستكمل مع 1x B27 ، 1x مستقره L-الجلوتامين التناظرية ، 1x NEAA و 0.5 x البنسلين/ستربتومايسين) ، التي تحتوي علي 5 μM DAPT ، 4 μM SU5402 و 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين (انظر جدول المواد ). تحديث المتوسطة ودوكسيسيكلين كل يوم حتى اليوم 5.
  4. اليوم الخامس: تفكك الخلايا مع كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد).
    1. شطف الخلايا مع الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/Mg2 + مجانا).
    2. أضافه كاشف التفكك الخلية (0.35 mL لطبق 35 مم) واحتضان في 37 درجه مئوية حتى يفصل الخلية بأكملها أحاديه الطبقة من الطبق. لاحظ انه لن يتم فصل الخلايا المفردة اثناء الحضانة.
    3. أضافه 1 مل من DMEM/F12 وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
    4. بلطف إكمال فصل الخلايا عن طريق التعبئة صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 10-15 مرات.
    5. أضف 4 مل من DMEM/F12 وعد الخلايا.
    6. في هذه المرحلة ، وتجميد الحركية العصبية المولدات في خليه تجميد المتوسطة (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    7. بيليه الخلايا وأعاده التعليق في المتوسطة العصبية (Neurobasal/B27 المتوسطة تستكمل مع 20 نانوغرام/مل BDNF ، 10 نانوغرام/مل GDNF و 200 ng/mL حمض L-الاسكوربيك ، انظر جدول الموادs) تستكمل مع مثبطات الصخور 10 μM.
    8. بذره الخلايا علي [بولي-اورنيثين]/laminin-أو بدلا من ذلك علي [ماتريكس-كتد] دعامات في الكثافة من 100,000 خلايا/سم2. استخدام μ الشرائح البلاستيكية يدعم مع كوفيرسليب البوليمر (انظر جدول المواد) للتحليل المناعي.
  5. في اليوم 6 ، تغيير المتوسطة مع الخلايا العصبية الطازجة المتوسطة خاليه من المثبط روك. في الأيام التالية ، وتحديث نصف المتوسطة كل 3 أيام. ثقافة متوسطه ينبغي كنت غيرت بعناية جدا [أين وردر تو] منعت مفرزه من السطح.

4. تحليل المناعة

  1. تثبيت الخلية. شطف الخلايا مع تلفزيوني (مع Ca2 +/Mg2 +) واحتضان لمده 15 دقيقه في 4 ٪ بارافورمالدهيد في الخدمات التلفزيونية العامة (مع Ca2 +/Mg2 +) في درجه حرارة الغرفة.
    تحذير: بارافورمالدهيد هو السامة ويشتبه في ان يسبب السرطان. تجنب ملامسه الجلد والعينين والتعامل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  2. بيركابايز مع تلفزيوني (مع Ca2 +/Mg2 +) التي تحتوي علي 0.1 ٪ تريتون X-100 لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
  3. احتضان لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في حل حظر الأجسام المضادة (ABS: 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الخدمات التلفزيونية مع Ca2 +/Mg2 +).
  4. احتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الاوليه في ABS: المضادة لTUJ1 (1:1000 ، الأرنب) والمضادة لOct4 (1:200 ؛ الماوس) أو المضادة للدردشة (المضادة للالكولين اسيتيل ؛ 1:150 ؛ الماعز). انظر جدول المواد.
  5. احتضان لمده 45 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع المناسبة الحمار الجسم المضادات الثانوية الزوج في ABS: مكافحه الماوس اليكسا فلور 647 (1:250) ، المضادة لأرنب اليكسا فلور 594 (1:250) ومكافحه الماعز اليكسا فلور 488 (1:250). انظر جدول المواد.
  6. احتضان في 0.4 ميكروغرام/مل DAPI لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة لتسميه نوى.
  7. جبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة (انظر جدول المواد) للتصوير في المجهر مضان.

5. توصيف وظيفية عن طريق التصحيح-تسجيلات المشبك

  1. اعداد الحل الخارجي معايرتها (NES) علي النحو التالي: 140 mM كلوريد الصوديوم ، 2.8 mM KCl ، 2 مم CaCl2، 2 مم mgcl2، 10 ملم hepes ، و 10 ملم الجلوكوز. تعيين الاسموليه بين 290-300 mω. ضبط درجه الحموضة إلى 7.3 باستخدام 1N NaOH وتخزين الحل في 4 ° c.
  2. اعداد الحل الداخلي: 140 mM K-غلوكونات ، 2 مم كلوريد الصوديوم ، 5 مم بابتا ، 2 مم MgCl2، 10 مم hepes ، 2 مم MG-ATP ، 0.3 mm NA-gtp. ضبط درجه الحموضة إلى 7.3 مع 1m كوة وتحقق من ان يتم تعيين الاسموليه في حوالي 290 mω. تجميد الحل في-20 درجه مئوية في الارصفه الصغيرة.
  3. قبل تشغيل التجارب ، قبل الحارة حل NES في حمام مائي إلى حوالي 28-30 درجه مئوية.
  4. سحب بعض الأنابيب المجهرية البورسيليكات (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) تحمل المقاومة غيض: 5-6 MΩ وملء مع محلول داخل الخلايا قبل المتصاعدة في حامل ماصه.
    ملاحظه: تذكر لأسلاك الفضة كلوريد من القطب الكهربائي والمرجعي التسجيل في التبييض لمده لا تقل عن 30 دقيقه من أجل تشكيل طبقه موحده من AgCl علي سطح السلك.
  5. نقل طبق بيتري في غرفه التسجيل والسماح للغرفة مع حل NES في 1-2 mL/min. السماح للتدفق يمر عبر سخان مضمنه تعيين في درجه حرارة 30 درجه مئوية من أجل الحفاظ علي الحل الدافئة.
  6. مكان غرفه تسجيل إلكتروفيزيولوجي تحت المجهر تستقيم. سجل تيارات الغشاء مع مكبر للصوت التصحيح المشبك والحصول علي البيانات مع البرامج المناسبة.
  7. فتح برنامج التحكم مكبر للصوت ، وتعيين كسب اشاره في القيمة 1 وتصفيه بسل في 10 كيلوهرتز. تاكد من ان فلتر بسل هو 2.5 مرات اقل من تردد أخذ العينات.
  8. تعيين البروتوكولات التجريبية للجهد المشبك والتجارب الحالية المشبك في برنامج التسجيل.
  9. في اعداد البروتوكول ، حدد وضع التحفيز العرضي واضبط تردد أخذ العينات عند kHz 25. ثم ، انتقل إلى علامة التبويب الموجي واكتب الجهد أو السعه الحالية الخطوة وطول علي النحو التالي.
  10. لتيارات الصوديوم الجهد بوابات, استخدام 15 خطوات الجهد (50 ms مده كل منها) من-100 mV إلى + 40 mV (10 mV الزيادة). تشغيل البروتوكول بعد فرض إلى الخلية مصححه امكانيه عقد من-60 mV من خلال مكبر للصوت. المثل ، يتم اثار تيارات البوتاسيوم الجهد بوابات بخطوات الجهد (250 مللي ثانيه مده كل منهما) من-30 mV إلى + 50 mV (10 mV زيادة) عقد الخلية المسجلة إلى-40 mV.
  11. للتحقيق في خصائص إطلاق النار من الجمجمة المستمدة iPSC والعمود الفقري MNs ، المشبك الخلايا ، في وضع المشبك الحالي ، في قدره الغشاء من-70 mV واستخدام النبضات الحالية 4 (1 s مده كل منها) من زيادة السعه (من + 20 باسكال إلى + 80 pA ؛ 20 pA الزيادة).
  12. الحصول علي كل خليه التيارات النشطة الجهد ، اثار إطلاق النار النشاط وثلاثه خصائص السلبي والسعه الخلية الكاملة (سم) ، ومقاومه غشاء الخلية (Rm) ويستريح غشاء المحتملة (مبردات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي لطريقه التفريق. تم نقل iPSCs البشرية (WT I خط3) مع Epb-BSD-tt-النيل أو Epb-BSD-tt-النعناع الخاص ، وتوليد ، بناء علي الاختيار بلاستيبين ، ومستقره والخلايا القابلة للتحويل12، يشار اليها فيما بعد باسم ipscs-NIL و IPSCS-النعناع ، علي التوالي. ميزت خلايا يميز للتعبير من ال [تعدد ماركر] OCT4 وال [ول-كسم] علامة TUJ1. واظهر تحليل المناعية التعبير موحده من OCT4 في جميع الخلايا في اليوم 0 ، في غياب الايجابيه TUJ1 (الشكل 2ا). في اليوم 3 ، لاحظنا انخفاضا قويا في عدد الخلايا OCT4 الموجبة ، معكوسه بالتعبير عن TUJ1 في مجموعه فرعيه من التمييز iPSCs (الشكل 2ب). في اليوم 5 ، لم يلاحظ اي تعبير عن OCT4 في السكان ، والتي أظهرت تعبيرا متسقا من TUJ1 واكتسبت المورفولوجية العصبية (الشكل 2ج). ثم تم فصل المولدات العصبية الحركية وأعاده طلاءها لمزيد من النضج. بعد 7 أيام (12 يوما منذ اليوم 0) ، وأعربت الخلايا بشكل موحد TUJ1 والخلية العصبية الحركية الناضجة علامة الدردشة (الشكل 3). وقد تم الحصول علي نتائج مماثله مع اثنين من خطوط iPSC التجارية الاضافيه (انظر جدول المواد) ، وذلك باستخدام نفس الظروف الثقافية والتفاضلية (الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2). المثل إلى الخلايا العصبية الحركية الناجمة عن الصفر من الماوس ESCs11، ipscs البشرية المستحثة بالنيل والنعناع الذي عبر عن مستويات منخفضه من عوامل النسخ hox ويمكن ان تكون منقوشة علي طول محور rostro-caudal مع حمض الريتينويك (الشكلالتكميلي S3 ).

تم الحصول علي هذه النتائج عندما 62,500 خلايا/سم2 تم المصنفة في بداية التمايز والمستحثة مع 1 μM دوكسيسيكلين في اليوم 0. ونتج عن ذلك التركيز الأمثل للدوكسيسيكلين لتحقيق اقصي قدر ممكن من الجينات المتحولة دون سميه واضحة للخلايا (الشكل التكميلي S4A). عند أزاله الدوكسيسيكلين في اليوم 5 ، تم إسكات التعبير عن الجينات المتحولة (الشكل التكميلي S4B). وأجرينا أيضا تجارب تجريبية لتحديد الكثافة المثلي للخلايا عند هذه النقطة من البروتوكول. لاحظنا ان اختلاف هذه المعلمة في تجارب التمايز المتوازية قدم نتائج مختلفه. مع الكثافة الاوليه خفضت إلى 31,250 خلايا/سم2، وكان التمايز الطبيعي علي ما يبدو ، كما تقييمها من قبل رصد المورفولوجية الخلية. ومع ذلك ، لاحظنا مقاومه التفكك في اليوم 5 (القسم 3.4) وانخفاض القدرة علي البقاء في مرحله النضج اللاحقة. وعلي العكس من ذلك ، عندما رفعت الكثافة الاوليه للخلايا إلى 125,000 الخلايا/سم2، لاحظنا التمايز غير فعاله ، كما تقييمها بسبب عدم الاستحواذ علي المورفولوجية النموذجية مثل الخلايا العصبية. ونتج عن ذلك ان السكان المختلطين لا يحتويون الا علي جزء صغير من MNs ، الأمر الذي سيحتاج إلى مزيد من التنقية (علي سبيل المثال ، من قبل الوحدة العامة لمعالجه الأصول). ولذلك فقد ثبت ان الكثافة المثلي للحصول علي السكان النقي من الخلايا العصبية ، وقادره علي البقاء علي قيد الحياة في الثقافة لأكثر من شهرين ، هو 62,500 الخلايا/سم2.

ثم قمنا بتقييم النضج الوظيفي للخلايا العصبية للمحركات الشوكية المشتقة من iPSC من خلال توصيف خواصها الكهربية الفسيولوجية (الشكل 4) ، كما ذكر سابقا للخلايا العصبية للمحركات القحفيه المستمدة من ipsc12. التصحيح المشبك التسجيلات ، في طريقه الجهد والمشبك الحالية ، وأجريت في اليوم 7 من خطوه نضوج MNs من البروتوكول (انظر الشكل 1؛ الوقت الإجمالي للتفريق: 12 يوما) (الشكل4ا). وفي هذه النقطة الزمنيه ، أظهرت الخلايا العصبية الحركية المشتقة من iPSC الصفرية امكانيه غشاء الراحة المنخفضة قليلا (-30 ± 2 mV; n = 24) وقيمه مماثله لسعه الخلية (+ 25 ± 2 pF; n = 25) عند مقارنتها بالتقرير السابق iPSC MNs12. ثم ، لأعمق وصف درجه نضوج الخلايا المتمايزة ، حققنا قدرتها علي استحضار تيارات الصوديوم والبوتاسيوم عندما حفز مع سلسله من نبضات الجهد. وفي هذه التجارب ، عرضت الخلايا العصبية المشتقة من ipsc بنجاح تيارات الصوديوم المعتمدة علي الجهد (الشكل 4ب) ، وتيارات البوتاسيوم التي تعتمد علي الجهد (الشكل4ج) ، وتصل إلى ذروه السعه عند فرضها في غشاء المحتملة بالقرب من − 20 mV و + 50 mV ، علي التوالي. إمكانات التوازن لNa + و K + ، محسوبة باستخدام معادله nernst (www.physiologyweb.com/calculators/nernst_potential_calculator.html) مع الحلول خارج الخلية والخلايا المبلغ عنها سابقا ، كانت + 110 mV و-102 mV علي التوالي. الاضافه إلى ذلك ، فان 80 ٪ من MNs المشتقة من iPSC التي فرضت في طريقه المشبك الحالية كانت قادره علي تشغيل القطارات سبايك عند حقنه مع نبض الحالية من + 60 pA أو أكثر (الشكل 4د). وكان الحد الأدنى الحالي المطلوب للحصول علي إطلاق النار المتكرر في أكثر من 50 ٪ من الخلايا المسجلة + 40 pA (15 من أصل 18 خليه ؛ الشكل 4 E). وكان ارتفاع عتبه-37.6 ± 0.8 mV ومتوسط وتيره إطلاق النار في + 40 السلطة الفلسطينية حوالي 7.9 ± 2.2 هرتز (ن = 18 ؛ الشكل 4 و).

عموما, هذه البيانات تشير إلى ان, المثل لل iPSC المستمدة من قبل النعناع الMNs12, ipsc-النيل المشتقة MNs العمود الفقري لديها خصائص وظيفية نموذجيه من الخلايا العصبية الناضجة.

Figure 1
الشكل 1 : الحركية العصبية بروتوكول التمايز. ويبين الشكل تمثيلا تخطيطيا لبروتوكول التمايز ، من جيل خطوط iPSC المستقرة مع نواقل الاشاره إلى النقطة الزمنيه للتحليل الوظيفي المبلغ عنه في النص. يتم عرض صور تباين المرحلة التمثيلية للخلايا في خطوات مختلفه من البروتوكول. قضبان المقياس = 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 : التحليل المناعي التمثيلي للخلايا المتمايزة. تم تحليل الخلايا iPSC-NIL و iPSC-النعناع القومي من قبل المناعي للتعبير عن علامة تعدد OCT4 (الأرجواني) وعلامة العصبية عموم TUJ1 (الأحمر) في اليوم 0 (ا) ، اليوم 3 (ب) واليوم 5 (ج). وكانت النوى ملطخه مع DAPI. تم الحصول علي الصور المنسقة في مجهر المسح الضوئي بالليزر (انظر جدول المواد) باستخدام 20X NA 0.75 الهدف مع التكبير 2x, 1024 x 1024 بكسل, مجهزه 405 nm, 473 nm, 559 nm و 635 nm الليزر. تصفيه الاعداد ل DAPI, اليكسا فلور 594 واستخدمت اليكسا فلور 647. قضبان المقياس = 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : التحليل المناعي التمثيلي للخلايا العصبية الحركية المشتقة من iPSC. تم تحليل الخلايا iPSC-NIL و iPSC-النعناع القومي من قبل المناعية للتعبير عن العلامة العصبية عموم TUJ1 (الأحمر) وعلامة العصبية الحركية الدردشة (الكولين اسيتيل ترانسفيرتاز; الأخضر) في اليوم 12. وكانت النوى ملطخه مع DAPI. تم الحصول علي الصور المنسقة كما هو موضح في اسطوره الشكل 2 . قضبان المقياس = 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 تحليل وظيفي للخلايا العصبية للمحركات الشوكية والجمجمة.: (ا) صوره حقل ساطع من المشبك التصحيح الخلية الكاملة علي الخلايا العصبية ipsc المشتقة من النخاع الشوكي. (ب) منحني الممثل الأول/الخامس بالنسبة لNa + الحالية المسجلة في ipsc MNs المشتقة من الصفر استجابه لسلسله من خطوات الجهد المتزايد (ن = 26 ؛ عقد المحتملة يساوي-60 mV). (ج) منحني الممثل الأول/الخامس لكي + المسجل في الMNs المشتقة من IPSC الصفرية استجابه لسلسله من خطوات الجهد المتزايد (ن = 23 ؛ القدرة علي التحمل تساوي-40 mV). (د) اثر تمثيلي لقدرات قطارات العمل التي أثيرت ردا علي الحقن الحالي المستمر لمده 1 ثانيه من + 60 باسكال. (ه) الرسم البياني الذي يمثل النسبة المئوية لMNs المستمدة من IPSC NIL التي تستخلص إمكانات العمل في كل نبضه حاليه (ن = 18). (F) الرسم البياني الذي يعرض تردد الإطلاق المثار عند كل نبضه حاليه (ن = 18). تم اجراء تسجيل إلكتروفيزيولوجي تحت مجهر مستقيم. يتم الاشاره إلى نظام تسجيل التيارات الغشائية في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 1
الشكل التكميلي S1: التمايز MN باستخدام hiPSCs. (ا) صور ساطعه للتمييز بين الفرجين والصفر (يسار) والخطة الخاصة بالأرض (يمين) في النقاط الزمنيه المشار اليها. قضبان المقياس = 50 μm. (ب) تحليل التعبير عن العلامات المشار اليها في التفريق بين الخلايا الموجودة في ابيسمال هيسك-نيل (الأعلى) والخلية الاوليه (السفلية) في الوقت الحقيقي QRT-PCR. بالنسبة لكل علامة ، تم استخدام النقطة الزمنيه ذات التعبير الأعلى كعينه معايره. الإشعال المستخدمة ل ISL1 هي محدده للجينات الذاتية. (ج) المناعية لعلامة الخلايا العصبية TUJ1 (الأحمر) والجمجمة MN علامة PHOX2B (الأخضر) في المتمايزة (اليوم 6) ابيسمال hipsc-النيل (اليسار) و ابيسمال hipsc-النعناع القومي (اليمين). يتم الموازنة بين النوى مع DAPI. شريط مقياس لجميع لوحات: 50 μm. (د) تحليل التعبير عن الHB9 والPHOX2B في التفريق بين الخلايا الموجودة في ابيسمال هيسك-نيل (الأعلى) والخلية الخاصة بالنعناع الوطني (السفلي) في الوقت الحقيقي QRT-PCR. تم استخدام اليوم 0 كعينه معايره. وذكرت الإشعال PCR وطرق في دي سانتيس وآخرون ، 201812. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 2
الشكل التكميلي S2: MN التمايز باستخدام DS2U iPSCs. (ا) صور ساطعه للتمييز بين DS2U (يسار) و DS2U (يمين) في النقاط الزمنيه المشار اليها. قضبان المقياس = 50 μm. (ب) تحليل التعبير عن العلامات المشار اليها في التفريق بين الخلايا DS2U (العليا) و DS2U (السفلي) في الوقت الحقيقي QRT-PCR. بالنسبة لكل علامة ، تم استخدام النقطة الزمنيه ذات التعبير الأعلى كعينه معايره. الإشعال المستخدمة ل ISL1 هي محدده للجينات الذاتية. (ج) المناعية لعلامة الخلايا العصبية TUJ1 (الأحمر) والجمجمة MN علامة PHOX2B (الأخضر) في المتمايزة (اليوم 6) DS2U (اليسار) و DS2U-النعناع (اليمين) الخلية. يتم الموازنة بين النوى مع DAPI. قضبان المقياس = 50 μm. (د) تحليل التعبير عن HB9 و PHOX2B في التفريق بين الخلايا DS2U الصفرية (العليا) و DS2U النعناع الوطني (السفلي) في الوقت الحقيقي QRT-PCR. تم استخدام اليوم 0 كعينه معايره. وذكرت الإشعال PCR وطرق في دي سانتيس وآخرون ، 201812. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 3
الشكل التكميلي S3: HOX التعبير الجيني. (ا) تحليل التعبير عن أربع جينات hox مختلفه (Hox A2, Hox B1, Hox A4, Hox B5) بعد 5 أيام من التفريق بين IPSC-Nil و IPSC-NIL + RA الخلايا بالوقت الحقيقي QRT-PCR. تم استخدام IPSC-NIL في اليوم 0 كعينه معايره. (ب) تحليل التعبير عن أربعه جينات hox مختلفه (Hox A2 ، Hox B1 ، Hox A4 ، Hox B5) بعد 5 أيام من التفريق بين الخطة الوطنية لل ipsc-النعناع والنعناع العادي + الخلايا RA في الوقت الحقيقي QRT-PCR. IPSC-تم استخدام الخطة الخاصة في اليوم 0 كعينه معايره. (ج) أزواج التمهيدي PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 4
الشكل التكميلي S4: تحليل الاستقراء الدوكسيسيكلين. (ا) تحليل في الوقت الحقيقي QRT-PCR من التعبير عن Ngn2 الخارجية في ipsc-النيل (اعلي) والخلية النعناع الوطني (أسفل) الخلايا غير المعالجة أو مثقف لمده 24 ساعة في وجود الدوكسيسيكلين في تركيز مختلف (0.5 μm ، 1.0 μm ، 2.0 μm). تم تحليل Ngn2 مع الإشعال محدده لجين الماوس الخارجية. تم تضمين خط iPSC الأبوي ، الخالي من ثوابت الصفر والخطة التنفيذية ، في التحليل كعنصر تحكم. وكان التعبير عن الجينات في iPSC-النيل والخطة الخاصة ب iPSC-neglectable في غياب الدوكسيسيكلين. تم استخدام iPSC-NIL و iPSC-الخطة الخاصة باليوم 0 كعينات معايره. (ب) تحليل بالوقت الحقيقي QRT-PCR من التعبير عن Ngn2 الخارجية في تمييز IPSC-NIL (يسار) و ipsc-الخطة الوطنية (يمين) الخلايا في النقاط الزمنيه المشار اليها من البروتوكول. تم تحليل Ngn2 مع الإشعال محدده لجين الماوس الخارجية. تم استخدام iPSC-NIL و iPSC-الخطة الخاصة باليوم 0 كعينات معايره. وذكرت الإشعال PCR وطرق في دي سانتيس وآخرون ، 201812. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح هذا البروتوكول بتحويل iPSCs البشرية بكفاءة إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري والجمجمة بفضل التعبير المنتبائي لعوامل النسخ الخاصة بالنسب. هذه الجينات هي محفزه من قبل الدوكسيسيكلين ومتكاملة بشكل ثابت في الجينوم بفضل ناقلات المستندة إلى ترانسباك. في المجموعات السكانية المختلطة ، سيتم دمج نسخه واحده أو عده نسخ من المتجه الخاص بالخلية بشكل عشوائي في جينوم الخلايا الفردية ، مما يزيد من خطر التغيرات التي تطرا علي سلامه الجينوم. وعلاوة علي ذلك ، فان الانتقاء التدريجي لمستنسخات iPSC قد يحدث علي مر الزمن ، مع ما يمكن ان يترتب علي ذلك من اثار علي التمايز وعلي التحليل المقارن للامراض وخطوط الخلايا الرقابية. الإجمال ، ستكون MNs المشتقة من iPSC التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول غير مناسبه للطب التجديدي. ومع ذلك ، فان طريقتنا يمكن ان تكون مفيده بشكل خاص لنمذجة امراض الخلايا العصبية الحركية في المختبر. وتتمثل نقاط القوه الرئيسية في الظروف الثقافية مبسطه للغاية ، وسرعه تحويل MN ، ودرجه عاليه من نضوج MNs المستمدة من iPSC وامكانيه الحصول علي كل من MNs الشوكي والجمجمة ، كما هو موضح سابقا من قبل تحليل الجينات علامة محدده التعبير12. وتتجلى متانة البروتوكول في استنساخه. حتى الآن ، لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول أكثر من 30 مره لتوليد العمود الفقري و/أو الجمجمة MN ، وتقييم النتائج حسب العلامة و/أو التحليلات الوظيفية. لقد نجحنا في الحفاظ علي الثقافات العصبية الحركية لمده تصل إلى شهرين دون انخفاض واضح في القدرة علي البقاء. وعلاوة علي ذلك ، مره واحده تم الحصول علي خط ipsc محوله بثبات ، يمكن ان تبدا كل تجربه بواسطة الحث الدوكسيسيكلين دون الحاجة إلى الانتقال الجديد. كما ان النواقل الفيروسية غير مطلوبه. وقد تم الحصول علي النتائج التمثيلية المعروضة هنا عن طريق الكهرباء iPSCs مع نظام الكهرباء الخلية المشار اليها في جدول المواد. ومع ذلك ، قد تمثل أساليب الكهربية الأخرى خيارات بديله. علي العكس من ذلك ، في تجربتنا ، ونظم التحويل القائم علي الشحمية ليست خيارا جيدا للخلايا الجذعية مستحث12. وتتكون الخلايا التي يتم الحصول عليها في نهاية العملية بشكل حصري تقريبا من MNs ، متجنبه الحاجة إلى المزيد من التنقية (مثلا ، من قبل الخلية). كما أظهرنا سابقا12، يسمح البروتوكول الحصول علي 90 ٪ TUJ1-الخلايا الايجابيه ، منها 95 ٪ حيث أيضا PHOX2B ايجابيه في الثقافات المستمدة من الخطة الخاصة.

ويمكننا ان نتصور بعض النقاط الحاسمة التي يجب ان تؤخذ بدقه في الاعتبار. أولا ، نوعيه السكان الاولي من iPSCs أمر حاسم لضمان تحويل متجانسة ومتسقة في MNs. الثقافات التي تحتوي علي جزء كبير من التمايز (أكثر من 5-10 ٪) يجب تجنبها. لقد قمنا باعداد البروتوكول باستخدام الوسيط iPSC البشرية الموصوفة في جدول المواد كوسيلة لصيانة Ipsc غير متمايزة. وقد تمثل وسائط الاعلام المحددة المتاحة تجاريا خيارات بديله صحيحه ، علي الرغم من اننا لم تعالج هذه النقطة بشكل تجريبي في العمل الحالي. وبما ان تكوين وسائل الاعلام قد يؤثر علي معدل انتشار الخلايا الابتدائية ، فان تكييف البروتوكول مع وسائط الصيانة الأخرى قد يتطلب تحسين الكثافة الاوليه في اليوم 0. بعد التحويل ، من المهم الحفاظ علي الخلايا تحت اختيار المضادات الحيوية لمده أسبوعين علي الأقل للحصول علي خطوط خلايا مستقره. قد يكون من المناسب لبعض التطبيقات لاشتقاق خطوط النسيلي بعد الاندماج في البكالوريا ، من أجل الحصول علي السكان أكثر تجانسا من حيث مستويات التعبير عبر الجينات وتحسين السيطرة علي مواقع التكامل. كثافة الخلايا في اليوم 0 ، وقت الدوكسيسيكلين بالاضافه إلى المتوسطة ، هو معلمه حاسمه. وكما ذكر في قسم النتائج التمثيلية ، قدرنا كثافة الخلايا المثلي لضمان استنساخ. لا يمكننا استبعاد ان خطوط الخلايا الجذعية المستحثة الأخرى قد تتطلب كثافة أوليه مختلفه ، والتي ينبغي تحديدها تجريبيا في التجارب التجريبية ، حيث ان معدل الازدواج يمكن ان يختلف اختلافا كبيرا بين الخطوط الفردية. التبديل المتوسطة إلى neurobasal/B27 يجب ان تحدث بعد 48 h منذ الحث الدوكسيسيكلين (القسم 3.3): التمايز قد يؤدي إبطا واقل كفاءه إذا لم يتم عقد الخلايا لمده 2 أيام كامله في المتوسطة dmem/F12. يجب ان يتم التفكك في اليوم 5 دون التشديد علي الخلايا التفريق. قد يختلف وقت الاحتضان مع كاشف تفكك الخلية (الخطوة 3.4) من دفعه إلى دفعه وينبغي تقديره بعناية في التجارب التجريبية. عند الاحتضان مع كاشف التفكك الخلية ، يفصل الخلية بأكملها أحاديه الطبقة من اللوحة. بعد ذلك ، يجب ان يتم فصلها بعناية عن طريق التنضيد ، كما هو موضح في القسم 3.4 ، للحفاظ علي سلامه الخلايا وتجنب الإجهاد الميكانيكي ، والذي يمكن ان يكون له تاثير سلبي علي الحفاظ علي ثقافة الخلايا خارج D5. وأخيرا ، لاحظنا انه بعد أعاده الطلاء MNs التزام بشكل أفضل علي الانسجه البلاستيكية الثقافة من الزجاج. البوليمرات المختلطة لضمان الانضمام الأمثل للخلايا والخصائص البصرية المناسبة هي خيار جيد للتطبيقات المستندة إلى المجهر.

طريقتنا تمثل "برمجه" مباشره من الخلايا المستحثة في مصير MN ، ولا تلخص الخطوات الوسيطة التي من خلالها تكتسب الخلايا الجنينية هويه MN خلال التنمية المجرية ، مثل المواصفات الاوليه للايكولوجيه العصبية زخرفه علي طول محاور الدوران البطني والراسي. ولذلك ، فانه لن يكون مناسبا لنموذج البشرية MN المواصفات في المختبر للدراسة ، علي سبيل المثال ، أليات الجزيئية الكامنة وراء التمايز. من ناحية أخرى ، يسمح بروتوكولنا توليد كميه كبيره من MNs الشوكي أو الجمجمة دون الحاجة إلى مزيد من التنقية. مع الأخذ أيضا في الاعتبار درجه النضج التي تحققت ، وهذا يمثل أداه مفيده لدراسة الأساس الجزيئي للامراض العصبية من الخلايا العصبية الحركية. وقد تم إنتاج عدد ثابت من خطوط iPSC مع الطفرات المسببة للامراض في الجينات المرتبطة بامراض الخلايا العصبية الحركية من قبل المجتمع العلمي في السنوات الاخيره. التالي ، يمكن بسهوله توليد مجموعات من خطوط iPSC "القابلة للبرمجة" من خلال التكامل المستقر لوحدات الصفر والنعناع العام في خطوط iPSC المتحولة هذه. يمكننا ان نتصور ، كتطبيق ممكن في المستقبل للأسلوب ، وتوصيف المحددات الذاتية الخلية التي تضفي قابليه مختلفه للأنواع الفرعية MN الفردية ، من خلال مقارنه جنبا إلى جنب الجمجمة والعمود الفقري MNs التي تم الحصول عليها من iPSCs مع نفس الخلفية الوراثية. وعلاوة علي ذلك ، فان التحويل الفعال لل iPSCs إلى MNs في ظروف الثقافة المبسطة التي تحتاج إلى حد ادني من التلاعب (اي دون الانتقال من خلال الأجسام الجنينية) والتي يمكن ان تكون قابله للتطوير بسهوله ، قد تسهل إلى حد كبير المخدرات المؤتمتة عاليه الانتاجيه طرق الفحص لامراض الخلايا العصبية الحركية. في النمذجة المختبرية للامراض العصبية البالغين بداية يمكن ان تكون صعبه بسبب طبيعة تشبه الجنين من الخلايا العصبية المستمدة من iPSC14. الاستراتيجيات السابقة التي وضعت لتسريع الشيخوخة من MNs المستمدة من التمايز التقليدية من ipscs ، مثل بروجيرن التعبير الفوقي15، قد تكون جنبا مع طريقتنا للحصول علي نماذج أفضل المرض.

يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا ، استنادا إلى التعبير المحرض لعوامل النسخ التي يتوسطها متجه الحمل ، علي أنواع الخلايا المستحثة الأخرى. لقد أظهرنا سابقا ان خلايا العضلات والهيكل العظمي يمكن الحصول عليها من iPSCs البشرية عن طريق التعبير عن BAF60c و Myod16. المثل ، يمكننا ان نتصور امكانيه توسيع الأسلوب لأنواع الخلايا الأخرى من الفائدة ، بما في ذلك الفرعية العصبية الأخرى و astrocytes ، عن طريق التعبير بوساطة التي المجموعة المناسبة من العوامل البرمجة17،18، 19و20و21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه

Acknowledgments

ويود المؤلفون ان يشكروا مرفق التصوير في مركز علوم النانو الحياتية ، المعهد الإيطالي لتقنيات التكنولوجيا ، للحصول علي الدعم والمشورة الفنية. ونحن ممتنون لأعضاء مركز العلوم نانو الحياة لمناقشه مفيده. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا بمنحه من AriSLA (منحه تجريبية 2016 "ستريسفوس") إلى AR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Bapta Sigma-Aldrich A4926-1G chemicals for electrophysiological solutions
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML  Cell dissociation reagent
anti-CHAT EMD Millipore  AB144P Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488  Thermo Fisher Scientific  A11055 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A31571 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4  BD Biosciences 611202 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-376997 Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594  Immunological Sciences IS-20152-1 Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1  Sigma-Aldrich  T2200 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27 Miltenyi Biotec 130-093-566 Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker Nippon Genetics NGE-BB02 Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF PreproTech 450-02 Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin Sigma-Aldrich 203350 Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA Sigma-Aldrich A2153 Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software Molecular Devices Clampex 10 Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA Biological Industries 05-710-1E Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose Sigma-Aldrich G5146 chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder Roche 10236276001 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT AdipoGen AG-CR1-0016-M005 Gamma secretase inhibitor
Dispase Gibco 17105-041 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D6421-500ML Basal medium for cell culture
Doxycycline Sigma-Aldrich D9891-1G  Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U  WiCell UWWC1-DS2U Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit  Omega bio-tek R6834-02 Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF PreproTech 450-10 Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line Thermo Fisher Scientific A18945 Commercial human iPSC line
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050038 An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes Sigma-Aldrich H4034 chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR  Bio-Rad 1708841 Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix  Bio-Rad 172-5121  Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate Sigma-Aldrich G4500 chemicals for electrophysiological solutions
KCl Sigma-Aldrich P9333 chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid LKT Laboratories A7210 Used in cell culture as an antioxidant
Laminin Sigma-Aldrich 11243217001 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope  Olympus  iX83 FluoView1200 Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187 chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium  Ibidi 50001 Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier Molecular Devices 700B Membrane currents recording system
Na-GTP Sigma-Aldrich G8877 chemicals for electrophysiological solutions
NaCl Sigma-Aldrich 71376 chemicals for electrophysiological solutions
NEAA Thermo Fisher Scientific 11140035 Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit Thermo Fisher Scientific MPK10096 Cell electroporation kit
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Cell electroporation system
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF  Biological Industries 05-100-1A Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8 Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free Sigma-Aldrich D8537-500ML Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin  Sigma-Aldrich P4333-100ML Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402 Sigma-Aldrich SML0443-5MG Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope Olympus BX51VI Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera 
Y-27632  (ROCK inhibitor) Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005  Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well  Ibidi 80826 Support for high–end microscopic analysis of fixed cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

Tags

العلوم العصبية ، الإصدار 147 ، الخلايا الجذعية مستحث المستحثة ، الخلية العصبية الحركية ، التمايز ، عوامل النسخ ، Phox2a ، Isl1 ، Ngn2 ، Lhx3
تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garone, M. G., de Turris, V.,… More

Garone, M. G., de Turris, V., Soloperto, A., Brighi, C., De Santis, R., Pagani, F., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors. J. Vis. Exp. (147), e59321, doi:10.3791/59321 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter