Summary
Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.
Abstract
As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham um papel fundamental na regulação do metabolismo celular em processos fisiológicos e patológicos. A produção fisiológica de ERO desempenha um papel central na modulação espacial e temporal de funções celulares normais, como proliferação, sinalização, apoptose e senescência. Em contraste, a superprodução crônica de ERO é responsável por um amplo espectro de doenças, como câncer, doenças cardiovasculares e diabetes, entre outras. Quantificar os níveis de ROS de forma precisa e reprodutível é, portanto, essencial para entender a funcionalidade celular normal. Métodos baseados em imagens de fluorescência para caracterizar espécies intracelulares de ROS é uma abordagem comum. Muitos dos protocolos de imagem ROS na literatura utilizam o corante diacetato de 2'-7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). No entanto, este corante sofre de limitações significativas em seu uso e interpretabilidade. O protocolo atual demonstra o uso de uma sonda fluorescente de diidroetídio (DHE) como um método alternativo para quantificar a produção total de ROS em um ambiente de alto rendimento. A plataforma de geração de imagens de alto rendimento, CX7 Cellomics, foi usada para medir e quantificar a produção de ROS. Este estudo foi realizado em três linhagens de células de câncer hepatocelular - HepG2, JHH4 e HUH-7. Este protocolo fornece uma descrição detalhada dos vários procedimentos envolvidos na avaliação de ROS dentro das células, incluindo - preparação de solução de DHE, incubação de células com solução de DHE e medição da intensidade de DHE necessária para caracterizar a produção de ROS. Este protocolo demonstra que o corante fluorescente DHE é uma escolha robusta e reprodutível para caracterizar a produção intracelular de ROS de forma de alto rendimento. Abordagens de alto rendimento para medir a produção de ROS provavelmente serão úteis em uma variedade de estudos, como toxicologia, rastreamento de drogas e biologia do câncer.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um grupo de radicais químicos de ocorrência natural, altamente reativos e temporalmente instáveis formados como parte do metabolismo celular normal nas células. As ERO desempenham um papel fundamental e essencial na modulação dos processos fisiológicos e bioquímicos normais que ocorrem nas células 1,2. A principal fonte de produção de ERO nas células é a via da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) como parte do ciclo bioenergético normal. Fontes adicionais significativas de produção de ROS incluem reações enzimáticas como NADPH oxidases celulares em células. O metabolismo das moléculas alimentares (por exemplo, glicose) ocorre através da via de fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial. Um nível basal de produção de ERO é essencial para regular os processos normais de sinalização celular fisiológica. Muitas moléculas de proteínas-chave que fazem parte das vias de sinalização metabólica da glicose (por exemplo, Akt e PTEN) são conhecidas por responder aos níveis intracelulares de ROS. Além disso, as ERO são produzidas por várias enzimas intracelulares, como xantina oxidase, óxido nítrico sintase e constituintes peroxissomais, como parte das vias enzimáticas celulares 1,2. Em contraste com as fontes naturais de EROs, certos fatores ambientais, como xenobióticos, agentes infecciosos, luz UV, poluição, tabagismo e radiação, também levam à produção excessiva de EROs, que são um dos principais impulsionadores do estresse oxidativo intracelular 1,3. O estresse oxidativo celular elevado pode causar danos às biomoléculas nativas no interior de uma célula, como lipídios, proteínas e DNA, causando várias doenças como câncer, diabetes, doenças cardiovasculares, inflamação crônica e doenças neurodegenerativas 1,3,4. Portanto, medidas precisas de ERO são essenciais para entender os mecanismos celulares envolvidos na fisiopatologia da doença induzida pelo estresse oxidativo.
Devido às curtas escalas de tempo de produção e eliminação de ROS dentro das células, medidas quantitativas de vários radicais ROS permanecem um desafio. Métodos como ressonância paramagnética eletrônica (RPE)5, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e imagens baseadas em sonda de fluorescência são usados para medir as várias ROS celulares6. Enquanto métodos como EPR e HPLC produzem estimativas quantitativamente precisas, esses métodos envolvem a destruição da morfologia espacial celular e geralmente estão na forma de medidas globais e em massa de uma amostra. Em contraste, métodos baseados em imagem, como métodos baseados em sonda de fluorescência, mantêm a morfologia celular e o contexto espacial da geração de EROs. No entanto, a especificidade de várias sondas de fluorescência para diferentes tipos de radicais ROS não está bem estabelecida 7,8. Várias sondas fluorescentes como diidroetídio (DHE), diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), diidrorodamina (DHR), dimetilantraceno (DMA), 2,7 diclorodihidrofluresceína (DCFH), 1,3-Difenilisobenzofurano (DPBF) e MitoSox estão disponíveis para detecção de ROS comercialmente. Nas últimas décadas, DHE, MitoSox e DCFH-DA são os corantes fluorescentes comumente utilizados para medir ERO em células e tecidos 8,9. DCFH-DA é um corante amplamente utilizado para detectar H2O2 intracelular e estresse oxidativo. Apesar da popularidade da DCFH-DA, vários estudos prévios mostraram que ela não pode ser usada de forma confiável para medir os níveis intracelulares de H2O2 e outras ROS 8,9,10,11,12,13,14.
Em contraste, a sonda fluorescente diidroetídio (DHE) apresenta uma resposta específica ao radical superóxido intracelular (O2-). Embora o radical superóxido seja uma das muitas espécies de ROS observadas nas células, é um importante radical envolvido na redução de metais de transição, conversão em peroxinitrato e formação de hidroperóxidos, entre outros efeitos intracelulares. O DHE é rapidamente absorvido pelas células e tem uma emissão de fluorescência na faixa de comprimento de onda vermelha15. Após a reação com o radical superóxido especificamente, o DHE forma um produto fluorescente vermelho, 2-hidroxietídio (2-OH-E+). Assim, o DHE pode ser considerado como uma sonda específica para detecção de superóxido. No entanto, DHE também pode sofrer oxidação inespecífica com ONOO- ou OH., H2O2, e citocromo c para formar um segundo produto de fluorescência, etídio E+, que pode interferir com os níveis medidos de 2-OH-E+. No entanto, esses produtos 2-OH E+ e E+, em combinação, representam a maior parte do total de espécies celulares de ROS observadas dentro de uma célula quando coradas com DHE. O E+ intercala no DNA, aumentando sobremaneira sua fluorescência 8,9,10,11,13,14,15,16. Uma vez que os espectros de fluorescência do etídio e do 2-hidroxietídio diferem apenas ligeiramente, a maioria dos níveis de ROS observados em uma célula secundária à produção de superóxido pode ser detectada e medida usando produtos de fluorescência DHE. Essas espécies de ROS são identificadas usando excitação de comprimento de onda de 480 nm e emissão de comprimento de onda de 610 nm 15,16,17.
Além de escolher uma sonda de detecção de ROS fluorescente específica, é importante escolher um método sensível de detecção para medir ROS intracelular. A avaliação precisa dos níveis intracelulares de ROS é, portanto, fundamental para identificar estados de equilíbrio redox perturbados que ocorrem em células doentes ou que foram expostas a vários estressores ambientais, como radiação, compostos toxicológicos e agentes genotóxicos18. Uma vez que as ROS são um fenômeno comum em células que é responsável por regular uma variedade de atividades de sinalização celular, métodos robustos de detecção de ROS são essenciais. Para permitir essa avaliação de alto rendimento da produção de ROS dentro das células, este protocolo usa uma plataforma de triagem de alto conteúdo (HCS) para medir as espécies de ROS. O protocolo atual permite a análise em alto rendimento da produção intracelular de EROs, o que é de fundamental importância em muitos estudos toxicológicos19. Este protocolo visa fornecer uma solução fácil e versátil para detectar e medir ERO intracelular em células de carcinoma hepatocelular aderente. Os reagentes químicos de H2O2 e menadione são usados como potentes estimuladores de ROS para medir os níveis relativos de produção de ROS em um ambiente controlado e de alto rendimento. Este protocolo pode ser ajustado para medir a produção de ERO em células aderentes e não aderentes em condições apropriadas, conforme necessário.
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Protocol
1. Cultura celular
- Semeando as células teste (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 e JHH4) em uma placa de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células/poço em um volume final de semeadura de 200 μL por poço.
- Antes de cultivar as células HepG2, revestir os 96 poços de placa com colágeno tipo IV (50 μg/mL) por 2 h de duração à temperatura ambiente (TR). Para evitar a solidificação do colágeno estoque, coloque a solução estoque em gelo e, posteriormente, inicie o processo de diluição até a concentração desejada.
- Após um período de incubação de 2 h, aspirar o excesso de colágeno e lavar os poços três vezes com o PBS 1x.
- Cultivar as células em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco durante a noite a 37 °C e concentração de 5% de CO2 em uma incubadora umedecida.
- No dia seguinte, ou ao atingir a confluência de 80%-90%, o que ocorrer primeiro, tratar as células com H2O2 (não tratada, 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM) e Menadione (não tratada, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), respectivamente, por 30 min para induzir o estresse oxidativo representativo.
- Alternativamente, opte por testar as células com a substância de teste desejada de escolha capaz de induzir estresse oxidativo dentro das células.
2. Preparação de solução estocada e diluída para coloração de DHE de células
- Preparar a solução-mãe de DHE (5 mg/mL ou 15,9 mM) dissolvendo 5 mg de DHE em 1 mL de DMSO.
- Diluir a solução-mãe de DHE com água autoclavada bidestilada até uma concentração final de 100 μM.
- Para evitar o processo de congelamento e descongelamento do corante (que pode danificar as propriedades de fluorescência ao longo do tempo), prepare várias alíquotas em tubos de centrífuga de 1,5 mL com concentração de 100 μM e armazene-os a -20 °C.
- Para obter uma concentração final de trabalho de 10 μM, use uma alíquota da concentração de DHE de 100 μM e dilua-a com meio DMEM pré-aquecido.
NOTA: A solução de trabalho deve ser preparada fresca no dia da experiência. - Vórtice a solução de corante de fluorescência de trabalho por 5-10 s para garantir a mistura adequada do corante.
3. Processo de coloração de DHE
- Remova o meio contendo droga ou substância de teste de cada poço e lave-o suavemente uma vez com 1x PBS ou DMEM.
NOTA: Ao realizar as etapas de adição ou lavagem no experimento, é crucial evitar o contato direto entre as células e o pipetador. Isso pode ser conseguido pipetando suavemente o PBS ao longo das laterais dos poços para minimizar qualquer dano mecânico potencial às células. Garantir que o pipetador não toque diretamente nas células ajudará a manter a integridade e a viabilidade da célula durante o experimento. - Adicionar 100 μL de meio DMEM contendo 10 μM de DHE (solução de trabalho) em cada poço e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Após 30 min de período de incubação, remova o meio contendo DHE e lave cada um bem suavemente três vezes com o 1x phosphate-buffered saline (PBS). Isso pode ser realizado com um pipetador multicanal para garantir um rápido retorno.
- Adicionar 200 μL de 1x PBS a cada poço com corante nuclear Hoechst 33342 por 10 min em RT.
- Remova a solução de coloração nuclear Hoechst 33342 do poço e adicione 200 μL de 1x PBS a cada poço.
NOTA: Para obter células fixas, siga o mesmo protocolo das células vivas, com uma etapa adicional de adição de PFA a 4% por 5 min após o tratamento e coloração de DHE. Retire a solução de PFA e lave as células com o PBS 1x. Em seguida, incubar as células com o corante corante nuclear por 10 min. - Mova a placa para a plataforma de triagem de alto conteúdo, microscopia de fluorescência ou leitor de placas para aquisição de imagens o mais rápido possível.
4. Aquisição de imagens e mensuração da intensidade
- Carregamento de placas
- Abra o software Cellomics CX7 de triagem de alto conteúdo (HCS) para aquisição de dados.
- Calibre cuidadosamente a plataforma de imagem de acordo com as especificações do fabricante com antecedência com a placa específica de 96 poços de escolha para uso para evitar imagens nebulosas ou borradas nos dados.
NOTA: Placas multipoços de vários fornecedores podem ter propriedades diferentes do material e podem influenciar a qualidade das imagens finais obtidas. - Uma vez calibrados, salve os parâmetros do sistema específicos da marca da placa no banco de dados de instrumentos e reutilize-os para futuras aquisições de dados.
- Coloque cuidadosamente a placa com as amostras preparadas no estágio aquecido do sistema de imagem HCS. Certifique-se de que a placa esteja bem posicionada e na orientação correta para geração de imagens no suporte da microplaca (ou seja, localize a etiqueta marcada como A1 no estágio do leitor e, em seguida, gire a microplaca para que a localização do poço A1 corresponda ao canto com o adesivo).
- Pressione suavemente a microplaca para garantir que ela fique encostada no palco. O nivelamento irregular da placa no sistema HCS pode levar a erros na aquisição das imagens.
- Depois que a placa estiver no lugar, pressione e mantenha pressionada a tecla Ctrl e clique em Ctrl-OK na caixa de diálogo Carregar/descarregar placa no software.
- Selecionando parâmetros de imagem
- No sistema de imagem HCS, abra o modo de Ativação de Alvo na interface de bioaplicações do Cellomics e crie um novo protocolo usando o protocolo de configuração de dois canais compatível com (a) coloração nuclear e (b) aquisição de dados de sonda de fluorescência DHE. No protocolo atual, os filtros 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS e 386_BGS_RS foram usados para (a) coloração nuclear Hoechst 33342, (b) produção total de ROS e (c) detecção de radicais superóxido, respectivamente. A escolha desses filtros foi orientada pela sobreposição específica para as propriedades de emissão de cada corante (DAPI e DHE) utilizado como parte deste protocolo.
NOTA: A convenção de nomenclatura de filtros, por exemplo, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, refere-se à excitação da amostra com luz de 386 nm com largura de banda de 23 nm, seguida por um filtro dicroico que passa luz azul (B), verde (G), vermelha (R), vermelha (FR) e infravermelha próxima (N) em faixas de comprimento de onda específicas e a 386_BGS_RS refere-se a um filtro de emissão que passa luz de comprimento de onda de emissão BGS e RS após o dicroico. - Especifique os objetivos para o processo de aquisição de imagens dentro da interface do protocolo de software, como ampliação de 10x ou 20x, conforme necessário.
- Escolha a ampliação objetiva apropriada dependendo do nível desejado de detalhes de imagem e das resoluções necessárias para o experimento. No entanto, a resolução de cada objetivo é fixa. Detalhes de resolução mais altos exigirão a mudança do objetivo na plataforma. No protocolo atual, utiliza-se uma objetiva de 20x, 0,45 NA, que faz parte da plataforma de triagem de alto conteúdo utilizada nesse protocolo.
NOTA: A objetiva de 20x representa uma boa compensação entre os detalhes da resolução da imagem e a velocidade de aquisição necessária para capturar as alterações de ROS ao longo do tempo. Objetivos de ampliação mais altos podem ser escolhidos (por exemplo, 40X), no entanto, isso levará a um aumento do tempo de aquisição. - Especifique as configurações de exposição da câmera de aquisição de imagem, como o tempo de exposição, o binning da câmera e o intervalo z-stack, de acordo com os requisitos específicos do protocolo.
NOTA: O tempo de exposição (geralmente em milissegundos) varia com base na intensidade do sinal e na sensibilidade dos fluoróforos específicos usados. Isso também pode diferir ligeiramente de experimento para experimento com base na concentração do corante e na qualidade da coloração. No protocolo atual, os parâmetros de aquisição são fixados da seguinte forma - Target % - 35%, modo de aquisição de imagens - 1104 x 1104 (com binning 2x2) e objetivo 20x, 0,45 NA. Estes parâmetros podem ser definidos de acordo com as condições experimentais específicas.
- No sistema de imagem HCS, abra o modo de Ativação de Alvo na interface de bioaplicações do Cellomics e crie um novo protocolo usando o protocolo de configuração de dois canais compatível com (a) coloração nuclear e (b) aquisição de dados de sonda de fluorescência DHE. No protocolo atual, os filtros 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS e 386_BGS_RS foram usados para (a) coloração nuclear Hoechst 33342, (b) produção total de ROS e (c) detecção de radicais superóxido, respectivamente. A escolha desses filtros foi orientada pela sobreposição específica para as propriedades de emissão de cada corante (DAPI e DHE) utilizado como parte deste protocolo.
- Parâmetros de configuração de imagem
NOTA: Uma vez que os parâmetros de imagem são definidos, o processo de coleta de imagens pode ser iniciado usando a interface do software.- Parâmetros da coleção de imagens
- Identificar o objeto de rastreamento primário de interesse (o núcleo das células) usando diferentes algoritmos disponíveis no instrumento (óptica - isodados, fixo e triângulo).
Observação : O método isodata para a identificação e marcação do objeto primário é usado neste protocolo. - Segmente o objeto (se houver) por forma ou parâmetro de intensidade.
- Valide o objeto primário com base nos parâmetros de tamanho, forma e intensidade desejados exclusivos para cada tipo de célula.
- Em seguida, defina a "região de interesse" (ROI) em torno desse objeto primário.
NOTA: O ROI é um parâmetro-chave de aquisição de dados que define o local onde a intensidade do corante de fluorescência é identificada para ser consistente e repetível entre os tipos de células. A ROI define os parâmetros-chave (como a intensidade do corante), que são medidos para cada objeto de rastreamento primário (ou seja, uma célula) em diferentes canais do instrumento. A ROI pode ser definida na forma de um círculo ou anel ao redor do núcleo de cada célula. O software HCS obtém automaticamente a intensidade do marcador corante de fluorescência DHE no canal 2 dentro do limite da ROI para cada célula que é segmentada e analisada de forma automatizada. - Defina um círculo de 20 μm em torno do objeto primário (núcleo). A distância de 20 μm foi escolhida neste estudo com base nos tamanhos aproximados das várias linhagens celulares utilizadas neste protocolo (HepG2, JHH-4 e HUH-7). A ROI do anel de 20 μm ao redor das células obteve a intensidade da fluorescência de forma consistente e repetível.
NOTA O parâmetro-chave na escolha de um ROI é a capacidade de cobrir adequadamente a área da célula; o tamanho da ROI circular depende do tamanho da célula. Células maiores podem exigir um ROI maior e vice-versa para um ROI menor. Esses parâmetros devem ser determinados antecipadamente para cada tipo celular e corante de fluorescência de interesse.
- Identificar o objeto de rastreamento primário de interesse (o núcleo das células) usando diferentes algoritmos disponíveis no instrumento (óptica - isodados, fixo e triângulo).
- Parâmetros da coleção de imagens
- Caracterização da população e características selecionadas para armazenar
- Uma vez que os vários parâmetros de aquisição são definidos no protocolo de imagem HCS, coloque o sistema HCS no modo de aquisição de dados.
- Os parâmetros de aquisição de imagens para este protocolo foram definidos da seguinte forma: limite de varredura de 1000 células/poço, com exigência mínima de 10 objetos (células) por campo.
NOTA: O número de campos avaliados para cada poço foi determinado com base na contagem final de células atingindo o número 1000. O sistema HCS continua pesquisando vários locais dentro do poço até obter a população-alvo de 1000 células/poço. A velocidade de aquisição depende, portanto, da confluência e do número total de células presentes em cada poço da placa de 96 poços. No protocolo atual, a intensidade total e média do canal 2 (representando os radicais superóxido e a produção total de EROs) foram coletadas de cada poço para análises posteriores a jusante.
- Captura, processamento e análise de imagens
- Após ajustar e finalizar os parâmetros de aquisição da imagem, inicie o processo de digitalização para cada placa de 96 poços.
NOTA: O sistema de geração de imagens Cellomics CX7 permite a triagem de alto conteúdo e a análise automatizada de amostras de uma variedade de parâmetros, incluindo a produção de ROS dentro das células de maneira de alto rendimento. Além da produção de ROS, o sistema HCS é capaz de fornecer informações adicionais valiosas sobre vários parâmetros, como morfologia celular, localização subcelular e muitas outras características celulares de interesse. Uma vez otimizada para aquisição, a plataforma de imagem HCS permite a caracterização abrangente, qualitativa e quantitativa dos parâmetros celulares de forma robusta. - Após a conclusão do processo de digitalização, inicie o software View Analysis e exporte os vários parâmetros de dados quantitativos em um formato .csv para análise adicional.
- Usando software de terceiros, copie e cole os vários valores quantitativos de interesse para análises adicionais a jusante.
NOTA: No protocolo atual, o software GraphPad Prism foi utilizado para analisar os valores de intensidade de DHE em resposta ao estresse oxidativo induzido devido a exposições a H2O2 e menadiona.
- Após ajustar e finalizar os parâmetros de aquisição da imagem, inicie o processo de digitalização para cada placa de 96 poços.
- Dados e análise estatística
- Calcular a intensidade média média do canal 2 (representando os valores totais de ROS e radicais superóxido).
OBS: Todos os experimentos para cálculo dos valores de intensidade foram repetidos três vezes com 6 repetições por condição em cada nível de dosagem. - Realizar ANOVA unidirecional ou teste t para medir as diferenças nos valores de intensidade entre várias condições de teste.
- Calcular a intensidade média média do canal 2 (representando os valores totais de ROS e radicais superóxido).
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Representative Results
Diidroetídio (DHE) é um corante de fluorescência responsivo a superóxidos que fornece informações específicas sobre os estados de ROS intracelulares. O corante DHE emite intrinsecamente fluorescência azul no citoplasma. Entretanto, ao interagir com radicais superóxido, é transformado em 2-hidroxietídio, que emite fluorescência nos comprimentos de onda vermelho (>550 nm) (Figura 1). O corante DHE é facilmente transportado para as células e o núcleo. A fluorescência emitida pode ser visualizada com uma configuração de microscopia de fluorescência comumente disponível em muitos laboratórios. No presente estudo, a utilidade do corante DHE em múltiplas linhagens celulares de carcinoma hepatocelular - HUH7, JHH4 e HepG2 como sonda de geração de espécies de ROS foi testada em uma plataforma de triagem de alto conteúdo. As células foram tratadas com dois agentes geradores de ROS - (a) peróxido de hidrogênio e (b) menadione por 30 min de forma dose-dependente (ver Figura 2 e Figura 3 para detalhes da dosagem) para induzir estresse oxidativo nas células, seguido de marcação do corante DHE em uma placa de 96 poços. Tanto a H2O2 quanto a menadione aumentaram drasticamente a intensidade da fluorescência nas três linhagens celulares de forma dose-dependente. Usando os algoritmos de segmentação e quantificação de imagens dentro da plataforma de triagem de alto rendimento, a intensidade da fluorescência de DHE induzida por ROS foi quantificada em 1000 células por poço em seis réplicas. Três réplicas independentes foram medidas, e os resultados foram agregados e analisados. A coloração nuclear Hoechst 33342 desempenha um papel importante na identificação do plano em que as células aderentes estão presentes em cada poço. Além disso, a fluorescência 2-OH-E+ e E+ pode ser detectada no núcleo e no citoplasma das células testadas, respectivamente, na plataforma de triagem de alto rendimento (ver Figura 4).
A exposição a H2O2 resultou em um incremento estatisticamente significativo da fluorescência induzida por ROS em todas as linhagens celulares analisadas de maneira dose-dependente (ver Figura 2; painel inferior). No entanto, tal resposta dose-dependente não foi observada no caso de exposições à menadiona. Com menadiona, a linhagem celular JHH4 mostrou um incremento dose-dependente na intensidade fluorescente, enquanto nas linhagens HepG2 e HUH7, uma diferença significativa na intensidade da fluorescência foi observada apenas nas concentrações mais altas de menadione (ver Figura 3; painel inferior). Essas diferenças nas respostas de geração de ERO podem ser devidas aos mecanismos distintos de produção de ERO deH2,O2 e menadiona. Enquanto a H2O2 desencadeia a formação de ERO nas células de forma mais direta (por exemplo, através da ação de enzimas antioxidantes como peroxidases e catalases), hipotetiza-se que a menadione gere espécies de ROS de forma indireta através da disfunção mitocondrial induzida. Devido ao mecanismo indireto de produção de ROS, a fluorescência do DHE pode exigir mais tempo para se manifestar com menadiona. Esses achados indicam que a fluorescência de DHE dependente de ROS é sensível à duração das exposições ao estresse oxidativo, concentração e tipos celulares. A otimização do protocolo experimental para cada tipo celular único é, portanto, uma obrigação. Mais importante, este protocolo demonstra a viabilidade do uso do corante DHE como um agente de detecção de ROS de uma maneira de alto rendimento, que é de uso em áreas como toxicologia, biologia do câncer e rastreamento de drogas.
Figura 1: Esquema ilustrativo das vias de conversão oxidativa da molécula de fluorescência do DHE em 2-hidroxietídio (2-OH-E+) e etídio (E+), respectivamente. Os espectros de emissão de fluorescência de 2-OH-E+ e E+ se sobrepõem a uma excitação de 480 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O tratamento com peróxido de hidrogênio aumenta os níveis intracelulares de ERO de forma dose-dependente. Células de carcinoma hepatocelular - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 foram tratadas com H2O2 nas doses de 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM por um período de 30 min. As células foram coradas com DHE (10 μM) em meio de cultura por mais 30 min, seguido de coloração nuclear Hoechst 33342. Um total de 1000 células foi contado em cada poço. Um aumento linear, dose-dependente na fluorescência DHE é observado em todas as três linhas celulares (painel superior). Aumentos estatisticamente significativos na fluorescência são vistos em todas as linhagens celulares para dosagem de 500 μM e acima (painel inferior). Cada conjunto de dados é uma média de seis repetições em uma placa de 96 poços obtida de três experimentos independentes (n = 3). As condições de tratamento foram comparadas com amostras não tratadas usando um teste ANOVA one-way (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra de escala de imagem - 50 μm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O tratamento com menadione aumenta os níveis intracelulares de ERO de forma dose-dependente. Células de carcinoma hepatocelular - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 foram tratadas com menadione nas doses de 25 μM, 50 μM, 75 μM e 100 μM por um período de 30 min. As células foram coradas com DHE (10 μM) em meio de cultura por mais 30 min, seguido de coloração nuclear Hoechst 33342. Um total de 1000 células foi contado em cada poço. Um aumento linear, dose-dependente na fluorescência DHE é observado em todas as três linhas celulares (painel superior). Aumentos estatisticamente significativos na fluorescência são observados consistentemente para a dose máxima (100 μM; painel inferior). Observa-se variabilidade para as doses restantes de menadione em diferentes linhagens celulares (JHH4 > HUH7 > HepG2). Cada conjunto de dados é uma média de seis repetições em uma placa de 96 poços obtida de três experimentos independentes (n = 3). As condições de tratamento foram comparadas com amostras não tratadas usando um teste ANOVA one-way (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra de escala de imagem - 50 μm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fluorescência DHE de célula única - Uma visão de perto das alterações de fluorescência DHE observadas após o tratamento com (A) peróxido de hidrogênio e (B) menadione por uma duração de 30 min. Alterações citoplasmáticas e nucleares da fluorescência do DHE são observadas nas diferentes células. A máscara de segmentação automática gerada pela plataforma de triagem de alto conteúdo também é vista. Barra de escala da imagem - 10 μm. Ampliação - 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Imagem de fluorescência DHE impulsionada por superóxido em resposta ao peróxido de hidrogênio. Células de carcinoma hepatocelular - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 foram tratadas com H2O2 nas doses de 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM por um período de 30 min. As células foram então coradas com DHE (10 μM) em meios de cultura por mais 30 min. Posteriormente, as células foram iluminadas com LED de 386 nm, e imagens de fluorescência coletadas a >560 nm. Nenhuma contracoloração nuclear foi feita para evitar cross-talk espectral. Um aumento dose-dependente na fluorescência DHE é observado em doses > 500 μM. Espera-se que a fluorescência DHE iluminada por UV seja devida à maioria da produção de radicais superóxido. Cada conjunto de dados é uma média de seis repetições em uma placa de 96 poços obtida de dois experimentos independentes (n = 2). As condições de tratamento foram comparadas com amostras não tratadas usando uma ANOVA one-way (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra de escala de imagem - 50 μm) Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Imagem de fluorescência DHE impulsionada por superóxido em resposta à menadione - Células de carcinoma hepatocelular - (A) HUH7, (B) JHH4 e (C) HepG2 foram tratadas com menadione nas doses de 25 μM, 50 μM, 75 μM e 100 μM por um período de 30 min. As células foram então coradas com DHE (10 μM) em meios de cultura por mais 30 min. Semelhante ao peróxido de hidrogênio, um aumento dose-dependente na fluorescência de DHE foi observado. Cada conjunto de dados é uma média de seis repetições em uma placa de 96 poços obtida de dois experimentos independentes (n = 2). As condições de tratamento foram comparadas com amostras não tratadas usando uma ANOVA one-way (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; barra de escala de imagem - 50 μm) Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Neste estudo, um protocolo para avaliar a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares impulsionadas por superóxido usando corante de fluorescência diidroetídio (DHE) foi estabelecido em um sistema de triagem de alto conteúdo. A maioria dos protocolos atuais disponíveis na literatura utiliza a DCFH-DA como sonda de imagem de fluorescência para quantificar espécies de ROS. No entanto, vários estudos têm demonstrado que a DCFH-AD não é uma sonda ideal para a mensuração de ERO intracelular. Várias razões postuladas para a inadequação da DCFH-DA como sonda incluem - (i) DCFH-DA não exibe uma reação direta com H2O2, o que a torna um corante inadequado para avaliar o nível intracelular de H2O2. (ii) Várias espécies oxidantes de um elétron, como OH., NO2., e ONOO-, oxidam DCFH a DCFH. (iii) metais de transição, citocromo c e heme peroxidase podem promover a oxidação de DCFH na presença de oxigênio e H2O2. (iv) Mais importante, DCFH-DA produz o produto intermediário DCFH.- / DCF., que, na presença de oxigênio, induz a produção de superóxido adicional. A dismutação com O2.- gera H2O2 adicionais, o que pode resultar em um aumento artifactual da intensidade da fluorescência e níveis erroneamente elevados de EROs. Vários autores têm considerado o uso de DCFH-DA como uma sonda fluorescente não confiável para a detecção de H2O2 intracelular e outras espécies de ROS 8,9,10,11,12,13,14.
Em contraste com a DCFH-DA, DHE reage especificamente com o radical superóxido, levando à geração de um produto fluorescente, o 2-hidroxietídio (2-OH E+). Espécies de ROS não-superóxido também podem reagir com DHE para gerar um segundo produto fluorescente, o etídio (E+). Enquanto os espectros de fluorescência de 2-OH-E+ e E+ são relativamente semelhantes, essas duas moléculas representam os produtos finais das interações específicas entre as espécies de ROS intracelulares e DHE e são responsáveis pela intensidade total de fluorescência observada dentro das células devido ao estresse oxidativo. Alguns estudos indicam que a excitação seletiva em comprimentos de onda mais curtos da faixa UV (<400 nm) pode ser mais específica para a excitação com 2-OH etídio (em oposição ao E+) e, portanto, para a produção do radical superóxido 7,12,14. Isso foi avaliado excitando-se as células apenas com luz LED de 386 nm. Em relação à excitação do comprimento de onda de 480 nm, uma intensidade reduzida de emissão foi observada no comprimento de onda de 560 nm (ver Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2). No entanto, não se pode ter certeza de que isso se deva exclusivamente à fluorescência do 2-OH Ethidium isoladamente e represente uma falha potencial da abordagem atual. Outros estudos mostraram que a excitação UV (por exemplo, 386 nm) também pode resultar em emissão simultânea de fluorescência de etídio, embora em níveis mais baixos em comparação com o 2-OH etídio7,15. Independentemente disso, nosso protocolo estabelece DHE como uma melhor alternativa de corante para medir as diferenças quantitativas da maioria da produção intracelular de ERO usando um sistema de imagem e triagem de alto conteúdo.
Postula-se que a falta de drivers intermediários de geração de ERO (como os observados na DCFH-DA) seja uma grande vantagem no uso de DHE para avaliar a produção intracelular de ERO. No entanto, este mecanismo de fluorescência DHE ainda não está firmemente estabelecido. Nos casos em que a quantificação precisa dos níveis de ROS é necessária, recomenda-se o uso de métodos ortogonais adicionais de validação quantitativa, como HPLC e/ou cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) para estimar com precisão os níveis de 2-OH-E+ dentro das células 8,9,13. Entretanto, deve-se estar ciente de que os métodos HPLC e LC-MS envolvem necessariamente agregação e solubilização das células para avaliação. Assim, a informação espaço-temporal codificada em um método de imagem baseado em fluorescência, como no protocolo atual, seria perdida em HPLC e LC-MS e representa uma grande vantagem dos métodos de avaliação de ROS baseados em imagem. Uma vantagem adicional da fluorescência deslocada para o vermelho do DHE é que a luz de comprimento de onda mais longo (em vermelho) é menos tóxica para as células devido à menor energia transportada pela luz vermelha.
A natureza dose-dependente da fluorescência do DHE para medir as alterações relativas das ROS intracelulares foi testada usando menadione e peróxido de hidrogênio como indutores de estresse oxidativo. Menadione e peróxido de hidrogênio foram escolhidos como substâncias teste devido aos mecanismos variáveis de geração de ERO e estresse oxidativo20,21. Enquanto a produção de ERO devido à exposição à menadione é indireta (através da disfunção mitocondrial), a H2O2 produz estresse oxidativo de maneira mais direta. O aumento das concentrações de menadione levou ao aumento da produção de fluorescência de DHE de forma linear, repetível e dose-dependente. Assim como a menadiona, a H2O2 é um conhecido indutor de EROs, capaz de gerar radicais hidroxila (OH) através da química de Fenton de forma direta22. Uma resposta linear e dose-dependente foi similarmente observada na fluorescência de DHE devido à exposição a H2O2. Devido à seletividade do DHE para o radical superóxido especificamente, ele não reage diretamente com o H2O2. Em vez disso, os radicais superóxidos intracelulares produzidos inicialmente reagem com H2O2 para formar espécies secundárias de ROS, como radicais hidroxi através das reações de Haber-Weiss e Fenton, que são então detectadas por fluorescência DHE23. O espectro de emissão de fluorescência do DHE em resposta a duas substâncias oxidantes diferentes, medindo a maioria da produção intracelular de EROs, está estabelecido no protocoloatual8,13. Estes resultados estabelecem a utilidade do corante fluorescente DHE como uma melhor alternativa para a detecção e quantificação dos níveis de ROS intracelular usando abordagens de triagem de alto rendimento.
A seletividade, sensibilidade e propriedades ópticas superiores do DHE o tornam uma alternativa valiosa para investigar a produção de ROS e danos oxidativos de uma maneira de alto rendimento, conforme estabelecido no protocolo atual. Estudos futuros em nosso laboratório explorarão o papel do DHE como um marcador de ROS na reatividade cruzada entre ROS e mecanismos de sinalização celular sob várias condições fisiológicas e patológicas em um cenário de alto rendimento.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Acknowledgments
RK e RRG foram apoiados por uma bolsa do UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) através da bolsa P20 do NIH NIGMS GM130422. O RRG foi apoiado por um prêmio piloto da bolsa NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. O suporte ao núcleo de imagem para o instrumento CX7 Cellomics foi fornecido por meio dos núcleos do centro AIM financiados pelo NIH grant P20GM121176. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sharina Desai e ao Dr. Li Chen por sua inestimável assistência com questões técnicas relacionadas ao uso da plataforma de imagem CX7 Cellomics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
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