Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد
Summary
وصفت وسيلة سريعة لإجراء immunostaining القلب الجنينية الزرد. بالمقارنة مع نهج جبل immunostaining كله ، هذا الأسلوب يزيد بشكل كبير من انتشار الأجسام المضادة ، والذي يسمح بالحصول على صور عالية الدقة التي تكشف عن الهياكل الخلوية / التحت خلوية في القلب في غضون فترة زمنية أقل بكثير التجهيز.
Abstract
الزرد الجنين تصبح شعبية في الفقاريات نموذج الجسم الحي لدراسة التنمية القلب وأمراض القلب البشري بسبب علم الأجنة وعلم الوراثة لها فائدة 1،2. حوالي 100-200 الأجنة متوفرة في كل أسبوع من زوج واحد من السمك الكبار. الأجنة الشفافة التي وضع الرحم السابقين يجعلها مثالية لتقييم عيوب القلب 3. ويمكن التلاعب بها على التعبير عن أي الجينات عبر تقنية الحمض النووي الريبي morpholino أو الحقن 4. علاوة على ذلك ، لقد ولدت قدما شاشات الوراثية بالفعل قائمة من المسوخ التي تؤثر على وجهات نظر مختلفة لتخلق القلب 5.
جبل immunostaining كله هو أسلوب هام في هذا النموذج الحيواني للكشف عن نمط التعبير عن هذا البروتين إلى الأنسجة المستهدفة خاصة 6. ومع ذلك ، فقد كانت الصور ذات الدقة العالية التي يمكن أن تكشف عن الهياكل الخلوية أو التحت خلوية الصعبة ، ويرجع ذلك أساسا إلى locat البدنيةايون القلب وتغلغل الفقيرة من الأجسام المضادة.
هنا ، نقدم طريقة لمعالجة هذه الاختناقات التي تشريح قلبية للمرة الأولى وإجراء عملية التلوين ثم على سطح شريحة المجهر. لمنع فقدان العينات الصغيرة والقلب لتسهيل التعامل مع حل ، ونحن يقتصر عينات القلب ضمن دائرة على سطح المجهر الشرائح التي رسمها قلم immEdge. بعد التلوين ، ويمكن للاشارات مباشرة عن طريق الملاحظة مضان المجهر المركب.
لدينا وسيلة جديدة تحسن كبير في اختراق للأضداد ، لأن القلب من الأسماك الجنينية يتكون فقط من طبقات الخلايا قليلة. ويمكن الحصول على صور ذات جودة عالية من قلوب سليمة ضمن الموكب الكثير من الوقت لخفض الأجنة الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين يوم 2 إلى 6 أيام. يمكن أن يكون لدينا وسيلة لتمديد يحتمل صمة تشريح الأجهزة الأخرى سواء من الزرد أو الحيوانات الصغيرة الأخرى.
Protocol
Discussion
بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية كلها immunostaining جبل ، لدينا وسيلة لديه المزايا التالية. أولا ، يمكن الفلورسنت أقوى بكثير الإشارات التي تم الحصول عليها باستمرار نظرا لتغلغل المحسنة. في أسلوب جبل immunostaining كله ، وأنسجة الجلد الكثيفة المحيطة القلب إلى خفض كبير في اختراق ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Beninio Jomok لمساعدته في تربية الزرد. ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL81753.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
