Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra
Summary
Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.
Abstract
Embrión de pez cebra se convierte en un popular modelo de vertebrados vivo para el estudio de desarrollo cardiaco y las enfermedades del corazón humano, debido a su ventajosa embriología y la genética 1,2. Unos 100-200 embriones están disponibles todas las semanas de un par de peces adultos. Los embriones transparentes que se desarrollan fuera del útero lo hacen ideal para la evaluación de defectos cardíacos 3. La expresión de cualquier gen pueden ser manipulados a través de la tecnología morpholino o ARN de inyección 4. Por otra parte, hacia las pantallas de genética ya han generado una lista de mutantes que afectan a las diferentes perspectivas de la cardiogénesis 5.
Toda la inmunotinción de montaje es una técnica importante en este modelo animal para revelar el patrón de expresión de la proteína dirigida a un determinado tejido 6. Sin embargo, las imágenes de alta resolución que pueden revelar las estructuras celulares o subcelulares han sido difíciles, debido principalmente a la física location del corazón y de la escasa penetración de los anticuerpos.
A continuación, presentamos un método para hacer frente a estos cuellos de botella mediante la disección de corazón y luego llevar a cabo el proceso de tinción de la superficie de un portaobjetos de microscopio. Para evitar la pérdida de las muestras de corazón pequeño y para facilitar el manejo de la solución, que limita las muestras de corazón dentro de un círculo en la superficie del portaobjetos dibujado por una pluma immEdge. Después de la tinción, las señales de fluorescencia puede ser observada directamente por un microscopio compuesto.
Nuestro nuevo método mejora significativamente la penetración de los anticuerpos, ya que un corazón de un pez de embriones sólo se compone de capas de células de unos pocos. Imágenes de alta calidad de los corazones intactos se pueden obtener en un plazo muy reducido para la procesión de embriones de pez cebra edades comprendidas entre los día 2 al día 6. Nuestro método puede ser potencialmente extenderse a otros órganos disecados mancha de cualquiera de pez cebra y otros animales pequeños.
Protocol
Discussion
En comparación con los métodos clásicos de todo el montaje inmunoticción, nuestro método tiene las siguientes ventajas. En primer lugar, mucho más fuertes señales fluorescentes pueden ser obtenidos consistentemente, debido a una mejor penetración. En el método de tinción de montaje conjunto, el denso tejido de la piel que rodea el corazón reduce significativamente la penetración de muchos anticuerpos, lo que resulta en el fondo de alto en todo el cuerpo. Este problema es especialmente grave para los embrione…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Beninio Jomok por su ayuda en la cría de pez cebra. Este trabajo está financiado por el NIH HL81753.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
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