해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining
Summary
zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.
Abstract
Zebrafish의 배아는 심장 개발과 유리 발생학 및 유전학 1,2으로 인해 인간의 심장 질환을 공부에 대한 생체내의 척추 모델의 인기가됩니다. 약 100-200 배아는 성인 물고기 한 쌍의에서 매주 쉽게 사용할 수 있습니다. 예 utero을 개발 투명 태아는 심장 결함에게 3 평가에 이상적합니다. 어떤 유전자의 표현은 morpholino 기술 또는 RNA 사출 사를 통해 조작하실 수 있습니다. 또한, 앞으로 유전자 스크린은 이미 cardiogenesis 5 가지 관점에 영향을 미칠 돌연변이의 목록을 생성합니다.
전체 마운트 immunostaining는 특정 조직 6 타겟 단백질의 표현 패턴을 나타내기 위해이 동물 모델에서 중요한 기술입니다. 그러나, 세포 또는 subcellular 구조를 확인할 수 있습니다 고해상도 이미지는 실제 locat으로 인해 주로 어려운되었습니다마음과 항체의 가난한 들어간 이온.
여기, 우리가 먼저 마음을 해부 다음 현미경 슬라이드의 표면에 얼룩 과정을 실시하여 이러한 병목 현상을 해결하기 위해 방법을 제시한다. 작은 마음이 샘플의 손실을 방지하기 위해 및 솔루션 처리를 촉진하기 위해, 우리는 immEdge 펜으로 그려진 현미경의 표면 슬라이드에 동그라미 안에 심장 샘플을 제한. 얼룩 후, 형광 신호를 직접 복합 현미경으로 볼 수 있습니다.
배아 물고기의 마음은 몇 가지 세포 레이어로 구성되어부터 새로운 방법, 항체에 대한 침투를 상당히 향상시킵니다. 그대로 마음의 고품질 이미지는 일 2 일 6 세 zebrafish 배아에 대해 훨씬 감소 행렬 시간 내에 얻을 수 있습니다. 우리의 방법은 잠재적으로 zebrafish이나 다른 작은 동물 중 하나에서 해부하는 다른 장기를 얼룩이 확장될 수 있습니다.
Protocol
Discussion
고전 온 마운트 immunostaining 방법에 비해, 우리의 방법은 다음과 같은 장점이있다. 첫째, 훨씬 강한 형광 신호를 지속적으로 개선 침투력으로 인해 얻을 수 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 방법에서 마음을 둘러싼 치밀한 피부 조직이 상당히 전신 높은 배경의 결과로, 많은 항체의 침투를 감소. 이 문제는 3 일 후 수정 (dpf)보다 오래된 배아에 특히 심각합니다. 반대로, 해부하는 마음은 훨씬 더 침…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 zebrafish 축산 그의 도움 Beninio Jomok 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH HL81753으로 후원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
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