Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün
Summary
Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.
Abstract
Zebra balığı embriyo kalp gelişimi ve avantajlı embriyoloji ve genetik 1,2 nedeniyle insan kalp hastalıkları eğitimi için in vivo omurgalı modeli popüler bir hale gelir. Hakkında 100-200 embriyolar tek bir yetişkin balık çifti her hafta hazır. Eski utero geliştiren şeffaf embriyolar kalp kusurları 3 değerlendirmek için ideal. Herhangi bir gen ifadesi morfolino teknoloji veya RNA enjeksiyon 4 üzerinden manipüle edilebilir . Ayrıca, ileri genetik ekranlar zaten cardiogenesis 5 farklı bakış açılarını etkileyen mutant bir liste yarattı.
Tüm montaj immün bu hayvan modelinde belli bir doku 6 hedeflenen protein ifade desenini ortaya çıkarmak için önemli bir tekniktir. Ancak, hücre içi veya hücre yapıları ortaya çıkarabilir yüksek çözünürlüklü görüntüleri, özellikle fiziksel locat nedeniyle olarak zor olmuşturkalp ve antikorların zayıf penetrasyon iyon.
Burada, ilk kalp diseksiyon ve sonra bir mikroskop lamı yüzey boyama işlemi yapan bu darboğazları gidermek için bir yöntem sunar. Küçük kalp örneklerinin kaybını önlemek için ve çözüm kullanımını kolaylaştırmak için, bir immEdge kalem ile çizilmiş mikroskop slaytlar yüzey üzerinde bir daire içinde kalp örnekleri kısıtlı. Boyama sonra, floresan sinyalleri doğrudan bir bileşik mikroskop ile gözlemlenebilir.
Embriyonik bir balık kalp sadece birkaç hücre tabakalarından oluşan antikorları için yeni bir yöntem, penetrasyon önemli ölçüde artırır. Sağlam kalpleri yüksek kaliteli görüntüler gün 2 gün 6 yaş Zebra balığı embriyolarının için çok daha alayı süre içinde elde edilebilir. Bizim metodumuz, potansiyel olarak diğer organlara ya da Zebra balığı veya diğer küçük hayvanlar disseke leke uzatılabilir.
Protocol
Discussion
Klasik tüm montaj immün yöntemleri ile karşılaştırıldığında, yöntem, aşağıdaki avantajları vardır. Öncelikle, çok daha güçlü floresan sinyalleri sürekli olarak geliştirilmiş penetrasyon nedeniyle elde edilebilir. Tüm montaj immün yöntemi, kalp çevresindeki yoğun cilt dokusu, tüm vücut önemli ölçüde yüksek arka planda birçok antikor penetrasyon azalır. Bu sorun özellikle büyük embriyolar için 3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) şiddetlidir. Disseke kalpleri aksine, sadece çok …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Beninio Jomok Zebra balığı yetiştiriciliği yaptığı yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü, HL81753 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
