Иммуноокрашивание расчлененного данио рерио Эмбриональные сердца
Summary
Быстрый способ проведения иммунной из рыбок данио сердце эмбриональных описано. По сравнению с весь подход иммуноокрашивания гору, этот метод значительно увеличивает проникновение антител, что позволяет получать изображения с высоким разрешением, которые показывают сотовой / субклеточных структур в сердце в течение намного сократить время обработки.
Abstract
Данио рерио эмбрион становится популярным в модельном позвоночных естественных условиях для изучения развития сердечных и человеческих пороков сердца благодаря своему выгодному эмбриологии и генетики 1,2. Около 100-200 эмбрионов легко доступны каждую неделю от одной пары взрослых рыб. Прозрачные эмбрионы, которые развивают бывшие внутриутробно делают их идеальными для оценки пороки сердца 3. Выражением какого-либо гена можно манипулировать с помощью морфолино технологии или РНК инъекций 4. Более того, вперед генетические экраны уже сформирован список мутантов, которые затрагивают различные перспективы cardiogenesis 5.
Всего иммуноокрашивания крепление важная техника в этой животной модели выявить экспрессии целевого белка в определенной ткани 6. Тем не менее, изображения с высоким разрешением, которые могут раскрыть клеточный или субклеточных структур, было трудно, в основном за счет физических нахоионного сердца и бедных проникновение антител.
Здесь мы представляем метод для решения этих узких мест, анализируя сердца, а затем проводят окрашивание процесс на поверхности стекло микроскопа. Для предотвращения потери небольших образцов сердце и облегчить решение обработки, мы ограничили сердце образцов в круг на поверхности предметные стекла, запряженной immEdge пера. После окрашивания, сигналов флуоресценции можно непосредственно наблюдать соединение микроскопа.
Наш новый метод значительно улучшает проникновение на наличие антител, так как сердце от эмбриональных рыбу только состоит из нескольких слоев клеток. Высокое качество изображения с нетронутыми сердца могут быть получены в значительно снижается процессия время для рыбок данио эмбрионов в возрасте от 2-й день за днем 6. Наш метод может быть потенциально распространяться на другие органы пятно расчлененный либо из рыбок данио или других мелких животных.
Protocol
Discussion
По сравнению с классическими методами иммунной целом горе, наш метод имеет следующие преимущества. Во-первых, гораздо сильнее, флуоресцентные сигналы могут быть последовательно получены благодаря улучшению проникновения. В целом метод иммунной горы, плотной ткани кожи вокруг сердца ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Beninio Jomok за помощь в данио хозяйства. Эта работа финансируется NIH HL81753.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
