Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart
Summary
Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.
Abstract
Zebravis embryo wordt een populair in vivo vertebrate model voor het bestuderen van ontwikkeling van het hart en het menselijk hart-en vaatziekten als gevolg van de gunstige embryologie en genetica 1,2. Ongeveer 100-200 embryo's zijn verkrijgbaar elke week vanaf een enkel paar van de volwassen vissen. De transparante embryo's ex utero ontwikkelen maken ze ideaal voor de beoordeling van hartafwijkingen 3. De expressie van een gen kan worden gemanipuleerd via morfolino technologie-of RNA-injectie 4. Bovendien, naar voren genetische screens hebben al een lijst van mutanten die verschillende perspectieven van cardiogenese 5 beïnvloeden.
Whole mount immunokleuring is een belangrijke techniek in dit diermodel om de expressie patroon van de beoogde eiwit openbaren aan een bepaald weefsel 6. Echter, hebben een hoge resolutie beelden die kunnen onthullen cellulaire of subcellulaire structuren is moeilijk, vooral als gevolg van de fysieke location van het hart en de slechte penetratie van de antilichamen.
Hier presenteren we een methode om deze knelpunten aan te pakken door het ontleden van het hart en vervolgens het uitvoeren van de kleuring proces op het oppervlak van een microscoop dia. Om het verlies van kleine monsters het hart te voorkomen en om de oplossing te hanteren te vergemakkelijken, beperken wij het hart monsters binnen een cirkel op het oppervlak van de microscoop dia's getrokken door een immEdge pen. Na de kleuring, kan de fluorescentie signalen direct worden waargenomen door een samengestelde microscoop.
Onze nieuwe methode verbetert de penetratie voor antilichamen, want een hart van een embryonale vis slechts bestaat uit enkele cellagen. Beelden van hoge kwaliteit uit intacte hart kunnen worden verkregen binnen een veel lagere processie tijd voor zebravis embryo's de leeftijd van dag 2 tot dag 6. Onze methode kan mogelijk worden uitgebreid naar andere organen ontleed van zowel zebravis of andere kleine dieren vlek.
Protocol
Discussion
In vergelijking met klassieke ganse berg immunokleuringen methoden, onze methode heeft de volgende voordelen. Ten eerste kan veel sterker fluorescerende signalen consequent worden verkregen dankzij de verbeterde penetratie. In de ganse berg immunokleuring methode, de dichte huid weefsel rondom het hart aanzienlijk verminderd de penetratie van vele antilichamen, wat resulteert in hoge achtergrond in het hele lichaam. Dit probleem is vooral ernstig voor embryo's ouder dan drie-dagen post-bevruchting (DPF). In tegenste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Beninio Jomok voor zijn hulp in de zebravis veehouderij. Dit werk wordt gefinancierd door NIH HL81753.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
