免疫染色的解剖斑马鱼胚胎心脏
Summary
一个快速的方式来进行免疫的斑马鱼胚胎心脏描述。整装免疫方法相比，这种方法大大增加渗透的抗体，这使得获取高分辨率图像，揭示了心脏细胞/亚细胞结构内大幅减少处理时间。
Abstract
斑马鱼的胚胎成为在体内的脊椎动物模型研究心脏发育和人类心脏疾病，由于其优越的胚胎学和遗传学1,2的流行。约100-200胚胎都是现成的，每周从一对成鱼。开发前子宫内的透明胚胎，使他们理想的评估心脏缺陷3。通过吗啉技术或RNA注射4的任何基因的表达可以被操纵。此外，遗传筛选已经产生的突变体，影响不同的角度cardiogenesis 5 。
整个装载免疫组化是一个重要的技术在这种动物模型揭示的目标蛋白质的表达模式，以一个特定的组织 6 。然而，高清晰度的图像，可以揭示细胞或亚细胞结构已经很难，主要是由于物理locat离子的心脏和较差的抗体渗透。
在这里，我们目前通过解剖心脏载玻片表面上，然后再进行染色过程中的一个方法来解决这些瓶颈。为了防止小心脏样品的损失，并促进解决方案的处理，我们限制在一个圆圈上immEdge笔绘制表面的显微镜幻灯片心脏样本。染色后，可直接观察到的荧光信号的复合显微镜。
我们的新方法显着提高抗体的渗透，因为从一个胚胎的鱼心脏只有几个细胞层组成。年龄从2天到6天的斑马鱼胚胎内大幅减少的游行时间从完整的心可以得到高质量的图像。我们的方法可以潜在地扩展到染色无论从斑马鱼或其他小动物解剖的其他器官。
Protocol
Discussion
我们的方法，以经典的整装免疫组化方法相比，具有以下优点。首先，可以始终获得更强的荧光信号由于提高普及率。在整个装载免疫方法，密集的皮肤组织周围的心脏显著减少许多抗体的渗透，在高背景导致整个身体。这个问题严重，特别是对超过3天受精后（DPF）的胚胎。相比之下，解剖心中只由几个细胞层，呈现更好的渗透。其次，由于已大为改善渗透，全过程的免疫可以减少从1天到只有?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢他的帮助在斑马鱼的饲养Beninio Jomok。这项工作是由国立卫生研究院HL81753资助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
Referências
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