Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Published: May 22, 2014 doi: 10.3791/51609
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

Summary

قمة العصبية (NC) الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC) لديها امكانات كبيرة لنمذجة التنمية البشرية والمرض والعلاجات البديلة للخلية. هنا، والتكيف خالية من التغذية للاستخدام على نطاق واسع حاليا

Abstract

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديها امكانات كبيرة لدراسة التطور الجنيني الإنسان، لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان في طبق وكمصدر للخلايا زرع للتطبيقات التجدد بعد المرض أو الحوادث. قمة (NC) الخلايا العصبية هي السلائف لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا الجسدية للبالغين، مثل خلايا من النظام العصبي المحيطي والدبقية، الخلايا الصباغية وخلايا اللحمة المتوسطة. أنها تشكل مصدرا قيما للخلايا لدراسة جوانب التنمية الجنينية البشرية، بما في ذلك تحديد مصير الخلية والهجرة. مزيد من تمايز الخلايا الاصلية NC في أنواع الخلايا المتمايزة عضال توفر إمكانية نمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان في المختبر، والتحقيق في آليات المرض وتوليد خلايا للطب التجديدي. تقدم هذه المقالة التكيف من المتاحة حاليا في المختبر التمايز بروتوكول لاشتقاق خلايا NC من hPSCs. هذا البروتوكول الجديد يتطلب 18 يوما من differentiation، هو، بسهولة وقابلة للتكرار للغاية بين الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) خطوط وكذلك بفعل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط خالية من التغذية. البروتوكولات القديمة والجديدة على حد سواء تسفر عن الخلايا NC الهوية متساوية.

Introduction

وقد أظهرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSC) إمكانات هائلة، وخاصة للتحقيق والعلاج في المستقبل للأمراض البشرية التي لا نماذج حيوانية جيدة ولا الأنسجة الأولية المتاحة. أمثلة التطبيق للتكنولوجيا HESC / hiPSC ما يلي: يمكن أن تتولد خلايا ذات أهمية خاصة من HESC / hiPSCs الطب التجديدي في كمية غير محدودة 1. يمكن أن تنتج الخلايا من المرضى الذين يحملون مرض معين ويستخدم لإنشاء نماذج في المختبر المرض 2،3. ويمكن بعد هذه النماذج المرض استخدامها لفحص المخدرات على نطاق واسع في البحث عن مركبات الدواء الجديد 4 وكذلك اختبار الأدوية الموجودة لفعالية وسمية 5. في المختبر نماذج المرض يمكن أن تؤدي إلى التعرف على آليات المرض الرواية. لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / التوجيهية من المهم للعمل مع محددة وتحديد جيداد أنواع الخلايا المتضررة في هذا المرض من الاهتمام. وبالتالي، فإن توافر في المختبر البروتوكولات تمايز صلبة وقابلة للتكرار أمر بالغ الأهمية لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / hiPSC. البروتوكولات هي من المرغوب فيه أن تظهر الحد الأدنى من التقلبات، حساب الوقت والجهد، وصعوبة وتكلفة، وكذلك استنساخ القصوى بين خطوط HESC / hiPSC والباحثين مختلفة.

قمة العصبية (NC) الخلايا تظهر خلال الفقاريات تكون العصيبة بين البشرة والظهارة العصبية. أنها تتكاثر وتهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين النامية وتؤدي إلى تنوع هائل من أنواع الخلايا ذرية، بما في ذلك العظام / الغضروف، والهيكل العظمي القحفي والأعصاب الحسية، وخلايا شوان، الخلايا الصباغية، وخلايا العضلات الملساء، الخلايا العصبية المعوية، الخلايا العصبية اللاإرادية، والخلايا أليفة الكروم وخلايا القلب الحاجز والأسنان والكظرية / الغدة الدرقية الخلايا الغدية 6. وبالتالي، NC الخلايا هي نوع من الخلايا جذابة للحقل الخلايا الجذعية وهامة لنماذج من مجموعة متنوعة من الأمراض، مثل أمراض هيرشسبرونغ 7، 8 العائلي خلل الوظائف المستقلة، وكذلك السرطانات مثل العصبية 9. وعلاوة على ذلك، فإنها توفر إمكانية لدراسة جوانب التنمية الجنينية البشرية في المختبر.

المتاحة حاليا وتطبيقها على نطاق واسع في المختبر بروتوكول التمايز لاشتقاق خلايا NC من hESCs 10،11 يتطلب ما يصل الى 35 يوما من التمايز وأنها تنطوي على تحريض العصبية في خلايا انسجة المغذية مثل الخلايا MS5 وبالتالي تتم تحت ظروف محددة بشكل واضح. في حين أنه يمكن أن يصل تحجيم لتوليد كميات كبيرة من خلايا NC، على سبيل المثال المطلوبة للالإنتاجية العالية فحص المخدرات 4، وهذا هو العمل المكثف والتكلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي على الركض دليل ريدات العصبية، والتي يمكن أن يكون من الصعب استنساخها وبالتالي يخضع للتقلب بشكل عام، ولا سيما عندما يتم تطبيقه على مجموعة كبيرة ومتنوعة من HESC أو hiPSCخطوط. هنا، يظهر الاشتقاق تدريجي الخلايا NC في بروتوكول 18 يوما التي هي خالية من الخلايا المغذية. هذا الأسلوب هو أقصر وأكثر تحديدا من البروتوكول المستخدم حاليا. وعلاوة على ذلك، فمن قوي جدا في توليد خلايا NC بين خطوط hiPSC مختلفة. الأهم من ذلك، فإنه يظهر أن الخلايا NC التي حققها كلا البروتوكولين الظهور على الحدود بين ريدات العصبية (وهو ما يسمى الآخرة ريدة-NC أو R-NC). الخلايا المشتقة باستخدام أي من البروتوكولين تبدو متطابقة شكليا، فإنها تعبر عن نفسها علامات NC والكتلة معا في تحليل ميكروأري. خلايا NC المستمدة باستخدام البروتوكول الجديد (R-NC) وظيفية، مماثلة لخلايا NC المستمدة باستخدام بروتوكول القديمة (MS5-R-NC) بحيث يمكن ترحيل ومزيد من التمايز إلى خلايا عصبية. وبالتالي، فإن الخلايا يمكن استخدامها في نفس الوقت مع الخلايا MS5-R-NC. سوف بروتوكول الخلية R-NC لاشتقاق خلايا NC من HESC / التوجيهية أن تكون مفيدة لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / التوجيهية التي تنطوي على نسب NC </ ع>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، صحون المغلفة وصيانة hPSCs

إعداد 1.1 وسائل الإعلام

ملاحظة: تصفية جميع وسائل الإعلام في التعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل الى 2 أسابيع. يتم سرد أسماء كاشف والشركة وكتالوج الأرقام في جدول المواد.

  1. DMEM/10٪ FBS: الجمع بين 885 مل DMEM، و 100 مل FBS، 10 مل القلم / بكتيريا و 5 مل L-الجلوتامين.
  2. HES المتوسطة: الجمع بين 800 مل DMEM/F12، KSR 200 مل، 5 مل L-الجلوتامين، 5 مل القلم / بكتيريا، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية، 1 مل β-المركابتويثانول. إضافة 10 نانوغرام / مل FGF-2 بعد تصفية المتوسطة.
    تنبيه: β-المركابتويثانول هي سامة، وتجنب استنشاق، الابتلاع وملامسة الجلد.
  3. KSR-التمايز المتوسطة: الجمع بين 820 مل خروج المغلوب DMEM، 150 مل KSR، 10 مل L-الجلوتامين، 10 مل القلم / بكتيريا، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية و1 مل β-المركابتويثانول.
  4. N2-differentiatiعلى المتوسط: حل 12 غرام مسحوق DMEM/F12 في 980 مل O 2 درهم، إضافة الجلوكوز 1.55 ز، ز 2 بيكربونات الصوديوم و 100 ملغ APO ترانسفيرين الإنسان. خلط 2 مل درهم 2 O مع 25 ملغ الأنسولين البشري و 40 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم، إضافة إلى حل المنحل المتوسط. إضافة 100 ميكرولتر هيدروكلوريد بوتريسين، 60 ميكرولتر زيلونيت، و 100 ميكرولتر البروجسترون وتبرزي حجم ما يصل الى 1 لتر مع DH 2 O.

1.2 طلاء من الأطباق الثقافة

  1. Matrigel طلاء: ذوبان 1 مل تجميد matrigel قسامة من قبل pipetting 19 مل DMEM/F12 على قسامة حتى أنه قد حلت. إزالة كتل بتمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وصفيحة 8 سم ml/10 الطبق. احتضان الأطباق لمدة 1 ساعة على RT. نضح matrigel مباشرة قبل طلاء الخلايا.
    ملاحظة: العمل بسرعة مع matrigel لأنها يمكن أن تتجمع في درجات الحرارة فوق 4 درجات مئوية.
  2. ص / لام / FN طلاء: إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 15 ميكروغرام / مل بولي L Ornithin هيدروبروميد إلى طبق 10 سم. احتضان الطبق أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية. غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني 1X مرة واحدة وإضافة 10 سم ml/10 طبق من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 ميكروغرام / مل الماوس Laminin-I و 2 ميكروغرام / مل فبرونيكتين. احتضان الأطباق أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية. قبل طلاء الخلايا، وإزالة تماما الحل والسماح لوحات يجف تماما على RT لمدة 15-20 دقيقة من خلال الوقوف عليها حتى على زراعة الأنسجة جدار غطاء محرك السيارة من دون غطاء على.
    ملاحظة: الأطباق تجف تماما وجاهزة للطلاء الخلية عند واحد يمكن أن نرى هياكل الكريستال على السطح (مرئية بالعين). يمكن أن تظل لوحات على RT لبضع ساعات في هذه الولاية المجففة. أطباق ص / لام / FN يجب أن يكون مستعدا قبل 2 أيام من الوقت. في الحالات الطارئة يمكن المحتضنة لام / FN لمدة 2-4 ساعة فقط. ومع ذلك، وهذا قد خطر الأمثل نتائج المفاضلة / بقاء.

1.3 صيانة hPSCs

ملاحظة: يتم الاحتفاظ hPSCs على 0.1٪ الجيلاتين والفأر الجنينية الخلايا الليفية المعطل ميتوتيكلي (MEFS) في HES المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل FGF-2 كما هو موضح سابقا 10،12. ينبغي تقسيم الخلايا كل 6-8 أيام.

  1. معطف طبق 10 سم مع 8 مل 0.1٪ الجيلاتين (في برنامج تلفزيوني 1X المغنيسيوم أو الكالسيوم دون) في RT لمدة 5 دقائق.
  2. ذوبان الجليد MEFs المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 ° C. إضافة 1000000 MEFs إلى 10 مل DMEM/10٪ FBS.
  3. نضح الجيلاتين وطبق الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 ساعة.
  4. نضح FBS DMEM/10٪ من لوحة MEF استعداد، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني 1X مرة واحدة وإضافة 10 مل HES المتوسطة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد. تسمح المتوسطة في عملية الاحماء عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: للحصول على تقسيم دليل hPSCs يستخدم غطاء تدفق الصفحي مع مجهر المضمنة. ومع ذلك، فإن الخلايا يمكن passaged باستخدام طرق بديلة مناسبة.
  5. تحت غطاء تدفق الصفحي مع مجهر جزءا لا يتجزأ، فصل المستعمرات منفصلة باستخدام رافعة الخلية والسماح لهم تطفو.
  6. استخدام1 مل حقنة لنضح المستعمرات العائمة وترسلهم على ودافئة لوحة MEF الطازجة. نقل حوالي ربع الخلايا إلى طبق جديد. احتضان عند 37 درجة مئوية.
  7. تغذية الخلايا اليومية مع الطازجة المتوسطة هيس.

2. تصفيح من hPSCs عن التمايز

ملاحظة: ينبغي تقسيم hPSCs أو مطلي لتمايز عندما المستعمرات هي كبيرة، ولكن لا تزال لديها حواف حادة مع أقل قدر ممكن من الخلايا التفريق في حدودها (انظر الشكل 1B). عندما تتم المحافظة على الخلايا باستخدام الركض دليل المستعمرات ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لبسهولة أن ينظر بالعين. للحصول على المظهر المناسب لهذه النقطة مرة واحدة يمكن الحفاظ على طبق hPSC منفصلة لمدة أسبوعين دون الركض ومشاهدة الخلايا الوصول واجتياز نقطة زمنية مثالية للالركض / التفريق بينها.

  1. إعداد أطباق 10 سم مع matrigel 1 ساعة قبل بدء التمايز. نجاح طلاء matrigel يمكن أن يكونالتحقق في 4x والتكبير.
  2. عندما hPSCs جاهزة للتقسيم، ونضح المتوسط ​​وإضافة 4 مل من 0.05٪ التربسين EDTA-إلى الخلايا.
  3. يهز الطبق أفقيا لمدة 2 دقيقة بقوة حتى يمكن للمرء أن يرى MEFs كما الخلايا واحد رفع قبالة لوحة تحت المجهر. تظل المستعمرات hPSC المرفقة بوصفها مستعمرات.
  4. على الفور وبدقة، ونضح التربسين والسماح لوحة الوقوف على RT لمدة 2-4 دقيقة.
  5. إضافة 2 مل من HES المتوسطة على لوحة وباستخدام ماصة P1000، فصل الخلايا.
    ملاحظة: إذا لم يمكن رفع الخلايا من السطح بسهولة، لوحة فارغة يمكن المحتضنة في RT لمدة 2-3 دقائق أخرى.
  6. نقل الخلايا إلى 8 مل HES المتوسطة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد.
  7. نضح matrigel من معدة مسبقا 10 سم الطبق. لوحة الخلايا في 1:1 أو 1:02 نسبة (على سبيل المثال: وتنقسم هذه الخلايا عن بعضها 10 سم الطبق الى قسمين 10 سم الأطباق) على طبق matrigel. احتضان عند 37 درجةمئوية خلال الليل.
    ملاحظة: هذا الطلاء ينبغي أن يؤدي إلى ما يقرب من 100،000 خلية / سم 2.

3. تحريض العصبية التمايز

ملاحظة: يمكن أن يبدأ التمايز (يوم 0) عندما كانت الخلايا 90-100٪ متموجة (انظر الشكل 1C)، وعادة في اليوم التالي. إذا لم يتم التوصل إلى confluency دقيقة حتى الآن، والخلايا ويمكن تغذية يومية مع HES المتوسطة حتى تكون جاهزة للتمايز. بدلا من ذلك، يمكن زيادة العدد الأولي من الخلايا مطلي.

  1. في يوم 0-3، وإطعام خلايا يوميا مع 10 سم ml/10 طبق KSR-التمايز متوسطة تحتوي على 0.1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر LDN193189 SB431542.
  2. في يوم 4 و 5 الأعلاف الخلايا مع 75٪ المتوسطة KSR-التمايز و 25٪ N2-التمايز المتوسطة على حد سواء التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.
  3. في يوم 6 و 7 تغذية الخلايا مع 50٪ المتوسطة KSR-التمايز و 50٪ N2-التمايز المتوسطة على حد سواء التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.
  4. في يوم 8 و 9 تغذية الخلايا مع 25٪ المتوسطة KSR-التمايز و75٪ N2-التمايز المتوسطة على حد سواء التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.
  5. في يوم 9 و 10 إعداد أطباق ص / لام / FN كما هو مبين في 1.2.2 لreplating من الخلايا في يوم 11.
  6. في يوم 10 خلايا تغذية مع N2-التمايز المتوسطة التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.

4. Replating في قطرات للمواصفات NC

  1. في يوم 11 نضح لام / FN من لوحات معدة مسبقا والسماح لهم يجف تماما على RT لمدة 20-30 دقيقة، كما هو موضح في 1.2.2.
  2. إزالة متوسطة من الخلايا التفريق، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 8 مل accutase/10 سم الطبق. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. باستخدام رافعة الخلية، وفصل الخلايا و resuspend لهم في accutase مع ماصة 5 مل. نقل تعليق إلى أنبوب 15 مل.
  4. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X وتدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 114 × ز.
  5. resuspend الخلايا في 10 مل 1س برنامج تلفزيوني. لضمان تعليق خلية واحدة، تصفية لهم من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية ما يعادلها.
  6. تدور أسفل الخلايا و resuspend لهم في N2-التمايز متوسطة تحتوي على 200 حمض الأسكوربيك ميكرومتر (AA)، و 20 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية، و 100 نانوغرام / مل FGF8، 20 نانوغرام / مل SHH، 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد في تركيز 100،000 -150000 cells/10 ميكرولتر.
  7. باستخدام تكرار-pipettor، لوحة 10 قطرات ميكرولتر على مقربة من بعضها البعض دون لمس منهم على PO المجففة / لام / FN 15 سم الأطباق.
    ملاحظة: واحد 10 سم طبق من الخلايا المتمايزة النتائج عادة في حوالي 2-3 مرات 15 سم الأطباق أو ما يقرب من 100 × 10 سم ميكرولتر droplets/15 الطبق.
  8. السماح للقطرات الوقوف على RT لمدة 20-30 دقيقة، ثم بعناية فائقة (عدم تعكير صفو قطرات) إضافة 30 مل من N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y واحتضان عند 37 درجة مئوية.
  9. في يوم 12، وإطعام بعناية الخلايا مع 20 سم ml/15 طبق N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
  10. من داذ 14-17 تغذية الخلايا كل يوم الثاني أو الثالث مع N2/AA/BDNF/FGF8.
  11. في يوم 16 و 17 إعداد ص / لوحات لام / FN لreplate خلايا NC بعد FACS الفرز.

5. الفرز الإسفار المنشط الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من الخلايا NC

ملاحظة: إعداد الخلايا لنظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب ما يقرب من 2 ساعة.

  1. في يوم 18 إزالة المتوسطة، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X في صحن وإضافة 12 مل accutase. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. باستخدام رافعة الخلية، وفصل الخلايا من السطح والسماح لهم تطفو. ماصة الخلايا في التعليق باستخدام ماصة 5 مل، نقلها إلى أنبوب 50 مل و 30 مل من إضافة برنامج تلفزيوني 1X. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 114 × ز.
  3. باستخدام ماصة P1000، resuspend الخلايا في 1 مل من 2٪ FBS / HBSS (في HBSS يحتوي على 15 ملي HEPES). إضافة 19 مل من 2٪ FBS / HBSS وتحديد الخلايا خلال 40 ميكرومتر مصفاة الخلية لضمان تعليق خلية واحدة. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 مترفي لالأضداد الحجب وثم عد لهم باستخدام عدادة الكريات.
  4. تدور أسفل الخلايا و resuspend لهم في تركيز 10 مليون خلية / مل في 2٪ FBS / HBSS.
  5. جانبا 1000000 خلايا لكل من غير ملوثين، واحدة الملطخة (HNK-1 فقط وP75 فقط) والضد الثانوية الملون فقط (APC فقط و 488 فقط) نظام مراقبة الأصول الميدانية تسيطر عليها.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من HNK-1 و 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية P75 لكل 10 مليون خلية في 1 مل تعليق على العينات المناسبة واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  7. غسل الخلايا في 10 مل برنامج تلفزيوني 1X (أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 114 x ج) و resuspend الخلايا في 1 مل 2٪ FBS / HBSS. إضافة 2 ميكرولتر من APC و 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية 488 لكل 10 مليون خلية في 1 مل تعليق على العينات المناسبة واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
    ملاحظة: APC و 488 هي الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هنا لتلطيخ HNK-1 و P75، على التوالي.
  8. غسل الخلايا في 10 مل برنامج تلفزيوني 1X مرتين، في resuspend 10 ملايين الخلايا في 500 ميكرولتر من2٪ FBS / HBSS تحتوي دابي (عند 0.5 نانوغرام / ميكرولتر) أو البديلة وصمة عار الخلية الحية المناسب استبعاد الخلايا الميتة من تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  9. نقل العينات إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة.
  10. إعداد أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 0.5 مل 2٪ FBS / HBSS لجمع الخلية.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ الخلايا وأنابيب جمع على الجليد في الظلام خلال فترة الفرز.
  11. باستخدام آلة الفرز الخلية مع الليزر التي يمكن الكشف عن دابي، APC و 488 نوع DAPI-/HNK-1 + / + P75 خلايا إيجابية مزدوجة.
    ملاحظة: مدة التحضير والتعامل مع الخلايا يؤدي إلى نسبة صغيرة من موت الخلايا والبقع دابي الخلايا الميتة فقط وبالتالي يسمح لهذه الخلايا سيتم استبعادها من السكان فرزها. أي بديل وصمة عار العيش / القتلى يعمل بشكل جيد على قدم المساواة لهذا الغرض. دابي في حد ذاته لا يسبب سمية الخلايا في السكان الخلية الحية.

6. Replating من خلايا الترتيب، الصيانة والتوسع NC

ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا FACS فرز اليدقاد مع عناية خاصة لضمان بقاء الأمثل. ابقائهم على الجليد حتى replating لهم. لا دوامة أو ماصة منهم بقسوة. الخلايا يمكن معلق عبها الأنبوب.

  1. بعد FACS الفرز، عد الخلايا NC، ثم تدور عليهم وresuspend في N2-التمايز المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل FGF2، 20 نانوغرام / مل EGF و 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد في حجم المناسبة لreplate لهم في خلايا 30،000 / 10 قطرات ميكرولتر.
  2. تماما جافة معدة مسبقا PO / لوحات لام / FN وحوالي 50-70 وحة قطرات لكل 10 سم الطبق. السماح للأطباق الوقوف على RT لمدة 20-30 دقيقة.
  3. إضافة بعناية فائقة 20 سم ml/10 طبق من N2/FGF2/EGF/Y-27632 دون إزعاج قطرات. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  4. تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع N2/FGF2/EGF.
    ملاحظة: يتم توسيع الخلايا NC أو passaged كل حوالي 4-5 أيام أو عندما تبدأ تتراكم داخل قطرات.
  5. لمرور الخلايا NC، إزالة المتوسطة، واش خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 8 مل accutase/10 سم الطبق. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. ماصة الخلايا قبالة لوحة باستخدام ماصة 5 مل ونقلها إلى أنبوب 15 مل. إضافة 6 مل برنامج تلفزيوني 1X.
  7. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 114 × ز.
  8. resuspend الخلايا في N2-التمايز المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل FGF2، 20 نانوغرام / مل EGF و 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد من أجل الحصول على 20،000 cells/10 ميكرولتر الحبرية.
  9. Replate الخلايا في 10 ميكرولتر قطرات على لوحات المجففة ص / لام / FN. السماح للأطباق الوقوف على RT لمدة 20-30 دقيقة.
  10. إضافة بعناية ml/10 20 سم طبق من N2/FGF2/EGF/Y-27632. احتضان عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلايا NC يمكن الحفاظ على أو توسيع لتصل إلى 2 أسابيع، كما يبلغ عدد سكانها السلف متجانسة نسبيا. الثقافة تعد قد تؤدي بهم إلى التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا ذرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وهما أهم التحسينات للبروتوكول R-NC عبر بروتوكول MS5-R-NC 11 هي خالية من التغذية، وظروف محددة التمايز وتقصير العام للمتطلبات الوقت. الخلايا المغذية MS5 13 هي نقي العظم خلايا انسجة الفئران المستمدة التي ثبت لدعم التمايز العصبية من hESCs 14. مثقف HESCs على الخلايا المغذية MS5 في كثافة شكل هياكل الظهارية منخفضة وريدات العصبية 15، في محيط الخلايا التي تنشأ NC 10، وبالتالي محاكاة في وقت مبكر العصبية التنمية البشرية. ومع ذلك، فإنه ليس من الواضح ما يشير الجزيئات وعوامل النمو تم إصدارها من الخلايا المغذية MS5. وبالتالي، يتم تعريف سوء الظروف التمايز، مما يجعل من الصعب إعادة إنتاج لها في التجارب المتكررة وعبر خطوط hPSC. لتحريض العصبية كافية، hESCs يجب المصنفة في منخفض الكثافة في مستعمرات صغيرة على خلايا MS5 المغذية، المضاعفاتتينغ الارتقاء والوصول إلى عوائد عالية من الخلايا المتمايزة. في عام 2009، تم تطوير طريقة التي تهدف إلى neuralizing hPSCs بكفاءة عالية 12. في هذه الطريقة هي المصنفة hPSCs في كثافة عالية، في الطبقات الوحيدة في غياب الخلايا المغذية MS5، وتحقيق عوائد عالية للتحريض العصبية في 10 يوما. تابعنا مخطط هذا الأسلوب في التكيف بروتوكول التمايز MS5-R-NC (الشكل 1A). وفرقت HPSCs مثقف في مستعمرات على MEFs (الشكل 1B) والمصنفة على matrigel كما الخلايا واحد في الثقافة أحادي الطبقة ذات الكثافة العالية في (الشكل 1C). في يوم 11 من التمايز، فإن غالبية الخلايا قد neuralized بنجاح (pax6 إيجابية، لا يظهر 12). Replating الخلايا في كثافة عالية في قطرات يسمح تشكيل ريدات العصبية المكثف داخل الحبرية (1D الشكل والشكل 2). خلايا NC تظهر عند حدود ريدات العصبية (الشكل 1D </ STRONG>) وتهاجر من الحبرية (الشكل 1E). بعد 7 أيام من مزيد من الثقافة الخلايا NC يمكن أن تكون معزولة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز. HNK-1/p75 خلايا NC إيجابية مزدوجة يمكن أن تكون معزولة في كفاءة 20-40٪ (الشكل 1F). هذا البروتوكول يتطلب 18 يوما، في حين أن البروتوكول MS5-R-NC يتطلب تصل إلى 35 يوما، مما يجعل الخلية بروتوكول R-NC أكثر فائدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب.

الهدف من هذا العمل هو توليد خلايا NC في، بروتوكول أكثر استنساخه وأرخص أقصر، مما أسفر عن نفس الخلايا كبروتوكول NC القديمة. وقد استخدمنا هذا البروتوكول الجديد للتمييز بنجاح لا يقل عن 10 HESC وhiPSC خطوط المستمدة من المرضى والاصحاء (لا تظهر البيانات)، والتي تبين استنساخ صلبة من بروتوكول عبر خطوط hPSC مختلفة. البروتوكول الجديد يوفر التكاليف بسبب استخدام LDN مقابل رأس، واستخدام أقل من SHH وعدم وجود تكاليف الإنتاج MS5. البروتوكول الجديد يستمر 18 يوما مقابل 35 يوماق في البروتوكول القديم، مما يوفر ما يقرب من 5 رضعات، وبالتالي تكاليف وسائل الاعلام المرتبطة بها. للتحقيق في ما إذا كانت الخلايا المنتجة مع بروتوكولات لهما هوية مماثلة، وتبين لنا أن التنمية في كل خلية NC البروتوكولات يتبع نمط التمايز نفسه (الشكل 2). الخلايا تمر عبر مرحلة ريدة العصبية والخلايا تسفر NC مع التشكل مماثلة بعد FACS الفرز. هو حجم أصغر من ريدات العصبية في البروتوكول الجديد بالمقارنة مع البروتوكول القديم نظرا لكثافة الخلايا عالية بعد replating في يوم 11. في المقابل، في ريدات بروتوكول القديمة تشكل داخل المستعمرات hPSC، والتي ليست كما مكثف. الخلايا المشتقة NC مع البروتوكولين تعبير عن نفس علامات NC البيولوجية، مثل HNK-1، وAP2 nestin. قمنا بتحليل خلايا NC ولدت مع البروتوكولين على مستوى التعبير الجيني العالمي (الشكل 3A) وجدت أن خلايا NC ولدت مع البروتوكولين المجموعة معا بشكل وثيق. NC الخلايا التي كانت جنساعرضت من قبل تيد تفعيل مسار الإشارات WNT (WNT-NC) وإلى لديها القدرة على توليد الخلايا الصباغية 16، الكتلة بشكل منفصل عند تحليلها من قبل التعبير الجيني العالمي، مشيرا إلى أن هذا قد يكون السكان NC مختلفة. في الواقع، كنا غير قادر على توليد خلايا الصباغية السلف في المختبر من R-NC أو MS5-R-NC الخلايا (لا تظهر البيانات). وبالمثل، وخلايا عصبية ظهارية (LSB)، متباينة لمدة 10 يوما في LDN193189 وSB431542 تظهر فقط نمط التعبير الجيني متميزة بشكل واضح. الخلايا الظهارية العصبية هي الأسلاف في وقت مبكر من الجهاز العصبي، وبالتالي فهي أقل متباينة مقارنة مع الخلايا NC وتدرج هنا كما يبلغ عدد سكانها السيطرة السلبية. لتقييم ما إذا كانت الخلايا R-NC لدت هنا تشبه الخلايا المصنوعة من البروتوكول القديم، وتبين لنا قدرة هجرتهم في فحص في المختبر الصفر (الشكل 3B). 48 ساعة بعد الخدش جيدا متموجة من الخلايا R-NC فرزها، والخلايا تهاجر إلى SCRAطشه بنجاح. أخيرا، وتبين لنا أن الخلايا R-NC لديها القدرة على التمايز إلى خلايا من الجهاز العصبي اللاإرادي. الخلايا كانت متباينة بشكل عفوي لمدة 4 أيام آخر HNK1 + / P75 + نظام مراقبة الأصول الميدانية والملون لMash1 وTuj1، الجينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية اللاإرادي (الشكل 3C).

الشكل 1
الشكل 1. خطوات حاسمة في البروتوكول التمايز R-NC. A. MS5-R-NC 10،11 وR-NC مخطط بروتوكول التمايز. وتظهر الخطوات التمايز محددة من البروتوكولين. MS5: الخلايا اللحمية المغذية، KSR: KSR-التمايز المتوسطة، N2: N2-التمايز المتوسطة، LDN: LDN193189، SB: SB431542، S: القنفذ سونيك، 8: FGF8، A: حمض الاسكوربيك، B: B BDNF. يظهر المستعمرات hPSC غير متمايزة ملطخة أكتوبر 4 ودابي قبل تحريض التمايز. C. ويبين كثافة الخلية (90-100٪ confluency) يوم 0 التمايز، وعادة بعد 1 يوم تصفيح hPSCs. د. يظهر ريدات العصبية ملطخة Pax6 والخلايا NC الناشئة ملطخة HNK-1 ضمن الحبرية. E. يظهر يوم 13 الخلايا، replated في يوم 11 في قطرات والخلايا NC الخارجة من حافة الحبرية. F. FACS ممثل الفرز المؤامرة، والتي تبين HNK-1/p75 خلايا NC إيجابية مزدوجة في يوم 18 من التمايز. وقد تم اختيار بوابات على أساس الضوابط الملون غير ملوثين واحد (لا يظهر). FACS الفرز المؤامرات قد تختلف بين التجارب، وخطوط hPSC واستخدام البروتوكول القديم أو الجديد من حيث النسبة المئوية للخلايا إيجابية إيجابية واحدة مزدوجة. وبالتالي، فمن المهم لعزل السكان الإيجابية المزدوجة لضمان استخراج الخلايا NC المناسبة. وقد تم توليد الصور C إلى F باستخدام بروتوكول R-NC جديدة. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" الهدف = "_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. المقارنة العصبية هوية الخلية قمة من الخلايا المشتقة مع MS5-R-NC أو بروتوكول R-NC. وفي كلا البروتوكولين الخلايا تمر عبر مرحلة ريدة العصبية. NC فرز الخلايا تبدو متطابقة عن طريق التشكل والتعبير عن علامات NC مثل HNK-1 و AP2. خلايا NC هي nestin إيجابية، وتبين أنهم الخلايا الاصلية. شريط مقياس: 200 ميكرون. وcounterstained جميع الصور مضان للدابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

r.within صفحة = "دائما"> الرقم 3
الرقم 3. خلايا NC ولدت مع القديم وبروتوكول جديد لديهم هوية مماثلة. A. التجميع غير خاضعة للرقابة من البورشيد ميكروأري بيانات التعبير الجيني مقارنة الخلايا المشتقة NC مع MS5-R-NC وبروتوكول R-NC. وقد تم تحليل الخلايا المشتقة NC مع MS5-R-NC أو بروتوكول R-NC في يوم 35 أو يوم 18 على التوالي في يثلث بواسطة التهجين إلى قليل النوكليوتيد مجموعة البورشيد الإنسان 12. وأجري تحليل البيانات باستخدام برنامج جناح Partek الجينوم. وقد تم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية كتلك مع تغيير أضعاف أكبر من 2 وروزفلت أقل من 0.05. وقد تم تحليل الجينات 1،421. واستخدمت الإعدادات الافتراضية، مثل الاختلاف عينة الإقليدية، طريقة المتوسط ​​العنقودية الربط و 25 لطول dendrogram. تم تضمين الخلايا NC الناجم عن تفعيل الإشارات WNT (WNT-NC) (كانت الخلايا احntiated في يوم LDN193189 0-3، 0-4 يوم SB431542، CHIR99021 يوم 0-11 وFACS فرزها في اليوم 11 لsox10) 16. هذه الخلايا العنقودية بشكل منفصل عن خلايا R-NC، مشيرا إلى أن الخلايا WNT-NC والخلايا R-NC هي السكان متميزة. أدرجت خلايا متباينة لمدة 11 يوما في LDN193189 وSB431542 كعنصر تحكم عصبية ظهارية (LSB). خلايا R-NC وMS5-R-NC المجموعة معا بشكل وثيق مقارنة مع الخلايا السيطرة. هي بيانات التعبير الجيني الخام المتاحة على GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) الانضمام #:. GSE50643 B. فحص الهجرة. فرز HNK1 + / P75 + نظام مراقبة الأصول الميدانية كانت مطلية خلايا R-NC على ص / لام / 96 FN في الآبار وخدش يدويا بعد 24 ساعة. تم التقاط هذه الصورة 0 ساعة مباشرة بعد الخدش وآخر تلطيخ مع هويشت. سمح الآبار المتبقية للهجرة لمدة 48 ساعة قبل اتخاذ الصورة الثانية. شريط مقياس: 200 ميكرون C. سمح فرز الخلايا R-NC التفريق بصورة عفوية لمدة 4 أيام وكانت ملطخة لماSH1، Tuj1 ودابي. شريط مقياس: 500 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتمايز الخلايا ناجحة R-NC من HESC / hiPSCs ينبغي بذل الاعتبارات التالية. فمن الأهمية بمكان أن تعمل في ظل ظروف معقمة الثقافة في جميع الأوقات. على وجه الخصوص، من المهم لاختبار ثقافات hPSC للتلوث الميكوبلازما بشكل منتظم، لأن هذا التلوث سوف تعيق تمايز ناجحة، ولكن لا يمكن بسهولة يتم الكشف عن البصر في الثقافات hPSC. ينبغي الشروع تمايز R-NC في 90-100٪ كثافة الخلية؛ يؤثر انخفاض كثافة الخلايا بقاء الخلية وكفاءة R-NC التمايز. فمن الأهمية بمكان للتحقق من صحة تجريبيا تركيزات الأمثل والكثير أعداد بعض الكواشف، ولا سيما KSR لدعم كفاءة التمايز NC. عندما يتم replated الخلايا في يوم 11 في قطرات، ينبغي أن تكون كثافة الخلية داخل قطرة 10 ميكرولتر عالية ويتم تحديد أفضل تجريبيا. سليم وردة وNC-تشكيل يعتمد على كثافة الخلية المناسبة داخل الحبرية. نحن تجريبيا املالحظاتزيادة VED بقاء الخلية عندما يتم غسل الخلايا مرتين على الأقل بعد العلاج مع accutase. لعزل الخلايا ناجحة R-NC بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية التجريبية الضوابط المناسبة، مثل غير ملوثين، الأجسام المضادة وحيدة الملون والضد الثانوية الخلايا الملون فقط هي الحاسمة. الخلايا الميتة يمكن استبعاد بواسطة دابي، 7-AAD أو يوديد propidium تلطيخ. علاوة على ذلك، التخفيفات الأضداد ينبغي أن تحدد تجريبيا لكل الكثير الأجسام المضادة المحددة. من المهم أن نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية الخلايا R-NC بواسطة تلطيخ مزدوجة مع HNK-1 و P75، منذ تلطيخ واحد قد يؤدي إلى تلوث السكان NC مع أنواع الخلايا غير المرغوب فيها، مثل خلايا الجهاز العصبي المركزي، P75 إيجابية، الأديم المتوسط ​​في وقت مبكر أو اللوحاء. في تجربتنا نسب مزدوجة مقابل السكان الملون واحد يمكن أن تختلف بين خطوط hPSC والتجارب التمايز. ويمكن زيادة R-NC FACS آخر بقاء الخلية عن طريق تجنب pipetting لقاسية من الخلايا، بدلا من الأنبوب عبها على اعادة تعليق الخلايا وينصح. أيضا، والطلاء FACS R-NCوقد تبين الخلايا المعزولة في المتوسط ​​مكيفة (متوسطة تصفية خلايا نمت في قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتحسين البقاء على قيد الحياة 11. فإنه من المستحسن لإجراء التمايز نطاق أصغر بالتوازي التي يمكن ملطخة العصبية الظهارية Pax6 علامة في يوم 11 ويوم 14 لضمان تحييد فعالة وتشكيل ريدة. علامات NC، مثل HNK-1 أو AP2 في مرحلة ريدة لNC التمايز السليم ينبغي تقييم كذلك. وعلاوة على ذلك، ينبغي التحقق من صحة الخلايا R-NC معزولة من قبل التشكل وتلطيخ لعلامات NC، مثل AP2، HNK-1 وnestin (الشكل 2).

وقد وصفت اشتقاق الخلايا MS5-R-NC من hPSC في عام 2007 بواسطة لي وآخرون 10. فقد تبين أن هذه الفئة من السكان السلائف يمكن نشر وزيادة متباينة في المختبر في المشتقات من سلالة NC. خلايا MS5-R-NC يمكن أن تكون متباينة بشكل عفوي باستخدام المجال العصبية الأسلوب 10،17أو عن طريق توجيهها في تمايز المختبر. وقد ثبت أن الخلايا MS5-R-NC يمكن أن تؤدي إلى خلايا الجهاز العصبي المحيطي (الخلايا العصبية الحسية واللاإرادي)، الدبقية الطرفية (خلايا شوان)، myofibroblasts، والخلايا الجذعية الوسيطة وذريتها والعضلات الملساء 10. أظهرت زرع في الفرخ والفئران أن الخلايا MS5-R-NC الهجرة وتفرق في الجسم الحي 10. وكذلك تورط خلايا MS5-R-NC في النمذجة من الأمراض التي تصيب الإنسان. كان على غرار النمط الظاهري مميزة للمرض وراثي عائلي Disautonomia (FD) في المختبر باستخدام محددة المريض hiPSC المستمدة من الخلايا MS5-R-NC 2. عرضت NC الظواهر المميزة، مثل اختلال نمو الخلايا NC والهجرة في الخلايا المشتقة من المرضى FD ولكن ليس في خلايا مراقبة صحية. كما تم استخدام الخلايا MS5-R-NC لإنشاء اختبار السمية للمركبات التي تؤثر على الهجرة خلال قمة العصبية الجنينية البشريةالتنمية، مع القدرة على تجنب الافراج عن المخدرات المستقبلية التي يمكن أن تؤثر سلبا على النمو العصبي 5. تطبيق مثيرة للتكنولوجيا hPSC هو الفرز الفائق الإنتاجية واختبار خيارات العلاج الدوائية لأمراض الإنسان. واستخدمت خلايا MS5-R-NC لإنجاز أول شاشة من هذا القبيل في نموذج الأمراض استنادا التوجيهية، أي خلل الوظائف المستقلة العائلية 4. أدت هذه الشاشة لتحديد المركبات الجديدة التي يمكن زيادة تقييمها في التجارب السريرية.

لجميع التطبيقات من الميدان hPSC فمن الأهمية بمكان أن يكون دقيقة، قابلة للتكرار، وتعريف محددة في بروتوكولات تمايز المختبر المتاحة. في هذا التقرير، نقدم لك مجموعة من التكيف من التمايز في المختبر بروتوكول تأسيس لاشتقاق خلايا R-NC من hPSCs. بروتوكول ذكرت تعطي نفس الخلايا كما ذكرت سابقا 10 في ظروف ثقافة أكثر تحديدا وshorteص الإطار الزمني. ويمكن استخدام هذا البروتوكول على توليد خلايا R-NC لأمراض الإنسان التي تؤثر على خلايا من سلالته NC، لفحص المركبة، اختبار علم السموم ومزيد من بروتوكولات التمايز الموجهة إلى أنواع الخلايا المشتقة من النسب NC التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين متقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، ومن خلال المنح المقدمة من NYSTEM (C026446؛ C026447) ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco-Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
DMEM/F12 Gibco-Life Technologies 11330-032
Knockout Serum Replacement Gibco-Life Technologies 10828-028 Lot should be tested
L-Glutamine Gibco-Life Technologies 25030-081
Penicinlin/Streptomycin Gibco-Life Technologies 15140-122
MEM minimum essential amino acids solution  Gibco-Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol  Gibco-Life Technologies 21985-023 toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2) R&D Systems 233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM Gibco-Life Technologies 10829-018
DMEM/F12 powder  Invitrogen 12500-096
Glucose Sigma G7021
Sodium Bicarbonate  Sigma S5761
APO human transferrin Sigma T1147
Human insulin  Sigma I2643
Putriscine dihydrochloride Sigma P5780
Selenite Sigma S5261
Progesterone Sigma P8783
Matrigel matrix BD Biosciences 354234
Poly-L Ornithin hydrobromide Sigma P3655
Mouse Laminin-I R&D Systems 3400-010-01
Fibronectin BD Biosciences 356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml Stem Cell Technologies 7013
Trypsin-EDTA  Gibco-Life Technologies 25300-054
Y-27632 dihydrochloride Tocris-R&D Systems 1254
LDN193189 Stemgent 04-0074
SB431542 Tocris-R&D Systems 1614
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Ascorbic Acid  Sigma A4034
BDNF R&D Systems 248-BD
FGF8 R&D Systems 423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) R&D Systems 464SH
HBSS Gibco-Life Technologies 14170-112
HEPES Gibco-Life Technologies 1563-080
Human recombinant EGF R&D Systems 236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca) in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM Sigma C6680-100TST lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) Advanced Targeting Systems AB-N07 lot should be tested
APC rat anti-mIgM BD Parmingen 550676 lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1  Invitrogen A21121 lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) Santa Cruz sc-5279 lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) GlobalStem GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2 BD Biosciences 309623
Cell lifter Polyethylene Corning Incorporated 3008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
  7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
  8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
  9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
  10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
  11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
  14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
  15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
  16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
  17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Tags

علم الأعصاب، العدد 87، الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، افرة القوة الخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (iPSCs)، العصبية كريست، الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية)، والخلايا الجذعية المحفزة، والخلايا العصبية قمة،
خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeltner, N., Lafaille, F. G.,… More

Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (87), e51609, doi:10.3791/51609 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter