Feeder-fri Udledning af neurale Crest stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller

Summary

Neuralkam (NC) celler afledt af humane pluripotente stamceller (hPSC) har et stort potentiale til at modellere menneskelig udvikling og sygdom og for celleerstatningsterapier. Her et feeder-fri tilpasning af dag i vid udstrækning

Abstract

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har et stort potentiale for at studere humane embryonale udvikling, til at modellere menneskelige sygdomme i skålen og som en kilde til transplanterbare celler til regenerativ applikationer efter sygdom eller ulykker. Neuralkam (NC)-celler er forløbere for et stort udvalg af voksne somatiske celler, såsom celler fra det perifere nervesystem og glia, melanocytter og mesenchymale celler. De er en værdifuld kilde til celler til at studere aspekter af den menneskelige embryonale udvikling, herunder celle skæbne specifikation og migration. En yderligere differentiering af NC progenitorceller i terminalt differentierede celletyper giver mulighed for at modellere humane sygdomme in vitro, undersøge sygdomsmekanismer og generere celler til regenerativ medicin. Denne artikel præsenterer en tilpasning af et aktuelt tilgængelige in vitro differentiering protokol for afledning af NC-celler fra hPSCs. Denne nye protokol kræver 18 dages forskelrentiation, er feeder-fri, let skalerbar og meget reproducerbar blandt humane embryonale stamceller (hESC) linjer såvel som menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC) linjer. Både gamle og nye protokoller giver NC celler af samme identitet.

Introduction

Humane embryonale stamceller (hESC) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) har vist enorme potentiale, navnlig for undersøgelsen og fremtidige behandling af sygdomme hos mennesker, for hvilke der hverken god dyremodeller eller primære væv er tilgængelige. Applikationseksempler for embryonale / hiPSC teknologi er følgende: Celler af særlig interesse kan genereres fra hESC / hiPSCs for regenerativ medicin ved ubegrænset antal ^1. Celler kan produceres fra patienter bærer en specifik sygdom og bruges til at etablere in vitro sygdomsmodeller ^2,3. Sådanne sygdomsmodeller kan derefter anvendes til storstilet drug screening i søgen efter nye stofblandinger ⁴ samt afprøvning af eksisterende lægemidler til effekt og toksicitet ^5.. In vitro sygdomsmodeller kan føre til identifikation af nye sygdomsmekanismer. For alle anvendelser af embryonale / IPSC teknologi er det vigtigt at arbejde med specifikke, vel-definered celletyper påvirket i sygdommen af ​​interesse. Således er afgørende for alle applikationer i embryonale / hiPSC teknologi tilgængeligheden af faste og reproducerbare in vitro differentiering protokoller. Protokoller er ønskeligt, at vise minimal variabilitet, tid bekostning, indsats, besvær og omkostninger samt maksimal reproducerbarhed blandt embryonale / hiPSC linjer og forskellige forskere.

Neuralkam (NC)-celler der dukker op under hvirveldyr neurulation mellem epidermis og neurale epitel. De formere sig og migrere udstrakt grad i hele embryo under udvikling og giver anledning til en imponerende mangfoldighed af afkom celletyper, herunder knogle / brusk, den craniofacial skelet, følenerver, Schwann celler, melanocytter, glatte muskelceller, enteriske neuroner, det autonome neuroner, kromaffinceller , hjerte-septum celler, tænder og binyre / skjoldbruskkirtlen kirtelceller ^6. Således NC celler er en attraktiv celletype for feltet stamceller og er vigtige formodellering af en række sygdomme, såsom Hirschsprungs sygdom ^7, familiær dysautonomi ⁸ såvel som cancere, såsom neuroblastom ^9. Desuden tilbyder de muligheden for at studere aspekter af den menneskelige embryonale udvikling in vitro.

Den aktuelt tilgængelige og almindeligt anvendt in vitro differentiering protokol for afledning af NC-celler fra hESCs ^10,11 kræver op til 35 dage om differentiering og det indebærer neurale induktion på stroma feederceller såsom MS5 celler og er derfor udføres under dårligt definerede betingelser. Selv om det kan være op-skaleret til at generere store mængder af NC-celler, for eksempel kræves for high-throughput drug screening ^4, dette er arbejdskraft og omkostningskrævende. Desuden indebærer det manuel passage af neurale rosetter, hvilket kan være svært at gengive, og dermed er underlagt samlede variabilitet, især når det anvendes på et stort udvalg af hESC eller hiPSClinjer. Her er den trinvise afledning af NC-celler i en 18-dages-protokol, der er fri for feeder celler vist. Denne metode er kortere og mere defineret end den aktuelt anvendte protokol. Desuden er det meget robust generere NC celler mellem forskellige hiPSC linjer. Vigtigere er det vist, at NC-celler fremkommet ved begge protokoller dukke op ved grænsen af ​​neurale rosetter (herefter betegnet roset-NC eller R-NC). De celler, der stammer enten ved hjælp af de to protokoller ser morfologisk identiske, de udtrykker den samme NC-markører og klynge sammen i microarray analyse. NC-celler afledt ved hjælp af den nye protokol (R-NC) er funktionelle, svarende til NC-celler afledt ved hjælp af den gamle protokol (MS5-R-NC), således at de kan migrere og yderligere differentiere i neuroner. Derfor kan cellerne anvendes samtidig med MS5-R-NC-celler. R-NC celle protokol til afledning af NC-celler fra embryonale / IPSC vil være nyttige for alle applikationer i embryonale / IPSC teknologi involverer NC afstamning. </ P>

Protocol

1.. Udarbejdelse af Kultur Medier, Coated Retter og Vedligeholdelse af hPSCs

Forberedelse 1.1 Medier

Bemærk: Filter alle medier for sterilisation og opbevares ved 4 ° C i mørke i op til 2 uger. Reagensnavne, virksomheds-og katalognumre er opført i Materials tabel.

1. DMEM/10% FBS: Kombiner 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep og 5 ml L-Glutamin.
2. HES-medium: Kombiner 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentielle aminosyrer, 1 ml β-mercaptoethanol. Tilsæt 10 ng / ml FGF-2 efter filtrering mediet.
   ADVARSEL: β-Mercaptoethanol er giftigt, undgå indånding, indtagelse og hudkontakt.
3. KSR differentiering medium: Kombiner 820 ml Knockout DMEM 150 ml KSR 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentielle aminosyrer-opløsning og 1 ml β-mercaptoethanol.
4. N2-differentiatipå medium: Opløs 12 g DMEM/F12 pulver i 980 ml _​​dH2O tilsættes 1,55 g glucose, 2 g natriumhydrogencarbonat og 100 mg APO menneskelige transferrin. Bland 2 ml _dH2O med 25 mg humant insulin og 40 ul 1 N NaOH tilsættes den opløste opløsning til mediet. Tilsæt 100 ul putrescine dihydrochlorid, 60 pi selenit, 100 ul progesteron og bringe lydstyrken op til 1 l med dH ₂ O.

1.2 Overfladebehandling af kultur retter

1. Matrigel coating: Tø 1 ml frossen matrigel portion ved pipettering 19 ml DMEM/F12 over portion, indtil det er opløst. Fjern klumper ved at føre den gennem en 40 um celle si og plade 8 ml/10 cm skål. Inkubér skålene i 1 time ved stuetemperatur. Aspirer matrigel umiddelbart før udpladning af cellerne.
   Bemærk: Arbejd hurtigt med matrigel fordi det kan klumpe ved temperaturer over 4 ° C.
2. PO / Lam / FN-belægning: Tilføj 10 ml 1x PBS indeholdende 15 mg / ml Poly-L Ornithin hydrobromid til en 10 cm skål. Inkuber skålen natten over ved 37 ° C. Pladerne skylles med 1x PBS en gang og tilsæt 10 ml/10 cm skål af 1x PBS indeholdende 2 mg / ml muselaminin-I og 2 ug / ml fibronectin. Inkubér skålene natten over ved 37 ° C. Før plating cellerne helt fjerne væske og lad pladerne tørre grundigt ved stuetemperatur i 15-20 min ved at stå dem op på vævskultur hætte væg uden låg på.
   Bemærk: Retterne er helt tørre og klar til celleudpladning, når man kan se krystalstrukturer på overfladen (synlig med det blotte øje). Pladerne kan opbevares ved stuetemperatur i et par timer i dette tørret tilstand. PO / Lam / FN retter skal være forberedt 2 dage i forvejen. I akutte tilfælde kan Lam / FN inkuberes i kun 2-4 timer. Dette kan dog risikere suboptimale differentiering / overlevelse resultater.

1.3 Vedligeholdelse af hPSCs

Bemærk: hPSCs opretholdes på 0,1% gelatine og mitotisk inaktiverede mus embryonale fibroblaster (MElementærfiler) i HES-medium suppleret med 10 ng / ml FGF-2 som tidligere beskrevet ^10,12. Cellerne bør opdeles hver 6-8 dage.

1. Coat en 10 cm skål med 8 ml 0,1% gelatine (i 1x PBS uden magnesium eller calcium) ved stuetemperatur i 5 min.
2. Optø frosne MEF hurtigt i et 37 ° C vandbad. Tilføj 1 million MEF'er til 10 ml DMEM/10% FBS.
3. Aspirer gelatine og pladen cellerne. Inkuberes ved 37 ° C i mindst 6 timer.
4. Aspirer DMEM/10% FBS fra den forberedte MEF plade vaskes pladen med 1x PBS gang og der tilsættes 10 ml HES-medium suppleret med 10 pM Y-27632 dihydrochlorid. Lad mediet til at varme op ved 37 ° C i 20 min.
   Bemærk: Til manuel opdeling af hPSCs en laminar flow hætte med en indbygget mikroskop anvendes. Imidlertid kan cellerne passeres ved hjælp af passende alternative metoder.
5. Under en laminar flow hætte med en integreret mikroskop, frigøre separate kolonier ved hjælp af en celle løfteren og lad dem flyde.
6. Brug en1 ml sprøjte til at aspirere de flydende kolonier og indsætte dem på den friske, varme MEF plade. Overfør ca en fjerdedel af celler til den ny skål. Der inkuberes ved 37 ° C.
7. Foder celler dagligt med frisk HES medium.

2.. Belægning af hPSCs for Differentiering

Bemærk: hPSCs bør opdeles eller belagt for differentiering, når kolonierne er store, men stadig have skarpe kanter med så lidt som muligt differentierende celler ved deres grænser (se figur 1B). Når cellerne opretholdes ved hjælp af manuelle passaging kolonierne skal være stort nok til nemt at blive set med det blotte øje. For at få den rigtige fornemmelse for dette tidspunkt kan man opretholde en særskilt hPSC skål for to uger uden passage og se cellerne nå og passere den ideelle tidspunkt for passage / differentiere dem.

1. Forbered 10 cm retter med matrigel 1 time, før du starter differentiering. Vellykket matrigel belægning kan væreverificeret ved 4x forstørrelse.
2. Når hPSCs er klar til at blive delt, aspireres mediet, og der tilsættes 4 ml 0,05% trypsin-EDTA til cellerne.
3. Ryst fadet vandret i 2 min kraftigt, indtil man kan se MEF'er som enkeltceller løfte fra pladen under mikroskop. De hPSC kolonier forbliver vedhæftet som kolonier.
4. Omgående og grundigt, opsug trypsin og lade pladen stå ved stuetemperatur i 2-4 min.
5. Tilsæt 2 ml HES-medium til pladen og bruge en P1000 pipette løsne cellerne.
   Bemærk: Hvis cellerne ikke kan løftes fra overfladen let kan pladen inkuberes tom ved RT i yderligere 2-3 min.
6. Overfør cellerne til 8 ml HES-medium suppleret med 10 pM Y-27632 dihydrochlorid.
7. Aspirer Matrigel fra en tidligere fremstillet 10 cm skål. Plate cellerne ved en 1:1 eller 1:2 (for eksempel: Cellerne fra en 10 cm skål er opdelt i to 10 cm skåle) på matrigel plade. Inkuberes ved 37 °C natten over.
   Bemærk: Denne plating bør resultere i cirka 100.000 celler / cm ^2.

3.. Induktion af Neural Differentiation

Bemærk: differentiering kan initieres (dag 0), når cellerne er 90-100% sammenflydende (se figur 1C), sædvanligvis den følgende dag. Hvis nøjagtig konfluens ikke nås endnu, kan cellerne fodret dagligt med HES-medium, indtil de er klar til differentiering. Alternativt kan det oprindelige antal udpladede celler øges.

1. På dag 0 til 3, fodre cellerne dagligt med 10 ml/10 cm parabol KSR-differentiering medium indeholdende 0,1 uM LDN193189 og 10 uM SB431542.
2. På dag 4 og 5. foder cellerne med 75% KSR-differentiering medium og 25% N2-differentiering medium både indeholder LDN193189 og SB431542.
3. På dag 6 og 7 foder cellerne med 50% KSR-differentiering medium og 50% N2-differentiering medium både indeholder LDN193189 og SB431542.
4. På dag 8 og 9 foder cellerne med 25% KSR-differentiering medium og 75% N2-differentiering medium både indeholder LDN193189 og SB431542.
5. På dag 9 og 10 forberede PO / Lam / FN retter som angivet i 1.2.2 for genudpladning af cellerne på dag 11.
6. På dag 10 celler foder med N2-differentiering medium indeholdende LDN193189 og SB431542.

4.. Genudpladning Dråber for NC Specification

1. På dag 11 aspirat Lam / FN fra de tidligere behandlede plader og lad dem tørre helt ved stuetemperatur i 20-30 min, som forklaret i 1.2.2.
2. Fjern medie fra de differentierende celler vaskes cellerne en gang med 1x PBS og tilsæt 8 ml accutase/10 cm skål. Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C.
3. Ved hjælp af en celle løfteren, løsne cellerne og resuspenderes dem i Accutase med en 5 ml pipette. Suspensionen overføres til et 15 ml rør.
4. Der tilsættes 5 ml 1x PBS og spinde cellerne i 5 minutter ved 114 x g.
5. Resuspender cellerne i 10 ml 1x PBS. For at sikre en enkelt celle suspension filtrere dem gennem et 40 um cellefilter og tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer eller tilsvarende teknik.
6. Spin celler ned og resuspender dem i N2-differentiering medium indeholdende 200 uM ascorbinsyre (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 dihydrochlorid i en koncentration på 100.000 -150.000 celler/10 pi.
7. Ved hjælp af en dråber repeat-pipetter, plade 10 gl tæt på hinanden uden at de rører på tørrede PO / Lam / FN 15 cm retter.
   Bemærk: Et 10 cm parabol af differentierede celler, der normalt resulterer i cirka 2-3 gange 15 cm retter eller ca 100 x 10 pi droplets/15 cm skål.
8. Lad dråberne stå ved stuetemperatur i 20-30 minutter, derefter meget forsigtigt (ikke at forstyrre de små dråber) tilsættes 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y og inkuberes ved 37 ° C.
9. På dag 12, omhyggeligt fodre cellerne med 20 ml/15 cm skål N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. Fra day 14-17 fodre cellerne hver anden eller tredje dag med N2/AA/BDNF/FGF8.
11. På dag 16 og 17 forberede PO / Lam / FN-plader til replate NC celler efter FACS sortering.

5.. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af NC-celler

Bemærk: Præparatet af cellerne for FACS kræver ca 2 timer.

1. På dag 18 Fjern mediet, vaske cellerne en gang med 1x PBS i skålen og tilsæt 12 ml Accutase. Inkubér cellerne i 20 minutter ved 37 ° C.
2. Ved hjælp af en celle løfteren, løsne cellerne fra overfladen og lad dem flyde. Pipette cellerne i suspension ved hjælp af en 5 ml pipette, overføre dem til et 50 ml rør, og der tilsættes 30 ml 1x PBS. Spin cellerne i 5 minutter ved 114 x g.
3. Ved hjælp af en P1000 pipette resuspendere cellerne i 1 ml 2% FBS / HBSS (HBSS indeholder 15 mM HEPES). Tilføj 19 ml 2% FBS / HBSS og filtrere celler gennem en 40 um cellefilter at sikre en enkelt celle suspension. Inkubér cellerne på is i 15 mi for antistof blokering og derefter tælle dem ved hjælp af et hæmocytometer.
4. Spin celler ned og resuspender dem i en koncentration på 10 millioner celler / ml i 2% FBS / HBSS.
5. Braklægning 1 million celler hver for ufarvede, single-farvet (HNK-1 kun og p75 only) og sekundært antistof kun farves (APC og kun 488 only) FACS styrer.
6. Tilsæt 5 ul HNK-1 og 5 pi af p75 primære antistof pr 10 millioner celler i 1 ml suspension til de rigtige prøver og inkuberes i 20 minutter på is.
7. Vask cellerne i 10 ml 1x PBS (centrifuge 5 min ved 114 xg) og udeluk cellerne i 1 ml 2% FBS / HBSS. Tilsæt 2 pi APC og 1 pi af 488 sekundært antistof pr 10 millioner celler i 1 ml suspension til den rigtige prøver og inkuberes i 20 minutter på is i mørke.
   Bemærk: APC og 488 er de sekundære antistoffer her anvendes til HNK-1 og p75 farvning hhv.
8. Vask cellerne i 10 ml 1x PBS to gange, resuspenderes 10 millioner celler i 500 pi2% FBS / HBSS indeholdende DAPI (0.5 ng / ul) eller alternativt passende levende cellefarvende at udelukke døde celler fra FACS-analyse.
9. Overfør prøverne til passende FACS-rør.
10. Forbered FACS-rør med 0,5 ml 2% FBS / HBSS for celle samling.
    Bemærk: De celler og opsamlingsrør holdes på is i mørke under sortering tid.
11. Ved hjælp af en celle sortering maskine med lasere, der kan afsløre DAPI, APC og 488 slags DAPI-/HNK-1 + / P75 + dobbelt positive celler.
    Bemærk: Fremstilling tid og håndtering af celler fører til en lille procentdel af celledød, DAPI pletter døde celler kun tillader og dermed for disse celler, der skal udelukkes fra den sorterede population. Enhver alternativ levende / død plet virker lige godt til dette formål. DAPI selv ikke forårsage cytotoksicitet i den levende cellepopulation.

6.. Genudpladning af sorterede celler, NC vedligeholdelse og udbygning

Bemærk: FACS sorteres celler skal håndførte med særlig omhu for at sikre optimal overlevelse. Hold dem på is, indtil genudpladning dem. Undlad at slynge eller pipette dem hårdt. Cellerne kan resuspenderes ved at svirpe røret.

1. Efter FACS sortering, tælle NC celler, og derefter dreje dem ned og resuspender i N2-differentiering medium suppleret med 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF og 10 uM Y-27632 dihydrochlorid i mængden hensigtsmæssigt at replate dem på 30.000 celler dråber / 10 ul.
2. Grundigt tør tidligere forberedt PO / Lam / FN plader og plade ca 50-70 dråber pr 10 cm skål. Lad servicet stå ved stuetemperatur i 20-30 minutter.
3. Meget omhyggeligt tilføje 20 ml/10 cm skål af N2/FGF2/EGF/Y-27632 uden at forstyrre dråber. Inkuberes cellerne ved 37 ° C.
4. Feed cellerne hver 2-3 dage med N2/FGF2/EGF.
   Bemærk: NC celler udvides eller passeres ca hver 4-5 dage, eller når de begynder at hober sig op inden for de små dråber.
5. Til passage NC celler, skal du fjerne mediet, wash cellerne en gang med 1x PBS, og der tilsættes 8 ml accutase/10 cm skål. Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C.
6. Pipettere cellerne fra pladen under anvendelse af en 5 ml pipette, og overføre dem til et 15 ml rør. Tilsæt 6 ml 1x PBS.
7. Spin cellerne i 5 minutter ved 114 x g.
8. Resuspender cellerne i N2-differentiering medium suppleret med 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF, og 10 uM Y-27632 dihydrochlorid for at have 20.000 celler/10 pi dråbe.
9. Replate cellerne i 10 dråber pi på tørrede PO / Lam / FN plader. Lad servicet stå ved stuetemperatur i 20-30 minutter.
10. Derefter tilsættes forsigtigt 20 ml/10 cm skål af N2/FGF2/EGF/Y-27632. Der inkuberes ved 37 ° C.
    Bemærk: NC celler kan opretholdes eller udvides i op til 2 uger som en relativt homogen progenitorpopulationen. Længere kultur kan føre dem til at differentiere til forskellige afkom celletyper.

Representative Results

De to vigtigste forbedringer af R-NC protokollen over MS5-R-NC-protokol ¹¹ er feeder-fri, defineret differentiering forhold og samlet afkortning af den tid krav. MS5 feederceller ¹³ er murine knoglemarv afledte stromaceller der har vist sig at støtte neurale differentiering fra hESCs ^14. HESCs dyrket på MS5 fødeceller ved lave massefylde danner epiteliale strukturer og neurale rosetter ^15, på hvis periferi NC-celler forlader ^10, således efterligne tidlig human neural udvikling. , Men det er ikke klart, hvad signalmolekyler og vækstfaktorer frigives fra MS5 feeder celler. Derfor er differentiering betingelser dårligt defineret, hvilket gør det vanskeligt at gengive dem i tilbagevendende eksperimenter og på tværs hPSC linjer. For tilstrækkelig neural induktion, hESCs skal podes ved lav tæthed i små kolonier på MS5 feederceller, komplikationerTing opskalering og nå høje udbytter af differentierede celler. I 2009 blev der udviklet en metode, der tager sigte på at neuralizing hPSCs meget effektivt ^12. I denne fremgangsmåde hPSCs podes ved høj densitet i monolag i fravær af MS5 fødeceller, at opnå høje udbytter af neural induktion i 10 dage. Vi fulgte ordningen af denne metode med at tilpasse MS5-R-NC differentiering protokol (figur 1A). HPSCs dyrket i kolonier på MEF'er (figur 1B) er dispergeret og podet på Matrigel som enkelte celler i en monolagskultur med høj densitet (figur 1C). På dag 11 af differentiering, har de fleste celler held neuralized (Pax6-positive, ikke vist ^12). Genudpladning cellerne ved høj densitet i dråber tillader dannelsen af kondenserede neurale rosetter i dråben (figur 1D og figur 2). NC celler dukke op ved grænserne af neurale rosetter (figur 1D </ Strong>) og migrere ud af dråben (figur 1E). Efter 7 dages yderligere dyrkning NC-celler kan isoleres ved FACS-sortering. HNK-1/p75 dobbelt positive NC-celler kan isoleres på effektiviteten af 20-40% (figur 1F). Denne protokol kræver 18 dage, mens MS5-R-NC protokollen kræver op til 35 dage, hvilket gør R-NC celle protokol mere anvendelige til en række af efterfølgende anvendelser.

Formålet med dette arbejde er at generere NC celler i en kortere og mere reproducerbar og billigere protokol, hvilket gav de samme celler som den gamle NC-protokollen. Vi har brugt denne nye protokol med succes differentiere mindst 10 hESC og hiPSC linier afledt fra patienter og raske kontroller (data ikke vist), der viser solid reproducerbarhed af protokollen på tværs af forskellige hPSC linjer. Den nye protokol sparer omkostninger på grund af anvendelsen af ​​LDN versus noggin, mindre brug af SHH og manglen på MS5 produktionsomkostninger. Den nye protokol varer 18 dage i forhold til 35 dages i den gamle protokol, hvilket sparer cirka 5 fodringer og dermed deres tilknyttede medier omkostninger. For at undersøge, om cellerne fremstillet med de to protokoller har lignende identitet, viser vi, at NC celleudvikling i begge protokoller følger samme differentiering mønster (figur 2). Cellerne passere gennem et neuralt roset scenen og giver NC celler med identisk morfologi efter FACS sortering. Den mindre størrelse af de neurale rosetter i den nye protokol i forhold til den tidligere protokol skyldes høj celledensitet efter udpladning igen på dag 11. Derimod i gamle protokol rosetter dannes inden hPSC kolonier, som ikke er så kondenseres. NC celler afledt med de to protokoller udtrykker de samme biologiske NC markører, såsom HNK-1, AP2 og nestin. Vi analyserede NC celler genereret med de to protokoller på globalt genekspression niveau (figur 3A) og fandt, at NC-celler er genereret med de to protokoller klynge tæt sammen. NC-celler, der var slægterted ved aktivering af Wnt signalvejen (wnt-NC) og blev vist at have potentiale til at generere melanocytter ^16, klynge separat, når analyseret ved global genekspression, hvilket indikerer, at dette kan være en anden NC befolkning. Faktisk har vi været i stand til at generere melanocyt stamceller in vitro fra R-NC eller MS5-R-NC-celler (data ikke vist). Ligeledes neuroepitelceller (LSB), differentieres for 10 dage i LDN193189 og SB431542 kun vise et klart adskiller sig genekspression mønster. Neuroepitelceller er tidlige stamfædre i nervesystemet, og dermed er mindre differentieret i forhold til NC-celler og indgår her som en negativ kontrol befolkning. For at vurdere, om de R-NC-celler genereret her ligner de celler, lavet med den gamle protokol, viser vi deres migration kapacitet i en in vitro scratch assay (figur 3B). 48 timer efter at ridse en sammenflydende godt af sorterede R-NC-celler, cellerne migrerer ind i scratch med succes. Endelig viser vi, at R-NC celler har potentiale til at differentiere i celler fra det autonome nervesystem. Cellerne blev spontant differentieret for 4 dage efter HNK1 + / p75 + FACS og farves med henblik Mash1 og TUJ1, gener, der er udtrykt i autonome neuroner (figur 3C).

Figur 1.. Kritiske trin i R-NC differentiering protokol. En MS5-R-NC ^10,11 og R-NC differentiering protokol ordningen.. De specifikke differentiering trin i de to protokoller er vist. MS5: feeder stromalceller, KSR: KSR-differentiering medium, N2: N2-differentiering medium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic pindsvin, 8: FGF8, A: ascorbinsyre, B:. BDNF B. Viser udifferentierede hPSC kolonier farves med oktober-4 og DAPI før induktion af differentiering. C. Viser celledensiteten (90-100% konfluens) på dag 0 af differentiering, typisk 1 dag efter plating hPSCs. D. Viser neurale rosetter farvet med Pax6 og nye NC celler farvet med HNK-1 inden for dråbe. E. Viser dag 13 celler, genudplades på dag 11 i dråber og NC celler emerging fra kanten af dråben. F. Repræsentative FACS sortering plot, viser HNK-1/p75 dobbelt positive NC celler på dag 18 af differentiering. Portene blev valgt på grundlag af de ufarvede og enkelt farvede knapper (ikke vist). FACS sortering plots kan variere mellem eksperimenter, hPSC linjer og brugen af ​​det gamle eller nye protokol i form af en procentdel af dobbelt positive og enkelte positive celler. Derfor er det vigtigt at isolere den dobbelte positive population for at sikre de rigtige NC celler udvindes. Images C til F blev genereret ved hjælp af den nye R-NC-protokollen.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Sammenlignelige neuralkam celleidentiteten af celler afledt med MS5-R-NC eller R-NC-protokollen. I begge protokoller cellerne passere gennem en neural roset fase. Sorteret NC celler ser identiske ved morfologi og ved ekspression af NC markører, såsom HNK-1 og AP2. NC celler er nestin-positive, der viser, at de er stamceller. Skala bar: 200 um. Alle fluorescens billeder kontrastfarves til DAPI. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3.. NC-celler genereret med den gamle og den nye protokol har lignende identitet. A. Unsupervised gruppering af Illumina microarray genekspression data sammenligner NC celler afledt med MS5-R-NC-og R-NC-protokollen. NC celler afledt med MS5-R-NC eller R-NC-protokol på dag 35 eller dag 18 henholdsvis blev analyseret i tre eksemplarer ved hybridisering til en Illumina menneske 12 Oligonucleotid array. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Partek Genomisk Suite-softwaren. Signifikante forskelle blev defineret som dem med en fold ændring er større end 2 og FDR mindre end 0,05. 1421 gener blev analyseret. Standardindstillinger, såsom euklidiske prøve forskellighed, gennemsnitlig kobling klynge metode og 25 for dendrogram længde blev brugt. NC celler induceret ved aktivering Wnt signalering (Wnt-NC) blev inkluderet (cellerne var Forskelntiated i LDN193189 dag 0-3, SB431542 dag 0-4, CHIR99021 dag 0-11 og FACS sorteres på dag 11 for sox10) ^16. Disse celler klynge adskilt fra R-NC-celler, hvilket indikerer, at Wnt-NC celler og R-NC-celler er forskellige populationer. Celler differentieres for 11 dage i LDN193189 og SB431542 blev inkluderet som en neuroepitel kontrol (LSB). R-NC og MS5-R-NC celler klynge tæt sammen i forhold til kontrol-cellerne. Rå genekspression data er tilgængelige på GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) tiltrædelse #:. GSE50643 B. Migration assay. HNK1 + / p75 + FACS sorteres R-NC celler blev udsået på PO / Lam / FN i 96-brønde og ridset manuelt 24 timer senere. 0 hr billede blev taget umiddelbart efter at ridse og post farvning med Hoechst. De resterende brønde fik lov til at migrere til 48 timer før det andet billede blev taget. Skala bar: 200 um C. Sorteret R-NC-celler fik lov til spontant differentiere i 4 dage og blev farvet for MaSH1, TUJ1 og DAPI. Skala bar:. 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

For en vellykket differentiering af R-NC-celler fra hESC / hiPSCs følgende overvejelser bør gøres. Det er vigtigt at arbejde under sterile dyrkningsbetingelser på alle tidspunkter. I særdeleshed er det vigtigt at teste hPSC kulturer for forurening med mycoplasma jævnligt, da denne forurening vil hindre vellykket differentiering, men kan ikke let kan påvises visuelt hPSC kulturer. Bør indledes R-NC differentiering på 90-100% celletæthed; lavere celletæthed påvirker cellernes overlevelse og effektiviteten af ​​F-NC differentiering. Det er afgørende for empirisk validere optimale koncentrationer og lotnumre for nogle af de reagenser, især KSR for at støtte en effektiv NC differentiering. Når cellerne genudpladet på dag 11 i dråber bør celledensiteten i 10 pi dråbe være høj, og er bedst bestemmes empirisk. Korrekt roset-og NC-dannelse afhænger af den relevante celle tæthed i dråben. Vi empirisk observationaba forøget celleoverlevelse, når cellerne vaskes mindst to gange efter behandling med Accutase. For en vellykket isolering af R-NC-celler ved FACS de rigtige eksperimentelle kontrol, såsom ufarvede, enkelt antistof farves og sekundært antistof kun farvede celler er afgørende. Døde celler kan udelukkes ved DAPI, 7-AAD eller propidiumiodidfarvning. Endvidere bør antistoffortyndinger bestemmes empirisk for hvert specifikt antistof parti. Det er vigtigt at FACS rense R-NC celler ved dobbelt farvning med HNK-1 og p75, da enkelt farvning kan føre til forurening af NC befolkning med uønskede celletyper, såsom p75-positive CNS celler, tidlig mesoderm eller placode. Det er vores erfaring procentdele af dobbelt versus enkelt farvede befolkninger kan variere mellem hPSC linjer og differentiering eksperimenter. R-NC celleoverlevelse post-FACS kan øges ved at undgå barske pipettering af cellerne, i stedet flicking af røret for at resuspendere cellerne er tilrådeligt. Også plating R-NC FACSisolerede celler i konditioneret medium (filtreret medium cellerne voksede før FACS) har vist sig at forbedre overlevelsen ^11. Det er tilrådeligt at foretage en mindre skala differentiering i parallel, der kan farves med det neurale epitelial markør Pax6 på dag 11 og dag 14 for at sikre en effektiv neutralisering og roset-dannelse. NC markører, såsom HNK-1 eller AP2 på rosetten scenen for ordentlig NC differentiering bør vurderes som godt. Desuden bør isolerede R-NC celler valideres ved morfologi og farvning for NC markører, såsom AP2, HNK-1 og nestin (figur 2).

Udledningen af MS5-R-NC celler fra hPSC er blevet beskrevet i 2007 af Lee et al. ^10.. Det blev vist, at dette forstadium population kan opformeres og længere differentieres in vitro til derivater af NC-afstamning. MS5-R-NC celler kan spontant differentieres ved hjælp af den neurale sfære metoden ^10,17eller ved styret in vitro differentiering. Det blev fastslået, at MS5-R-NC celler kan give anledning til celler i det perifere nervesystem (autonome og sensoriske neuroner), perifer glia (Schwann-celler), myofibroblasts, mesenchymale stamceller og deres afkom og den glatte muskulatur ^10. Transplantation i chick og mus viste, at MS5-R-NC celler migrerer og differentierer in vivo ^10. MS5-R-NC-celler har endvidere været impliceret i modellering af sygdomme hos mennesker. Den karakteristiske fænotype af den genetiske sygdom Familiær Disautonomia (FD) blev modelleret in vitro ved hjælp af patientens specifikke hiPSC-afledte MS5-R-NC-celler ^2. NC karakteristiske fænotyper, såsom dysfunktionel NC celle migration og udvikling er vist i celler afledt af FD patienter, men ikke hos raske kontrolceller. MS5-R-NC-celler er også blevet anvendt til at etablere toksikologisk afprøvning af stoffer, der påvirker neuralkam migration i humane embryonaleudvikling, med potentiale til at undgå udslip af fremtidige lægemidler, der kan have en negativ indflydelse på nervesystemets udvikling ^5.. En spændende anvendelse af hPSC teknologien er high-throughput screening og testning af farmaceutiske behandlingsmuligheder for sygdomme hos mennesker. MS5-R-NC celler blev anvendt til at udføre den første skærm i en IPSC-baserede sygdom model, dvs familiær dysautonomi ^4.. Dette skærmbillede førte til identifikation af nye forbindelser, som kan blive yderligere evalueret i kliniske forsøg.

For alle anvendelser af hPSC område er det vigtigt at have nøjagtig, reproducerbar, definerede og specifikke in vitro differentiering protokoller til rådighed. I denne rapport, viser vi en tilpasning af en etableret in vitro differentiering protokol for afledningen af R-NC-celler fra hPSCs. Den rapporterede protokol giver de samme celler som tidligere rapporteret ¹⁰ i mere definerede dyrkningsbetingelser og shorter tidsramme. Denne protokol kan anvendes til at generere R-NC-celler for humane sygdomme, der påvirker celler fra NC afstamning, for sammensatte screening, toksikologi test og videreudvikling af rettet differentiering protokoller til celletyper afledt fra NC afstamning.

Disclosures

Forfatterne har ingen modstridende interesser at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et stipendium for avancerede forskere fra den schweiziske National Science Foundation og gennem tilskud fra NYSTEM (C026446, C026447) og Tri-institutionelle initiativ stamcelle (Starr Foundation).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008

References

1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Tags

Neuroscience embryonale stamceller (ESC) pluripotente stamceller induceret pluripotente stamceller (iPSCs) neuralkam perifere nervesystem (PNS) pluripotente stamceller neurale crest celler, sygdom modellering differentiering protokol menneskelige embryonale stamceller humane pluripotente stamceller