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हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन के बाद कार्डियक Myocytes में Mitochondrial झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए एक प्रवाह Cytometry-आधारित परख

Published: July 13, 2018 doi: 10.3791/57725
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

Summary

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल का उपयोग करता है कि जे-1 डाई के साथ या एक सुरक्षात्मक एजेंट के बिना हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन के उजागर होने के बाद कोशिकाओं की mitochondrial झिल्ली की क्षमता का आकलन करने के लिए.

Abstract

occluded कोरोनरी धमनी के समय पर और कुशल reperfusion एक ST-सेगमेंट ऊंचा रोधगलन के साथ रोगियों में रोधगलन infarct आकार कम करने के लिए सबसे अच्छी रणनीति है । हालांकि, reperfusion प्रति एसई आगे cardiomyocyte मौत, एक reperfusion चोट के रूप में जाना जाता घटना में परिणाम कर सकते हैं । mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (mPTP), mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी), या mitochondrial ध्रुवीकरण की कमी के साथ खोलने, सार्वभौमिक reperfusion चोट के अंतिम चरण के रूप में पहचाना जाता है और के लिए जिंमेदार है mitochondrial आणि cardiomyocyte मृत्यू. जे. सी.-1 एक lipophilic cationic डाई कि एमएमपी के मूल्य के आधार पर mitochondria में जमा है । जितना अधिक एमएमपी है, उतना ही mitochondria में जे-1 संचित होता है । mitochondria में जे. के.-1 की बढ़ती मात्रा हरे (~ ५३० एनएम) से लाल (~ ५९० एनएम) के लिए एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बदलाव से परिलक्षित किया जा सकता है । इसलिए, लाल/हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात की कमी mitochondria के ध्रुवीकरण का संकेत कर सकते हैं । यहां, हम जे सी-1 का लाभ लेने के लिए एमएमपी उपाय, या हाइपोक्सिया के बाद मानव हृदय myocytes में mPTP के उद्घाटन/

Introduction

कोरोनरी हृदय रोग दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है । कोरोनरी चोट को कम करने और अनुसूचित जनजाति-खंड ऊंचा रोधगलन के साथ रोगियों में infarct आकार सीमित करने के लिए पसंद का उपचार प्राथमिक percutaneous कोरोनरी हस्तक्षेप (पीसीआई)1के माध्यम से समय पर और प्रभावी रोधगलन reperfusion है, 2. हालांकि, reperfusion अतिरिक्त क्षति का कारण बनता है, जो अंतिम infarct आकार3के 30 प्रतिशत तक के लिए खाता कर सकते हैं । यह सार्वभौमिक रूप से स्वीकार किया है कि mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (mPTP) न केवल mitochondrial क्षति और सेल मौत में ischemia के दौरान केंद्रीय है/reperfusion (I/आर), लेकिन यह भी converging4 संकेत के एक cardioprotective लक्ष्य है , 5. के रूप में mPTP खोलने इनर mitochondrial झिल्ली क्षमता (एमएमपी)4के ध्रुवीकरण के बारे में लाना होगा, हम mPTP का उपयोग कर खोलने का पता लगाया 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1 ', 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (जे. ए.-1) परख ।

जे. सी.-1 परख एक cytofluorimetric विधि है कि दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक है, और यह एक एकल mitochondria6के स्तर पर एमएमपी का विश्लेषण करके आगे मांय किया गया है । जे. सी.-1 एक एकत्रित रूप के रूप में मौजूद है, सामांय एमएमपी के साथ mitochondria के मैट्रिक्स में नारंगी रंग का उत्सर्जन (५९० ± १७.५ एनएम) के लिए एक लाल उपज; एमएमपी के नुकसान के साथ, जे सी-1 monomeric रूप है कि पैदावार ५३० ± 15 एनएम के उत्सर्जन के साथ हरी प्रतिदीप्ति में बदल जाता है । इसलिए, लाल/हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात में कमी का संकेत मिल सकता है जैसे ischemia/reperfusion (I/आर) के रूप में शर्तों में एमएमपी की कमी ।

जे. पी.-1 के अलावा, एमएमपी भी झिल्ली के साथ अध्ययन किया गया है-पारगंय lipophilic cations जैसे Rhodamine १२३ और 3, 3 ′-dihexyloxadicarbocyanine आयोडाइड [DiOC6 (3)] । हालांकि, इन दो जांचों की तुलना में, जे सी-1 एमएमपी विश्लेषण के लिए अधिक विश्वसनीय है । Rhodamine १२३ अपेक्षाकृत गरीब संवेदनशीलता है (विशेष रूप से शमन मोड7,8में) और गरीब विशिष्टता । rhodamine १२३ में बदलाव कभी इतना छोटा है कि यह शोधकर्ताओं या उपकरणों का निरीक्षण करने के लिए कठिन है/ इसके अलावा, एक ही सेल में, वहां rhodamine १२३ के लिए विभिंन mitochondrion बाध्यकारी साइटों रहे है और इसलिए कि यह अलग प्रतिदीप्ति9उत्सर्जन हो सकता है । DiOC6 (3) एमएमपी का पता लगाने के लिए अनुशंसित नहीं है या तो के रूप में यह प्लाज्मा झिल्ली10के ध्रुवीकरण के लिए संवेदनशील प्रतिक्रिया ।

इसलिए, यहां हम जे सी-1 परख का उपयोग करने के बाद HCMs के एमएमपी का आकलन करने के लिए हाइपोक्सिया/के साथ या एक सुरक्षात्मक एजेंट के बिना ऑक्सीजन उजागर जा रहा है ।

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Protocol

1. रिएजेंट्स और समाधानों की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Myocyte ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स के ५०० एमएल से 25 एमएल के Myocyte ग्रोथ मीडियम को जोड़कर ह्यूमन कार्डियक myocytes (HCMs) पूर्ण माध्यम तैयार करें । 4 ° c और गर्म करने के लिए ३७ ° c का उपयोग करने से पहले स्टोर ।
  2. सीरम/ग्लूकोज-मुक्त Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में TXL ultrafine पाउडर भंग करके Tongxinluo (TXL) समाधान तैयार करने और TXL (अधिक जानकारी के लिए,11देखें) को जोड़कर ४०० µ g/ 4 ° c और गर्म करने के लिए ३७ ° c का उपयोग करने से पहले स्टोर ।
  3. जे सी के 25 µ एल-1 शेयर समाधान (200x), ultrapure पानी की 4 मिलीलीटर, और शेयर धुंधला बफर (5x) के 1 मिलीलीटर में एक 15 मिलीलीटर में अंधेरे में ट्यूब केंद्रापसारक जोड़कर काम समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करें । पिपेट मिश्रण को ऊपर और नीचे कई बार और गर्म करने के लिए ३७ ° c का उपयोग करने से पहले ।
  4. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में शेयर धुंधला बफर (5x) के 6 मिलीलीटर ultrapure पानी की 24 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा धुंधला बफर काम के 30 मिलीलीटर तैयार करें । इस घोल का प्रयोग आइस-कोल्ड करें ।

2. हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन मॉडल की स्थापना

  1. प्लेट १.० x 10 अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली में HCM पूरा माध्यम के साथ प्रति5 कोशिकाओं । एक सेल मशीन में 5% CO2 और ९५% हवा ३७ डिग्री सेल्सियस से युक्त में के बारे में ७०% की एक प्रवाह तक पहुंचने के लिए बढ़ें ।
  2. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ HCMs धो लें । उंहें विभिंन उपचार के लिए बेनकाब (४०० µ g/एमएल TXL या नहीं) सीरम के 2 मिलीलीटर/ग्लूकोज मुक्त DMEM 30 मिनट के लिए हाइपोक्सिया से पहले एक सेल मशीन में 5% CO2 और ९५% हवा से युक्त ३७ ° c ।
  3. एक वाटरप्रूफ और hypoxic जार में HCMs की मशीन (२.५ L) नि: शुल्क ऑक्सीजन सफाई और 18 घंटे के लिए हाइपोक्सिया प्रेरित करने के लिए एक उत्प्रेरक के साथ सज्जित (चित्रा 1a), और एक anaerobic सूचक मध्यम11,12में ऑक्सीजन तनाव को मापने के लिए, 13, एक सेल मशीन में 5% सह से युक्त2 और ९५% हवा ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: यह के बारे में १.५ एच के लिए जार में मुक्त ऑक्सीजन सफाई उत्प्रेरक के लिए लेता है । इसलिए जार खोले जाने से पहले HCMs को १९.५ ज के लिए जार में रखा जाता है । anaerobic संकेतक का रंग normoxic वातावरण में हल्के नीले से hypoxic स्थिति (चित्र 1b) में पीला सफ़ेद तक बदलता है ।
  4. Reoxygenate HCMs एक मशीन में 6 अच्छी थाली चलती द्वारा ३७ ° c 5% CO 2 और ९५% हवा 2 एच के लिए युक्त में सेट

3. फ्लो Cytometry के लिए HCMs की तैयारी

  1. ०.२५% trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान और पंजाब के ३७ डिग्री सेल्सियस को गर्म करें ।
  2. महाप्राण एक अच्छी तरह से मध्यम, पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और अच्छी तरह से की दीवार के साथ ०.२५% trypsin की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. ३७ ° c पर मशीन जब तक सभी HCMs लगभग अलग कर रहे है (लगभग 1 मिनट) ।
  4. trypsin बेअसर करने के लिए कुओं को DMEM पूरा मध्यम (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ मध्यम) के 1 मिलीलीटर जोड़ें । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और गोली HCMs को सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  5. सावधानी से गोली परेशान बिना supernatant महाप्राण ।
  6. प्रत्येक ट्यूब के लिए HCM पूरा मध्यम और जे सी के ०.५ मिलीलीटर-1 काम समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा HCMs resuspend ।
  7. कवर एल्यूमीनियम पंनी के साथ पूरे ट्यूबों के लिए फ्लोरोसेंट संकेतक और सामांय परिस्थितियों में गर्मी HCMs की ब्लीचिंग रोकने के लिए (३७ ° c 5% सह2 और ९५% हवा युक्त) 20 मिनट के लिए ।
  8. गोली HCMs 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ।
  9. कुल्ला HCMs दो बार बर्फ ठंडा जे-1 धुंधला बफर के 2 मिलीलीटर के साथ ।
  10. ३०० के एक अंतिम मात्रा में HCMs resuspend बर्फ के µ एल का एक नमूना ट्यूब (12 मिमी x ७५ मिमी) में ठंड धुंधला बफर और 30 मिनट के भीतर विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें ।
    नोट: carbonyl साइनाइड एम-chlorophenyl hydrazone (CCCP), श्वसन इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला का एक शक्तिशाली अवरोधक का उपयोग करें, सकारात्मक नियंत्रण के लिए, 20 HCMs मीटर की एकाग्रता पर 1 ज के लिए µ के इलाज के लिए ।

4. फ्लो Cytometer सेटअप

  1. प्रवाह cytometer प्रारंभ करें और सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर इससे कनेक्टेड है ।
  2. fluidics स्टार्टअप निष्पादित करें, स्ट्रीम प्रारंभ करें और breakoff सेट करें ।
  3. दो डॉट प्लॉट windows प्रवाह cytometry सॉफ़्टवेयर में खोलें ।
    1. आगे का चयन करें बिखरे हुए प्रकाश (FSC) पर X अक्ष और साइड बिखरा हुआ प्रकाश (एसएससी) में Y अक्ष पर पहले डॉट साजिश के संदर्भ में कोशिकाओं की विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए उनके आकार और उनकी दानेदार, क्रमशः ।
    2. Y अक्ष के लिए पीई (५७५ ± 26 एनएम) का पता लगाने वाले चैनल का चयन करें और दूसरी डॉट प्लॉट में लघुगणकीय स्केल का उपयोग करते हुए X अक्ष के लिए FITC (५३० ± 30 एनएम), जो कि कोशिकाओं में जे-1 डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता मापने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

5. फ्लो Cytometry माप और डेटा विश्लेषण

  1. ट्यूब समर्थन हाथ बाहर जाने के लिए अनलोड क्लिक करें और उस पर खाली (जे. ए.-1 के साथ रंगे नहीं किया गया है HCMs) नमूना ट्यूब की स्थिति । क्लिक करें लोड अपने काम की स्थिति के लिए ट्यूब समर्थन हाथ वापस करने के लिए ।
  2. क्लिक करें रिकॉर्ड निलंबन से खाली नमूना ट्यूब में कणों को इकट्ठा करने के लिए और फिर गेट सेल जनसंख्या (P1) पहले डॉट भूखंड (चित्रा 3) में आगे विश्लेषण के लिए ।
  3. अंय नमूना ट्यूबों में HCMs लीजिए और प्रतिदीप्ति चैनलों की वोल्टेज का समायोजन करके माप का अनुकूलन, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल डॉट दूसरे डॉट प्लॉट के मध्य क्षेत्र में स्थित है ।
  4. प्रत्येक नमूना ट्यूब के आँकड़े प्रदर्शित करें और हरे प्रतिदीप्ति तीव्रता की है कि द्वारा लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात विभाजित करके प्रत्येक नमूने के MMPs की गणना.

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Representative Results

जे-1 परख प्रदर्शन करने से पहले एमएमपी के परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि प्रयोगों को सफलतापूर्वक शोधकर्ताओं द्वारा निर्धारित शर्तों की पुष्टि करने के लिए किया जाता है । के रूप में प्रवाह cytometry परिणाम (चित्रा 2) द्वारा दिखाया गया है, सामांय समूह के साथ तुलना में, हाइपोक्सिया/(एच/आर) काफी HCMs के apoptosis प्रेरित (Annexin वी +/PI ±), यह दर्शाता है कि हम एक सेल की स्थापना की थी आधारित मॉडल I/R (४५.०० ± २.१३% बनाम सामान्य समूह में ११.५० ± ०.१८%, p < 0.05). Tongxinluo, cardioprotective प्रभाव के साथ एक चीनी पारंपरिक दवा, एच के हालत में HCMs के apoptosis को रोका/आर (२४.५० ± १.१३% बनाम ४५.०० ± २.१३% में h/r समूह, p < 0.05) ।

CCCP एक protonophore है कि इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में इलेक्ट्रॉन वाहकों की सामान्य गतिविधि के दौरान स्थापित प्रोटॉन ढाल (mitochondria की हानि) के द्वारा एमएमपी में ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण को बाधित कर सकते हैं । नतीजतन, CCCP के साथ इलाज HCMs सकारात्मक नियंत्रण के रूप में स्थापित किया गया था । चित्रा 4में दिखाया गया है, CCCP-इलाज समूह में लाल/हरी अनुपात लगभग शूंय था । apoptosis परख से परिणाम के अनुरूप, एच/आर-इलाज समूह एक काफी कम लाल/सामांय समूह (०.६९ ± ०.०७ बनाम ५.६४ ± ०.२१ सामांय समूह में, p < 0.05) और Tongxinluo के साथ तुलना में प्रदर्शित ऐसे अनुपात उलट परिवर्तित करें (२.९२ ± ०.२२ बनाम ०.६९ ± ०.०७ में एच/R समूह, p< 0.05) ।

Figure 1
चित्र 1. हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन (एच/आर) मॉडल की स्थापना । A. सामग्री एच/आर मॉडल स्थापित करने के लिए आवश्यक; ख. जार में hypoxic वातावरण की पुष्टि । anaerobic संकेतक का रंग normoxic वातावरण में हल्के नीले से hypoxic हालत में पीली सफेद में बदलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन (एच/आर) मॉडल की स्थापना के प्रवाह cytometry द्वारा मांयता । सामान्य समूह की तुलना में, मानव कार्डियक myocytes की अपोप्तोटिक दर एच/आर समूह में काफी अधिक थी, जबकि Tongxinluo ने इस परिवर्तन को उलट दिया (*p < 0.05 बनाम normal; # p < 0.05 बनाम h/r; n = 3)11. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. आगे के विश्लेषण के लिए एसएससी बनाम FSC डॉट प्लाट में गेटिंग सेल की आबादी (P1, Red) है । सेल जनसंख्या की अखंडता साइड स्कैटर (एसएससी) और फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) का उपयोग कर आकलन किया है. कक्ष मलबे (गेट P1 के बाहर, काला), जो प्रकाश बिखरने कम कर दिया है, बाहर रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. मानव हृदय myocytes में mitochondrial झिल्ली की क्षमता का मूल्यांकन । सामान्य समूह के साथ तुलना में, एच/आर समूह एक काफी कम लाल/हरी अनुपात प्रदर्शित किया, जबकि Tongxinluo इस प्रवृत्ति उलट (लाल: कोशिकाओं नहीं प्रतिदीप्ति के साथ; नीले, लाल प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं; बैंगनी, हरी प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं । नकारात्मक नियंत्रण, रिक्त और कोई दाग; सकारात्मक नियंत्रण, CCCP के साथ इलाज कोशिकाओं; *p < 0.05 बनाम सामांय; #p < 0.05 बनाम H/ n = 3)11. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि जे सी-1 डाई का उपयोग करता है के लिए उजागर किया जा रहा के बाद कोशिकाओं के एमएमपी का आकलन करने के लिए प्रस्तुत एच/जे-1 द्वारा पता लगाया परख, कोशिकाओं के एमएमपी जैसे कारकों से स्वतंत्र है mitochondrial आकार, आकार, और घनत्व है कि एकल घटक प्रतिदीप्ति को प्रभावित कर सकते है 14सिग्नल । नतीजतन, जे सी-1 परख के परिणाम अपेक्षाकृत विश्वसनीय हैं । इसके अलावा, यह सुविधाजनक और समय बचाने के लिए जे सी-1 परख प्रदर्शन है । इस परख सामग्री और रिएजेंट के लिए एक कम आवश्यकता है, और आम तौर पर, यह कम से १.५ h धुंधला कर लेता है, सेल टुकड़ी से एमएमपी माप करने के लिए ।

कुछ महत्वपूर्ण कदम जब जे सी-1 परख प्रदर्शन कर सकते है नहीं किया जा सकता है अगर शोधकर्ताओं को विश्वसनीय और संतोषजनक परिणाम प्राप्त करना चाहते हैं । सबसे पहले, जे-1 के साथ भरी हुई कोशिकाओं बर्फ ठंड धुंधला बफर में संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक वे प्रवाह cytometer द्वारा एकत्र कर रहे हैं । तापमान एमएमपी की स्थिरता पर काफी प्रभाव पड़ता है और एक नमूना के मूल्य कमरे के तापमान में एक संक्षिप्त समय के बाद एक बहुत भिन्न होता है । इसके अलावा, प्रारंभिक प्रयोगों समय और CCCP की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं, सुनिश्चित करना है कि सकारात्मक नियंत्रण के लाल/ यह उल्लेखनीय है कि carbonyl साइनाइड 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), जो भी एमएमपी को समाप्त कर सकते हैं और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण को बाधित, CCCP के लिए एक विकल्प है और यह भी सकारात्मक नियंत्रण10सेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

जे. सी.-1 परख में एक प्रमुख सीमा है कि अंय fluorochromes जे-1 के साथ संयुक्त नहीं किया जा सकता है, इसके प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के लिए हरे, पीले, और स्पेक्ट्रम की लाल तरंग दैर्ध्य का हिस्सा फैलाता है । इसके अतिरिक्त, जे सी-1 परख एक या एक से अधिक तरीकों, जैसे calcein का उपयोग कर के साथ संयुक्त होना चाहिए-acetoxymethylester15,16 या आनुवंशिक हेरफेर17,18, निर्धारित करने के लिए यदि mPTP खातों के उद्घाटन के लिए कमी एमएमपी. इसका कारण यह है कि अन्य mitochondrial के उद्घाटन के एटीपी संवेदनशील कश्मीर की तरह pores+ चैनल19,20 भी mitochondria के ध्रुवीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

जे. सी.-1 परख सबसे अच्छा अधिक मोटे "हां/मूल्यांकन कि क्या mitochondria मोटे तौर पर ध्रुवीकरण कर रहे है (जैसे, apoptosis से संबंधित प्रयोगों)8के उद्देश्य से आकलन के लिए अनुकूल है । यह भी सेल प्रकार की एक किस्म में एमएमपी मापने के लिए लागू किया गया है cardiomyocytes के अलावा, न्यूरॉन्स सहित21, हेपैटोसाइट्स22, गुर्दे की कोशिकाओं23 और भी अलग mitochondria24. संक्षेप में, हम HCMs में एमएमपी का पता लगाने के लिए एक त्वरित, सरल और संवेदनशील विधि का वर्णन के बाद एच आर/

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (no. 2017YFC1700503), चीन के राष्ट्रीय आधारभूत अनुसंधान कार्यक्रम (९७३ प्रोग्राम) (no. 2012CB518602), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (no. ८१३७०२२३) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया । और सं ८१५७३९५७), और पेकिंग यूनियन मेडिकल कॉलेज के स्नातकोत्तरों ' अभिनव अनुसंधान फाउंडेशन (2016-1002-01-02) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 Beyodtime, China C2006 In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafine powder Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China 071201
Annexin V-FITC/PI Kit Becton-Dickinson, USA 556547
DMEM Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA 11966-025
Human cardiac myocyte Promocell, Germany C-12810
Myocyte Growth Medium
(SupplementMix)		 Promocell, Germany C-39275
Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) Promocell, Germany C-22070 used with Myocyte Growth Medium SupplementMix
GENbox BioMérieux, Marcy l’Etoile, France 96127 2.5L
Catalyst (AnaeroPack) MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan  C-1
Anaerobic indicator BioMérieux, Marcy l’Etoile, France 96118
Flow cytometer Becton-Dickinson, USA FACSAria 2
BD FACSDiva Software Becton-Dickinson, USA Version8.0.1
Sample tube Corning science, USA 352054 12*75mm
PBS Hyclone, USA SH30256.01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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व्यवहार समस्या १३७ Mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना Mitochondrial झिल्ली क्षमता जे-1 परख reperfusion चोट कार्डियक myocytes प्रवाह cytometry
हाइपोक्सिया/पुनर्ऑक्सीजन के बाद कार्डियक Myocytes में Mitochondrial झिल्ली की क्षमता को मापने के लिए एक प्रवाह Cytometry-आधारित परख
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Chen, G., Yang, Y., Xu, C., Gao, S.… More

Chen, G., Yang, Y., Xu, C., Gao, S. A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation. J. Vis. Exp. (137), e57725, doi:10.3791/57725 (2018).

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