Summary
Her presenterer vi en protokoll som bruker JC-1 fargestoff for å vurdere mitokondrie membran potensialet i celler etter å bli utsatt for hypoksi/reoxygenation med eller uten en beskyttende agent.
Abstract
Rettidig og effektiv reperfusion av okkludert koronar er den beste strategien for å redusere betennelsessykdommer som hjerteinfarkt størrelse hos pasienter med en ST-segmentet opphøyet hjerteinfarkt. Men kan reperfusion sådan føre videre cardiomyocyte død, et fenomen kjent som reperfusion skade. Åpningen av mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (mPTP), med reduksjon av mitokondrie membranen potensielle (MMP) eller mitokondrie depolarization, er allment anerkjent som det siste trinnet av reperfusion skade og er ansvarlig for Mitokondrielt og cardiomyocyte død. JC-1 er et lipofile kationisk fargestoff som akkumuleres i mitokondrier avhengig av MMP. Jo høyere MMP er, jo mer JC-1 akkumuleres i mitokondrier. Den økende mengden JC-1 i mitokondrier kan gjenspeiles av et fluorescens utslipp skifte fra grønn (~ 530 nm) til rød (~ 590 nm). Derfor, reduksjon av rød/grønn fluorescens intensitet forholdet kan angi depolarization i mitokondrier. Her tar vi nytte av JC-1 å måle MMP eller åpningen av mPTP i menneskets hjerte myocytter etter hypoksi/reoxygenation, oppdaget av flowcytometri.
Introduction
Koronar hjertesykdom er den ledende dødsårsaken som er over hele verden. Behandling av valg er for å redusere iskemiske skader og størrelsesbegrensing betennelsessykdommer hos pasienter med ST-segmentet forhøyet hjerteinfarkt rettidig og effektiv hjerteinfarkt reperfusion via primære PCI-behandling (PCI)1, 2. Imidlertid forårsaker reperfusion ytterligere skade, som kan utgjøre opptil 30 prosent av den endelige betennelsessykdommer størrelse3. Det er allment anerkjent at mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (mPTP) ikke er bare sentral i mitokondrie skade og celle død under iskemi/reperfusion (jeg / R), men er også en konvergerende målet for Kardioprotektive signalering4 , 5. som mPTP åpning fører til depolarization av indre mitokondrie membran potensial (MMP)4, vi oppdaget mPTP åpning bruker 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) analysen.
JC-1 analysen er en cytofluorimetric metode som er både kvalitativ og kvantitativ, og det videre er validert ved å analysere MMP på nivå med en enkelt mitokondrier6. JC-1 eksisterer som en samlet form, gir en rød til oransje fargede utslipp (590 ± 17,5 nm) i matrisen av mitokondrier med normal MMP; med tapet av MMP konverteres JC-1 til skjemaet monomerisk som gir grønne fluorescens med et utslipp av 530 ± 15 nm. Derfor en nedgang i rød/grønn fluorescens intensitet forholdet kan indikere reduksjon av MMP i forhold som iskemi/reperfusion (jeg / R).
I tillegg til JC-1, MMP også har vært studert med membran-permeable lipofile kasjoner som Rhodamine 123 og 3, 3-dihexyloxadicarbocyanine iodide [DiOC6(3)]. Men er i forhold til disse to sonder, JC-1 mer pålitelig for å analysere MMP. Rhodamine 123 har relativt dårlig følsomhet (spesielt i slukke modus7,8) og dårlig spesifisitet. Skifte i rhodamine 123 er noen ganger så liten at det er vanskelig for forskere eller utstyr å observere/oppdage. Dessuten, i en enkelt celle, det er ulike mitokondrie bindende områder for rhodamine 123 og så at det kan ha forskjellige fluorescens utslipp9. DiOC6(3) anbefales ikke for å oppdage MMP slik det reagerer følsomt depolarization plasma membranen10.
Derfor bruker her vi JC-1 analysen for å vurdere MMP HCMs etter å bli utsatt for hypoksi/reoxygenation med eller uten en beskyttende agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av reagenser og løsninger
- Forberede menneskelige hjerte myocytter (HCMs) komplett medium ved å legge 25 mL av Myocyte vekst Medium supplement til 500 mL Myocyte vekst Medium henhold til produsentens instruksjoner. Butikken på 4 ° C og varmt 37 ° c før bruk.
- Forberede Tongxinluo (TXL) løsning av oppløsende TXL Ultrafin pulver i serum glukose-fri Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) og justere konsentrasjonen av TXL til 400 µg/mL ved å legge DMEM (for mer informasjon, se11). Butikken på 4 ° C og varmt 37 ° c før bruk.
- Forberede 5 mL av JC-1 fungerende løsning ved å legge til 25 µL av JC-1 lagerløsning (200 x), 4 mL ultrapure vann og 1 mL av lager farging buffer (5 x) i en 15 mL sentrifuge rør i mørket. Pipetter blanding opp og ned flere ganger og varme til 37 ° C før bruk.
- Forberede 30 mL arbeider flekker bufferen ved å legge til 24 mL ultrapure vann 6 mL av lager flekker buffer (5 x) i et 50 mL sentrifuge rør. Bruk denne løsningen iskald.
2. opprettelsen av hypoksi/Reoxygenation modell
- Plate 1.0 x 105 celler per brønn med HCM komplett medium i en 6 godt plate. Vokse til en confluency på ca 70% i en celle inkubator inneholder 5% CO2 og 95% luft på 37 ° C.
- Vask HCMs med fosfat buffer saltvann (PBS). Utsette dem for ulike behandlinger (400 µg/mL TXL eller ikke) i 2 mL serum/glukose-gratis DMEM i 30 min før oksygenmangel i en celle inkubator inneholder 5% CO2 og 95% luft på 37 ° C.
- Inkuber HCMs i en lufttett og hypoxic glasset (2,5 L) med en katalysator for å renovere fritt oksygen og indusere hypoksi 18 h (figur 1A), og en anaerob indikator for å måle oksygen spenningen i middels11,12, 13, i en celle inkubator inneholder 5% CO2 og 95% luft på 37 ° C.
Merk: Det tar ca 1,5 t for katalysator åtseleter fritt oksygen i glasset. Derfor beholdes HCMs i glasset 19,5 h før glasset åpnes. Fargen på anaerob indikatoren endres fra lys blå i normoxic miljø blek hvit i hypoxic tilstand (figur 1B). - Reoxygenate HCMs ved å flytte 6 godt platen til en inkubator satt på 37 ° C som inneholder 5% CO2 og 95% luft for 2T.
3. forberedelse av HCMs til flowcytometri
- Varme 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsningen og PBS til 37 ° C.
- Sug opp medium fra hver brønn, skyll cellene med 1 mL av PBS og legge til 0,5 mL av 0,25% trypsin langs brønnen.
- Ruge på 37 ° C før alle HCMs er nesten løsrevet (ca 1 min).
- Legg 1 mL av DMEM komplett medium (DMEM medium med 10% fosterets bovin serum) fordelt å nøytralisere trypsin. Overføre celle suspensjon slik 15 mL sentrifuge og pellets HCMs av sentrifugering på 500 x g for 3 min ved romtemperatur.
- Nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre pellet.
- Legge til 0,5 mL av HCM komplett medium og 0,5 mL JC-1 fungerende løsning i hver retning. Resuspend HCMs av pipettering opp og ned.
- Dekker hele rør med aluminiumsfolie å hindre bleking av indikatoren fluorescerende og ruge HCMs i normale forhold (på 37 ° C som inneholder 5% CO2 og 95% luft) for 20 min.
- Pellet HCMs av sentrifugering på 500 x g i 3 minutter på 4 ° C.
- Skyll HCMs to ganger med 2 mL iskald JC-1 flekker buffer.
- Resuspend HCMs i en endelig mengde 300 µL av iskalde flekker buffer i prøven røret (12 mm x 75 mm) og bruke cellene for analyser innen 30 min.
Merk: Bruk karbonyl cyanid m-klorofenyl hydrazone (CCCP), en potent inhibitor av respiratoriske elektronet transportkjeden, til å behandle HCMs 1t i en konsentrasjon på 20 µM, for positiv kontrollen.
4. flyt Cytometer oppsett
- Start flyt cytometer og sikre at programvaren er koblet til den.
- Utføre fluidics oppstart, starte strømmen og satt opp av breakoff.
- Åpne to dot tomten vinduer i flyt cytometri programvaren.
- Velg Videresend spredt lys (FSC) på X-aksen og siden spredt lys (SSC) på Y-aksen i den første dot tomten representerer egenskapene til cellene deres størrelse og deres detaljnivå, henholdsvis.
- Velg PE (575 ± 26 nm) oppdagelsen kanalen for Y-aksen og FITC (530 ± 30 nm) for X-akse med en logaritmisk skala i andre dot plottet, som brukes til å måle fluorescens intensiteten av JC-1 fargestoff i cellene.
5. flow cytometri måling og dataanalyse
- Klikk Fjern for å la ut røret støtte arm og plassere det tomt (HCMs som ikke har blitt farget med JC-1) prøve røret på det. Velg Load for å returnere tube støtte arm til sin plass.
- Klikk på posten å samle partikler fra suspensjon i tomme eksempel røret og deretter gate celle befolkningen (P1) for videre analyse i første dot plottet (Figur 3).
- Samle HCMs i andre eksempel rør og optimalisere målingen ved å justere spenninger fluorescens kanaler, sørge for at cellen dot ligger i den sentrale delen av den andre dot tomten.
- Vise statistikk for hver eksempel rør og beregne MMPs av hver prøve ved å dele forholdet mellom røde fluorescens intensiteten av grønne fluorescens intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du utfører JC-1 analysen for å evaluere endringene av MMP, er det sterkt anbefalt at eksperimenter utføres for å bekrefte betingelsene er satt av forskerne. Som vist av flyt cytometri resultatene (figur 2), sammenlignet med normal gruppen, hypoksi/reoxygenation (H/R) betydelig indusert apoptose av HCMs (Annexin V + /PI±), som indikerer at vi hadde etablert en celle modell jeg / R (45.00 ± 2.13% vs. 11.50 ± 0,18% i normal gruppen p < 0,05). Tongxinluo, en kinesisk tradisjonell medisin med Kardioprotektive effekter, forhindret apoptose av HCMs i tilstand H/R (24.50 ± 1.13% vs 45.00 ± 2.13% gruppen H/R, p < 0,05).
CCCP er en protonophore som kan hemme oxidative fosforylering i mitokondrier av uncoupling proton gradient (tap av MMP) etablert i løpet av normal aktivitet elektron operatører i elektronet transportkjeden. Følgelig HCMs behandlet med CCCP ble satt som positiv. Som vist i Figur 4, var rød/grønn forholdet i gruppen CCCP-behandlet nesten null. I samsvar med resultatene fra analysen apoptose, gruppen H/R-behandlet vises en betydelig lavere rød/grønn-forhold sammenlignet med normal gruppen (0,69 ± 0,07 vs 5.64 ± 0,21 i normal gruppen p < 0,05) og Tongxinluo reversert slik forholdet endre (2.92 ± 0.22 vs 0,69 ± 0,07 gruppen H/R, p< 0,05).
Figur 1. Etablering av hypoksi/reoxygenation (H/R) modell. A. materialer som trengs for å etablere H/R modellen; B. bekreftelse av hypoxic miljøet i glasset. Fargen på anaerob indikatoren endres fra lys blå i normoxic miljø blek hvit i hypoxic tilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Validering av etableringen av hypoksi/reoxygenation (H/R) modell av flowcytometri. Sammenlignet med normal gruppen, apoptotisk frekvensen av menneskelig hjerte myocytter var betydelig høyere i gruppen H/R mens Tongxinluo reversert endringen (*p < 0,05 g. Normal, # p < 0,05 vs H/R, n = 3)11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Gating celle befolkningen (P1, rød) i SSC versus FSC dot tomten for videre analyse. Integriteten til celle befolkningen vurderes siden xy (SSC) og videresende xy (FSC). Celle rusk (utenfor porten P1, svart), som har redusert lys spredning, utelates. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Evaluering av mitokondrie membran potensial i menneskets hjerte myocytter. Sammenlignet med normal gruppen, gruppen H/R vises en betydelig lavere rød/grønn forhold, mens Tongxinluo reverseres denne trenden (Red: celler med ingen fluorescens; Blå celler med røde fluorescens; Lilla, celler med grønne fluorescens. Negativ tom og ingen flekker; Positiv kontroll, cellene behandlet med CCCP; p < 0,05 g. Normal; #p < 0,05 vs H/R; n = 3)11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en protokoll som bruker JC-1 fargestoff for å vurdere MMP celleområde etter å bli utsatt for H/R. oppdaget av JC-1 analysen, MMP celler er uavhengig av faktorer som mitokondrie størrelse, form og tetthet som kan påvirke single-komponent fluorescens signaler14. Følgelig er resultatene av JC-1 analysen relativt pålitelig. Dessuten, det er praktisk og tidsbesparende å utføre JC-1 analysen. Denne analysen har en lav innloggings materialer reagenser, og vanligvis tar det mindre enn 1,5 t gjøre farging, fra cellen avdeling til MMP mål.
Noen viktige skritt kan ikke overvurderes når JC-1 analysen hvis forskere vil få pålitelig og tilfredsstillende resultater. Først av alt, skal cellene lastet med JC-1 lagres i iskalde flekker buffer før de er samlet inn av flyt-cytometer. Temperaturen har en betydelig effekt på stabiliteten av MMP og verdien av ett utvalg varierer mye etter en kort tid i romtemperatur. I tillegg foreløpige eksperimenter anbefales å finne pretreating tid og konsentrasjon av CCCP, at rød/grønn forholdet mellom positive kontrollen er ~ 0. Det er bemerkelsesverdig at karbonyl cyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), som kan også eliminere MMP og hemme oxidative fosforylering, er et alternativ til CCCP og kan også brukes til å definere de positive kontroll10.
JC-1 analysen har en stor begrensning i den andre fluorochromes ikke kan kombineres med JC-1, til sin fluorescens utslipp spenner over den grønne, gule og en del av de røde bølgelengdene av spekteret. I tillegg må JC-1 analysen kombineres med én eller flere metoder, som bruker calcein-acetoxymethylester15,16 eller selv genetisk manipulering17,18, å avgjøre om åpningen av mPTP står for reduksjon av MMP. Dette skyldes at åpningen av andre mitokondrie porene som ATP-sensitive K+ kanaler19,20 kan også føre til depolarization av mitokondrier.
JC-1 analysen er best egnet til grovere "Ja/nei" vurderinger med sikte til å vurdere om mitokondrier er stort sett polarisert (f.eks apoptose-relaterte eksperimenter)8. Det er også brukt for å måle MMP i en rekke celletyper enn cardiomyocytes, inkludert nerveceller21, hepatocytter22, nyre celler23 og med isolerte mitokondrier24. I sammendraget beskriver vi en rask, enkel og følsom metode for påvisning av MMP i HCMs etter H/R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra The National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (nr. 2017YFC1700503), National grunnleggende forskningsprogram (973 Program) i Kina (No.2012CB518602), den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (nr. 81370223 og nr. 81573957), og Postgraduates' nyskapende Research Foundation Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J.
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
