Summary
このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。
Abstract
単一の心筋細胞は、収縮および電気活動の基礎単位としての心臓生物学および疾患の細胞および細胞内レベルの研究において重要なツールである。したがって、生存可能で高品質な心筋細胞を心臓から隔離することは、最初で最も重要な実験ステップである。成体マウスの心筋細胞を単離するための様々なプロトコルを比較すると、ランゲンドルフ逆行灌流は、特に心室筋細胞を単離するために、文献で報告された最も成功し、再現可能な方法である。しかし、穿フュード心臓から質の高い心房筋細胞を隔離することは依然として困難であり、成功した孤立報告はほとんど得られなかった。心室疾患とは別に、心房疾患は心臓病の大部分を占めているため、この複雑な問題を解決することは非常に重要です。したがって、そのメカニズムを明らかにするための細胞レベルのさらなる調査が保証される。本論文では、ランゲンドルフ逆行灌流法に基づくプロトコルを導入し、大大腸カヌル化の深さと、心房および心室筋細胞を分離する消化プロセスに影響を与える可能性のあるステップにいくつかの変更を同時に行った。さらに、分離された心筋細胞は、パッチクランプ調査に適していることを確認した。
Introduction
心臓病は、死亡率の主要な世界的な原因の一つです1。医療システムの負担に対処するためには、心臓の生理学と病理を深く理解することが不可欠です。動物全体と無傷の心臓製剤に加えて、細胞製剤は、機能および疾患研究のためのもう一つの不可欠なツールです2。パッチクランプ、カルシウムイメージング、分子生物学、およびその他の高度な技術を適用することにより、研究者は、単一の心筋細胞(CM)における電気生理学的特性、カルシウムホメオスタシス、シグナル伝達経路、代謝状態、および遺伝子転写に関するより多くの情報を得ることができます。これは、心臓病プロセス3,4,5,6,7の生理学的および病理学的メカニズムを明らかにする上で非常に有用である。動物研究のために、小さな(例えば、マウス、ラット、モルモット)から大きい(例えば、ウサギおよびイヌ)動物に及ぶ種が使用され得る。小動物は、通常、特にマウスが好ましく、遺伝的および疾患モデルの操作に適しているため8,9,10である。
急性に隔離されたCMの技術は、開発期間が長く、まだ進化しています11。ランゲンドルフ逆行灌流は、ラットおよびマウス、特に心室筋細胞(VM)12,13,14,15の単離に適用される最も成功し、再現性のあるCMの分離方法である。しかし、正常に分離された心筋細胞(AM)の報告は16,17,18に不足しています。臓器/系全体と細胞/細胞/細胞部の両方のレベルに関するさらなる調査は、最も一般的なタイプの不整脈である心房細動(AF)が世界的に普及し、現在の治療様式が約40%-50%のAF患者の約40%-50%で効果を発揮しないため、メカニズムを明らかにし、新しい治療アプローチを探求することが保証されています。.成人マウス CM の分離が成功することは、細胞研究の第一歩です。2 つの主な分離方法を使用できます: チャンク メソッドとランゲンドルフ メソッド。ランゲンドルフ灌流法では、組織消化は冠状動脈と毛細血管床に分岐する酵素溶液に依存する。大動脈弁を貫通し、冠状動脈オスティアを遮断することを避けることができる適切な大動脈カヌリンの深さは、効率的な消化および理想的なVM収量のための不可欠なステップでもあるこのような灌流パターンを達成する前提条件である。したがって、大オータカヌレーションの深さは、同様に心房の灌流に影響を与え、最終的にAM収量に影響を与える可能性があると仮定するのが妥当です。この仮説を検定するために、異なる深さで大オータカヌレーションを行い、対応するAM収率を比較した。データは、大オータのカヌレーション深さがAM収率に直接関連していることを示した。ここでは、AM と VM を同時に分離するプロトコルを導入する。
Protocol
20-30 g、8-10週齢の雄の雄のマウスは、中国の北京市立首都医科大学動物センターから購入しました。すべての実験手順は、資本医科大学動物のケアと使用委員会によって承認され、動物資源研究所によって提案され、国立衛生研究所によって発行された実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われました.Excel と Origin 8.5 は、データの取得と分析に使用されました。データはSD±手段として提示され、統計的評価のために、スチューデントのt検定が使用され、P<0.05が統計的に有意であると考えられた。
1. 溶液および灌流装置の準備
- 一定の流れランゲンドルフ装置(市販または自作)を組み立てる。 図 1 は、簡単な概略図を示しています。
- 表1および表2に示した試薬に従って溶液を調製する。
- 循環水浴をオンにし、適切な入力温度(当研究室では42.7°C)を調整して、カニューレからの透過循環システムの流出が37°Cに達するようにします。
- 脱イオン水を循環させることで、灌流システムを洗浄します。無菌状態が必要な場合は、15分間灌流システムを通して75%エタノールを実行し、続いて脱イオン水(心臓へのアルコール毒性効果を避けるために少なくとも10サイクル)を実行します。
- 灌流循環システムの1サイクルの時間と体積を測定し、次の灌流工程でロードされる酸素化タイローデの溶液のミリリットル数を決定します。
- 所望の方法ですべての外科用具を殺菌する。
- パーフュージド灌流システムの流量を4mL/minに設定します。
- タイローデの溶液(ペトリ皿1)を含む2つのきれいな35mmペトリ皿1、もう1つの含有溶液1(ペトリ皿2)を準備する。
- 溶液1で満たされた1mLシリンジと、先端までの距離が1mmのノッチを備えた20Gの鈍鋼カニューレ針を準備します。カニューレシャフトに3-0縫合糸で緩い結び目を準備します。実体顕微鏡の観察場を調整し、カニューレ先端がペトリ皿2の液面の下にあることを確認します。
2. 動物の準備
- 血栓を避けるために、マウスに腹腔内にヘパリン(濃度、1,000 IU/mL;0.2 mL/マウス)を投与する。10分後、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg、I.P.注射)でマウスを麻酔し、マウスが尾/つま先のピンチに反応しなくなるようにします。ヘパリン投与後20分で子宮頸部脱臼を行う。
- マウスを手術用プラットフォームに移し、マウスをスピービン位置に固定し、75%エタノールで胸部を殺菌し、ガーゼまたはナプキンで乾燥させます。
3. 心臓切除と大オータのカヌリン
- シフォイドの皮膚を組織鉗子で持ち上げ、ティッシュハサミで皮膚を通して軽度の横切開を行う。皮膚と筋膜の間に鈍い解剖を行い、両側の腋窩に向かってV字型の皮膚の切開を延長する。
- 肋骨ケージを通して同じ切開痕を続け、次に、胸骨を組織鉗子で締め付けて胸部ケージを上方に偏向させ、心臓と肺を完全に露出させる。
- 曲がった鉗子を使用して心膜を剥がします。胸腺が大きな血管を覆う場合は、2つの湾曲した鉗子で両側に向かって引き裂きます。「Y」形の血管(大動脈とその枝動脈)が見えるまで、湾曲した鉗子で心臓の基部を尾に向かってそっと引っ張ります。
- 大動脈の異なる長さをカヌル化と比較のために予約するには、左の一般的な頸動脈( 図2の緑色の線)で大動脈をトランセクトし、一部のマウスでは同時に対等に対して腕頭筋動脈を切断する。他のマウスにおける昇順大オルタでのトランセクト( 図2の黒線)。
注:この手順を使用する初心者のために、このステップは立体顕微鏡の下でも行うことができます。 - 心臓を切除し、ペトリ皿1に浸漬して残留血液を洗浄・送出する。
- 心臓をペトリ皿2に移し、必要に応じて細かいアイリスハサミを使用して余剰組織をトリミングする。この手順に新しい人のために、大根または他の心臓構造を誤って切断することを避けるために、実体顕微鏡の下でこのステップを行います。
- 大オータカヌルの前に気泡を排出するために注射器を押します。体型顕微鏡下で2つのストレートタイイング鉗子(滑らかな顎)の助けを借りて逆行大オルタカヌル化を行います。全体の缶めプロセスが液体表面の下にあることを確認します。
- 大動脈弁を貫通しないようにし、それぞれ上昇大動脈(大動脈が左の共通頸動脈で切除されたマウス)と大動脈根(大動脈が上昇大動脈でトランセクトされたマウス)に深さを調整する。
注: 大オータカニュールの深さ(単に 深さと呼ばれる)は、カニューレ先端が大オルタにある位置、または大オータが結ばれている位置として定義されます。 - 前ノット3-0縫合糸で大間をカニューレノッチにリゲートします。注射器の内容を軽く押して、残りの血液をすすきます。
注:血液は冠状動脈を離れ、深さが適切に配置されている場合は、後側静脈からエフューズします。心臓と心房の付属物は拡大し、青白くなります。 - カニューレを取り外し、ランゲンドルフ装置に接続します。もう一度、心に入る気泡を避けるように注意してください。
注:回間術から初期灌流までの時間は5分を超えないようにしてください。
4. 心臓灌流
- まず、約10秒のティーマーチとパーフューズされたタイロードの溶液(このプロトコルで使用されるシステム内で10sを流す液体の体積は約0.7mL)、アトリアに残留血液がある場合、次いで溶液1に切り替える。しかし、アトリアに残留血液がない場合は溶液1を浸透するだけである。約2分間、心臓をささげます。
- ソリューション 3 に切り替えます。溶液3の約2.5mLを1回使用の滅菌ポリエチレンピペで吸い、後で使用するために水浴に前温し、残りは約11〜12分間灌流に使用する。最初の2分で液3を捨てる。消化が完了するまで再使用するために蠕動ポンプによってパーフューズ貯留に残りをリサイクルします。
- 心が腫れて少し薄くフラクシッド(スポンジ状の質感)に変わったとき、または心筋が歯付き鉗子を使用して穏やかにつままれた場合は、消化を終了します。
5. 細胞の分離とカルシウム再導入
- 鉗子で心室と心房を取り除き、別のペトリ皿に置きます。ペトリ皿に温め込み溶液3を加えます。
- 鈍い鉗子で組織を濁った質感にトリチュレートし、組織を穏やかにピペットして消化さえします。気泡の導入は避けてください。
- 濁った消化組織をピペットを溶液4に移して残りの酵素活性を阻止し、次いで192×gで20sの遠心分離機を取り込んだ。上清を取り出し、溶液5を細胞沈降物とピペットに加えて細胞を均一に分散させる。
- カルシウムパラドックスとカルシウム過負荷を避けるために、段階的にカルシウムを再導入する。徐々に50 μL 100 mM/L CaCl2 (5分間隔毎に5 μL、10 μL、15 μL、20 μL)を細胞懸濁液に徐々に加えます。
6. セルストレージ
- パッチクランプスタディでは、細胞をTyrodeの溶液に保存します。他の細胞研究のために、細胞を溶液6に保存する。
- 急性機能研究の精度を確保するために、急性機能研究の精度を確保するために、(例えば、Ca2+ 火花、Ca2+ 波、Ca2+ リリース、Ca2+ リーク、およびパッチクランプ記録)、次の6時間以内に機能実験のこれらの種類を終了します。
Representative Results
この論文は、大介カヌルの深さ(単に 深さと呼ばれる)として定義される大オータにカニューレ先端が位置するところ、大間が連結される場所も表している。昇順大オルタでカニューレートされ、結紮された心臓から分離されたAMおよびVMは、それぞれAMAAおよびVMAAとして表される。また、大動脈根でカニューレ化および連結された心臓から分離されたAMおよびVMは、それぞれAMARおよびVMARとして表される。 図2 は大動脈と横断位置の概要を示しています。また、 図3 は、大動脈の横断位置に対応する深さおよびライゲーション場所を示す。深さは、心房および心房の付属物の灌流に関連していた。両心房付属器は、カニューレ先端が上天大陸にあるときに膨脹し、十分な心房灌流を示す。しかし、大動脈根で、心房灌流が不十分であり、両方の心房付属物が拭き取られた(図4)。カルシウム再導入後の異なる深さで、カニュード心臓から分離されるCM形態と生存率(図5)。AMAA、AMAR、VMAA、およびVMARの細胞形態は、カルシウム再導入前後の共焦点顕微鏡下にあります。AM はスピンドル型ですが、VM は長方形の端を持つ棒状です。さらに、AM と VM には、膜が完全に残っており、輪郭がはっきりしていて、サルコメアがはっきりし、滑らかに表面化しています(図 6)。細胞生存率はトリパンブルー染色を介して評価した。無傷の膜を持つ正常な細胞はトリパンブルーを除外することができ、染色されませんが、細胞の損失活性は細胞内ですぐにトリパンブルーを蓄積します(図7)。AM と VM は、セルカウントを実行するために別のオブジェクト スライドに配置されました。AMの総収量と生存率(生存率)の割合は、細胞懸濁液の10μLを物体スライドに移し、4×10視野で反転相差顕微鏡で数えることによって決定した。同じ方法を使用して、VM の総収量 (棒状) と実行可能な VM の割合を決定しました。この方法は、そのサイズと形状のためにCMが容易にヘモサイトメーターの計面積に分配しなかったので、ヘモサイトメーターを使用する方が好ましい。棒グラフ(図8)は、カルシウム再導入前後のAMAA、AMAR、VMAA、およびVMARの生存率を示しています。各値は、10匹のマウスからのSD±平均を表す。カルシウム再導入前、AMAAの生存率はAMAR(70.9%±2.8%、41.0%±5.2%と比べて有意に高い。 p < 0.01)カルシウム再導入後、AMAAの生存率はAMAR(69.4%±3.0%、37.7%±4.9%とそれぞれ4.9%と比べて有意に高くなります。 p < 0.01)
VMAAの生存率はVMARの生存率と変わらない(89.5%±2.7%対88.1%±2.6%; カルシウム 再導入前にp > 0.05)同様に、VMAAの生存率はVMARの生存率(82.2%±1.9%対82.9%±1.6%とそれぞれ異なっていなかった。 カルシウム 再導入後>0.05)。
このプロトコルが推奨する深さで心臓(上昇大オルタ)、カルシウム再導入後、実行可能なVMとAMの収量はそれぞれ約410万と約180,000です。単離されたAMおよびVMにおけるナトリウム電流(図9A、B)と電流密度(図9C)の全細胞パッチクランプ記録は、細胞の品質が電気生理学的実験の要件を満たしていることを確認した。大動脈の解剖学(図10)は、心房の血管のオチウムが大動脈根付近にあり、冠状動脈(CA)のオシウムに隣接していることを示している。 表3 は、カニューレ先端から、上昇大動脈および大動脈根で連結された心臓のCAオシウムまでの距離をそれぞれ示す。
図 1.組み立てられた変更されたランゲンドルフシステムの概略図。 このシステムは、ユーザーにとって経済的で携帯性が高い。それは水のためのプラスチック管1の2つの部分(内径、8 mm)およびパーフューザート(内径、1.5 mm)のための1つを有し、そのうち遠位端はLuerロックを備えたPE医学の三方停止所に接続される。熱交換器として、水とゴム栓を含むガラス瓶。パーフューサートは、蠕動ポンプによって熱交換器のプラスチックチューブに送り込まれ、カニューレに接続された三方向のストップコックから出てきます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.大オルタと周りの組織。 「Y」形の血管構造は、大動脈とその枝である、腕頭筋動脈(矢印1)と左共通頸動脈(矢印2)である。左の一般的な頸動脈(緑色の線)の間の大動脈をトランセクトし、同時にいくつかのマウスで腕頭筋動脈を切断;他のマウスにおける昇順大オルタ(黒線)での経転(立体顕微鏡10×2倍)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.カニュールハートの正面図。 黒い曲線は、左の一般的な頸動脈の間に切り替えられた大動脈の切開端を表す。赤い曲線は、昇順大オルタでトランセクトされた大オルタの切開端を表します。直線は大動脈が結紮された場所を表します:上がる大動脈では黒、大動脈根では赤(実体顕微鏡10×2倍) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.カニュードハートの灌流状態。 心房は十分に浸透しており、両方の心房付属器は、心臓(A)でカニューレ化され、上昇大陸で結紮される。しかし、心房付属物はいずれも心臓(B)でカニューレ化され、大動脈根で結紮され、不十分なアトリア灌流を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.カルシウム再導入後の細胞形態と生存率評価 上昇大大通でカニューレートおよび結紮された心臓から分離されたAM(A)およびVM(B)は、それぞれAMAAおよびVMAAとして表される。大動脈根でカニューレートおよび結紮された心臓から分離されたAM(C)およびVM(D)は、それぞれAMARsおよびVAMORとして表される。高品質のCMは静止しており、無傷の膜、明確な輪郭、明確な縞質サルコメア、滑らかな細胞表面を持っています。AM はスピンドル型ですが、VM は棒またはレンガ状の形状で、長方形の端が付いています。膜内でブレブを自発的に収縮させたり含んでいるCMは質が悪く、球形に縮むCDは死んだ細胞です。ランダム視野(蛍光顕微鏡、10×10倍、スケールバー、100μm)。AM =心房筋細胞、VM=心室筋細胞。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.カルシウム再導入前後の共焦点顕微鏡下での細胞形態 カルシウム再導入前、AMAA(A)とAMAR(C)は、明確な輪郭、縞状のサルコメア、滑らかな膜表面を持つスピンドル状です。カルシウム再導入後、AMAA(B)とAMAR(D)は、明確な輪郭、縞状のサルコメア、滑らかな膜表面を持つスピンドル状でもあります。カルシウム再導入の前に、VMAA(E)とVMAR(G)は、明確な輪郭、線条体、および長方形の端を持つ滑らかな膜表面を持つ棒またはレンガ状です。カルシウム再導入後、VMAA(F)およびVMAR(H)は、明確な輪郭、縞状のサルコメア、および長方形の端を持つ滑らかな膜表面(共焦点顕微鏡油、63倍×10倍、スケールバー、50μm)を持つロッドまたはレンガ状の形状でもあります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.細胞生存率評価。 活性を失う損傷細胞は、トリパンブルーによって染色されます。対照的に、生細胞はトリパンブルー(蛍光顕微鏡、4×10倍、スケールバー、100μm)で染色することはできません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8. カルシウム再導入前後のAMAA、AMAR、VMAA、およびVMARの生存率を示す棒グラフ。CR = カルシウム再導入。各値は、10匹のマウスからのSD±平均を表す。p < 0.01. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 内容物(異なる方法で指定しない場合は、mmol/Lでの最終濃度) | 著名 |
| 灌流液(溶液1) | 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 タウリン, 5 グルコース, 10 2,3-ブタンジオン単一体 (BDM) | 4°Cで3日間保存できます。 グルコース、 タウリンおよび BDM は実験の日に加えます。各心臓に対して200mLの灌流液を用意します。 |
| タイロードのソリューション(ソリューション2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 グルコース | 4°Cで3日間保存できます。 CaCl2 とグルコースは実験の日に加え、PHメーターで室温(28-30°C)で飽和NaOHで7.3-7.4にpHを調整します。 |
表 1.大人マウスCM分離のためのソリューション。
| 解決 | 内容 | 著名 |
| 消化液(溶液3) | 25 mL溶液1、6μL 100 mM/L CaCl2、25mgコラゲローゼII、50μL(2.5%10×)トリプシン | 各心臓について |
| ソリューション 1 (ソリューション 4) を停止する | 9 mL溶液 1,1 mL FBS (牛胎児血清), 4μL 100 mM/L CaCl2 | 各心臓について |
| ソリューション 2(ソリューション 5) を停止する | 9.5 mL溶液 1,0.5 mL FBS(胎児ウシ血清)、4μL 100 mM/L CaCl2 | 各心臓について |
| 細胞リサスペンション溶液(溶液6) | 13 mL溶液1、7μL 1M/L CaCl2、BSA(ブル血清アルブミン)は、液体の表面を覆う薄い層を形成することができる用量で | 各心臓について |
表 2.大人のマウスCMの分離および貯蔵のための解決。
図 9.ナトリウムチャネルの電流電圧曲線。全細胞パッチクランプ技術は、電圧クランプモードで孤立した心筋細胞のナトリウム電流を記録するために使用されました。電圧クランププロトコルは、差し込み中に示されています。AM(A)およびVM(B)から記録されたナトリウム電流を示す。−45mV、−40mV、および−35 mVの電位の電流密度は、AM(−32.71±1.597 pA/pF、−31.49±1.820 pA/pFで有意に高い。 および -29.34 ± 1.939 pA/pF、n = 10) VM (-17.66 pA/pF ± 1.976 pA/pF、-21.09 ± 1.560 pA/pF、および -21.86 ± 1.381 pA/pF; = 8; P < 0.05)。(C) I-V曲線は、細胞容量に正規化されたナトリウム電流密度を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10。心房の起源と分布。 パネルAの心房(矢印1)とCA(矢印2)は、心房容器(矢印3)を詳しく見ている。(C) 2つの異なるサイズのオスティアが存在します。一方(矢印4)は、心房付属器を灌漑した心房容器に対応し、もう一方(矢印5)はCA(実体顕微鏡10×5倍)に対応する。CA = 冠状動脈. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| マウスのシリアル番号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| 大大通りの深さは、上昇大オルタにあります | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| 大動脈のカンヌレーションの深さは大動脈根にある | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
表 3.カニューレ先端から冠状動脈オシウムまでの距離。 C57BL/6マウスの心臓(n=20)をそれぞれ、上昇大動脈と大動脈根の深さで大動脈をカンニュートし、リゲートするために使用した。大オルタを解剖し、カニューレ先端からCAオシウムまでの距離を測定した。距離はミリメートル単位で測定され、正または負の兆候はCAオシウムの上下のカニューレ先端をそれぞれ表します。
Discussion
シングルCMは、心機能および疾患20の細胞レベルの研究において貴重かつ不可欠なツールである。したがって、実行可能な CM を心臓から分離することが、最初で最も重要なステップです。細胞の品質は、特に光学および電気生理学的実験において、実験を成功させるための重要な決定要因の1つです。他の動物のCMと比較して、げっ歯類のCMは、Na+/Ca2+ 交換器21を介してカルシウム流入を支持する細胞内ナトリウムイオンの濃度が高いため、虚血および低酸素症に対してより脆弱である。さらに、AM の数は VM の数よりはるかに少ないです。したがって、分離の成功は非常に困難です。ランゲンドルフ法はマウス VM22 の分離に優れていますが、AM の単離の成功率は低く、利用可能なレポートはほとんどありません。大オータカヌル化の適切な深さは、バッファー調製に使用される温度、酵素活性、PH、水質以外の理想的なVMを得る上でも不可欠な要素です。ランゲンドルフ法の原理は、心臓の逆行灌流に依存しています。灌流の際、大動脈弁は閉じられます。それにより、パーフューザ剤は冠状動脈に押し込まれ、血管の枝を通して酵素溶液を送達し、心筋組織が均等に消化される。この種の循環パターンを達成するために、大動脈はカニュール化および結紮のために十分な長さを予約しなければならず、またカニューレ先端が大動脈弁を貫通したり、CAオチウムをブロックしたりしてはならない。したがって、大腸カヌル化の深さは、アトリア灌流にも関連しており、これは同様の方法で心房の消化効果とAMの収量に影響を与えると推測するのが妥当である。ここで提示されたプロトコルは仮説を確認し、提案と共に細胞収量を最適化するための重要なステップは以下に記されている。
ステップ1.9では、大動脈をより良く確保するために、先端までの距離が1mmであるところからノッチ(または周溝)を有する鈍い20Gカニューレが推奨される。私たちの経験に基づいて、大動脈の直径よりも少し大きいカニューレサイズは、その本質的な弾力性に依存する大動脈がカニューレにぴったり収まり、深さを調節する際に保護因子として機能する大動脈先端が大動脈弁を穿刺するのを防ぐことが判明した。ノッチの位置に関しては、カニューレ先端の近くにある場合、心臓は重力のためにカニュールの間に簡単に滑り落ちる。逆に、カヌレーション深度とライゲーション位置を調整する空間は、遠すぎると非常に限りになります。このような状況を考えると、左共通頸動脈間の大動脈を( 図2の緑色の線として)トランセクトして、大動脈が十分に長く、上昇大動脈でカニューレ化および結紮が可能であることを確認することが、ステップ3.3で優れている。上昇大動脈でのトランセクトに対して、カニューレ化のための予約長は少なくとも大動脈根に近いカニューレ先端を確保することができ、結紮後に大動脈弁を貫通しない。大動脈の解剖学とカニューレ先端からCAオシウムまでの距離の測定は、左の共通頸動脈間の大動脈をトランセクトすることが適切な大動脈カニュール化深度を達成するのに理想的な位置であることを示している。
カヌレーション深度は、心房の灌流に関連していることが判明し、これは深さの指標として機能する。 図4 は、深さが昇天大陸にあり、両方の心房付属物が膨張する場合に、心房灌流が良好であることを示す。しかし、深さが大動脈根にあり(または接近する)場合には、心房灌流は不十分であり、両方の心房付属物が拭き取られた。膨張した心房の付属物から得られたAMの合計および実行可能な数は、より高かった(図8)。これらの知見は、大大腸のカヌレーション深度が、心房および心房付属物の灌流および消化に一定の方法で影響を及ぼし、最終的にAMの収量および品質に影響を与える可能性があることを示している。AMの収率と品質は、アトリアを供給する船舶の分布に関連すると推測された。フェルナンデスらの研究は、マウスCAの起源と経過における様々な異常を実証した。 その結果、CAオスティアは非常に可変的であり、すべて大動脈の大動脈に位置しているわけではないことがわかった。一部のCAは、高離陸オスチウムと名付けられた大動脈洞の上から異常に発生する可能性があります。一部のCAは同じ大動脈大動脈に由来し、心房容器のオシウムがすぐ近くにあります。本研究における大オルタの解剖学(図10)もフェルナンデスの発見と一致している。これは、Cannulationの深さが適切でない場合、ランゲンドルフ法によってAMを分離しようとする試みがほとんど失敗した原因である可能性があります。したがって、カニューレ先端は、カニューレ先端とCAオシウムの間に十分なスペースがない場合、CAオシウムに隣接するアトリウム容器オシウムを遮断する可能性が高くなります。対照的に、大動脈弁がカニューレ先端によって貫通しない限り、心室の灌流および細胞収量はほとんど影響を受けなかった。これは、心室に血液を供給するCAがより大きなオスティアとより多くの起源を有するためと考えられます。1つのオスチウムがカニューレによって閉塞された場合、心室灌流は別のCAまたは副循環によって補償され、心房を供給する血管はかなり小さく、代用品を持たない。したがって、大オータカヌル化における深さの影響が重要である。
消化および細胞保存プロセスにおけるその他の注目すべき要因とトラブルの撮影は、以下の通りです。まず、ステップ4.1で酸素化されたタイロードの溶液を浸透させて筋肉の収縮を行い、大腸結紮後にアトリアの血液が急いで出ていない場合は残留血液を送り出すことを検討する。これは、損傷した赤血球から放出されるca2+および他の材料の悪影響を避けるのに役立ちます。第二に、CA2+フリー溶液を事前に浸透させることで、細胞間の接続を解離し、細胞間の空間を広げて、CM間のインターカロ化されたディスクがカルシウム依存性の細胞間接合部であるため、酵素消化の有効性を向上させることができます。しかし、カルシウムパラドックス現象24を避けるために、時間は3〜5分に制限されるべきです。混合酵素溶液をお勧めします。コラゲラーゼII型は細胞外マトリックスネットワークを破壊し、コラゲラーゼIIの消化が不完全な場合、トリプシンは細胞表面に残る粒状物質をクリアするのに役立ちます。これにより、パッチクランプ記録でGΩシールを形成する上で重要な滑らかなセル表面が保証されます。それにもかかわらず、トリプシン濃度は、膜タンパク質を分解することができるので、過剰な消化および細胞損傷を避けるために適切な範囲で制御されるべきである。細胞収量を改善するためにコラゲターゼII型を単独で使用すると、しばしば消化を超える組織につながり、分離されたCMは、コラゲナーゼ暴露の後にカルシウム不耐症になる25。ミオシンATPaseを阻害し、架橋形成を防止することによって自発的な収縮を防ぐ物質である2,3-ブタネジオン単一体(BDM)の使用は、まだ議論の余地がある26,27,28,29。以前の経験によると、BDMを追加することは、このプロトコルのために必要です。酵素溶液は溶液1で調製したが、溶液1はカルシウムを含まないが、カルシウムを添加して酵素を活性化させる。灌流液にBDMを添加する利点は、(1)筋細胞の収縮を阻害し、酵素溶液灌流中の酸素消費量を減少させ、(2)低酸素から筋細胞を予防し、単離された筋細胞の品質を改善することである。いくつかの研究は、BDM が細胞の電気的特性に潜在的な悪影響を持っている可能性があることを報告.しかし、ナトリウム電流の全細胞パッチクランプ記録の結果は望ましくない効果を示さなかった。細胞貯蔵工程(ステップ6)では、多くの研究がKB緩衝液、カルシウムを含まないが高カリウム濃度溶液を選択しており、細胞は二極化し、代謝状態が低いため、より良い状態を維持することができる。しかし、細胞膜のグリコカリックスは、一定の時間外生性カルシウムが存在しない場合に脂質二重層から分離し、膜透過性が増加し、その後の機能解析に影響を及ぼす30,31,32。
すべての筋細胞の分離技術は、本質的に酵素溶液中の チャンク (組織の小片)消化または酵素溶液(ランゲンドルフ灌流)22のCA灌流のいずれかに本質的に分類することができる。ランゲンドルフ法と比較すると、 チャンク 消化法は実行が容易であり、多くの研究室でCMを分離するために日常的に使用されています。しかし、この方法は通常、成体組織22から低品質のCMの低収率を生成する。また、この方法により単離された細胞は、比較実験を行うには適さない場合がある。たとえば、AM と VM の間で細胞タイプ固有の薬物効果をテストする場合、異なる分離条件の影響を無視または除外することはできません。心筋と心室の組織密度は心房のそれよりもはるかに厚く、密度が高く、消化時間と酵素濃度が異なるためです。さらに、消化中の組織の過度の攪拌およびピペッティングは、細胞を損傷し、機能的研究に大きな影響を与える。さらに、多くの以前の研究では、AMがカルシウムに対してより脆弱であることを示しています。しかし、現在のプロトコルによって単離されたAMは、おそらく消化プロセスの終わりに組織が破裂しやすいため、勾配カルシウム再導入に耐性を持つことができます。したがって、機械的損傷は少なく、チャンク法のステップは破裂と遠心を繰り返す必要があるため、細胞はより機械的な損傷を受けるであろう。最近では、Ackersら.33 は、実行可能な心臓筋細胞および非筋細胞の単離のための簡便なランゲンドルフフリーの方法を報告した。VMと線維芽細胞は効果的に単離することができますが、AMの量は言及されていませんでした。ただし、このプロトコルには、いくつかの制限があります。第一に、心臓血管の分布は、個々の違いとマウス株のバリエーションを有し、推奨されるカヌレーション深さは、各時間の成功したAMの分離を保証することはできません。第二に、この手順に新しい人のために大動脈トランセクションと逆行大動脈カニューレ化を練習するために一定の時間を要するかもしれません。最後に、この方法は、健康および高齢のマウスを除く他の心臓病モデルでは試験されなかった。したがって、それは、心臓の線維症の程度のために酵素濃度と消化時間の調整を必要とします。チャンク法で遭遇する異なる消化条件の欠点は、酵素溶液が容器床によって組織に均等に分布するランゲンドルフ法では問題ではない。
要約すると、ここで説明する単一AMとVMの同時分離のためのプロトコルは、適切な大オータカヌレーション深さがアトリウム灌流およびAM収量を効果的に改善できることを実証した。この方法で分離されたCMは高品質で、良好なカルシウム耐性を有し、team34のパッチクランプ記録およびカルシウム処理(IonOptixシステムによるCa2+リリースおよびCa2+波測定)に正常に適用されています。隔離プロトコルは、一連の細胞および細胞内調査において細胞の調製に使用できることが期待され、心臓生理学と病理の理解を深めるのに役立ちます。重要なことに、それはより臨床的に関連する心臓病のメカニズムおよび介入方法の発見を可能にする。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(81770322、81870244、81500254、81870243、81470465)と北京自然科学財団(no. 7192051)の助成金によって支えられました。著者の貢献:バイと劉は、プロジェクトを設計し、考案しました。ウェンとルアンは実験に貴重なアドバイスを提供した。呉とリンリーは実験作業を行い、データ取得、分析、解釈において重要な役割を果たしました。李はランゲンドルフ装置の組み立てに参加した。実験前に、Peng、Zhang、Wang、Yangが試薬と溶液の調製に参加しました。呉は記事を書いた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
- Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
- Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
- Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
- Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
- Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
- Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
- Dobrev, D., Wehrens, X. H. T.
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109 (2014).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823 (2014).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606 (2016).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).
