Summary
该协议描述了Langendorff方法的修改，包括主动脉插管的深度，以便同时从成年小鼠中分离心房和心室肌细胞。
Abstract
单个心肌细胞是心脏生物学和疾病的细胞和亚细胞水平研究中的重要工具，作为收缩和电活动的基本单位。因此，从心脏中分离出活的高质量心肌细胞是初始也是最关键的实验步骤。比较分离成年小鼠心肌细胞的各种方案，Langendorff逆行灌注是文献中报道的最成功和可重复的方法，特别是对于分离心室肌细胞。然而，从灌注的心脏中分离出高质量的心房肌细胞仍然具有挑战性，并且很少有成功的分离报告。解决这个复杂的问题非常重要，因为除了心室疾病，心房疾病占心脏病的很大一部分。因此，有必要在细胞水平上进行进一步研究以揭示其机制。本文介绍了一种基于Langendorff逆行灌注法的方案，对主动脉插管深度进行了一些修改，并同时对可能影响消化过程的步骤进行了一些修改，以分离心房和心室肌细胞。此外，分离的心肌细胞被证实适合膜钳检查。
Introduction
心脏病是全球主要死亡原因之一1。为了解决医疗保健系统的这一负担，深入了解心脏的生理学和病理学至关重要。除了整只动物和完整的心脏准备外，细胞准备是功能和疾病研究的另一个不可或缺的工具2。通过应用膜片钳，钙成像，分子生物学和其他先进技术，研究人员可以获得有关单个心肌细胞（CM）中的电生理特性，钙稳态，信号通路，代谢状态和基因转录的更多信息。这对于揭示心脏病过程的生理和病理机制非常有帮助3，4，5，6，7。对于动物研究，可以使用从小型（例如，小鼠，大鼠和豚鼠）到大型（例如，兔子和狗）的动物。小动物通常是首选，特别是小鼠，因为它们适合遗传和疾病模型操纵8，9，10。
急性孤立的CM技术经历了漫长的发展期，并且仍在不断发展11。Langendorff逆行灌注是应用于大鼠和小鼠的最成功和可重复的CM分离方法，特别是用于分离心室肌细胞（VMs）12，13，14，15。然而，成功分离心房肌细胞（AMs）的报道很少16，17，18。有必要对整个器官/系统和细胞/亚细胞的两个水平进行进一步研究，以揭示其机制并探索新的治疗方法，因为心房颤动（AF）是最常见的心律失常类型，在全球范围内越来越普遍，并且目前在药物治疗和心脏消融术中的治疗方式在大约40%-50%的AF患者中仍然无效19.成功的成年小鼠CM分离是细胞研究的第一步。可以使用两种主要的隔离方法：chunk 和 Langendorff 方法。在Langendorff灌注法中，组织消化取决于冠状动脉及其分支输送到毛细血管床的酶溶液。适当的主动脉插管深度可以避免穿透主动脉瓣并阻塞冠状动脉口，这是实现这种灌注模式的先决条件，这也是有效消化和理想VM产量的关键步骤。因此，可以合理地假设主动脉插管的深度可能同样影响心房血管的灌注，并最终影响AM产量。为了验证这一假设，在不同深度进行了主动脉插管，并比较了相应的AM产量。结果表明，主动脉插缝深度与AM产量直接相关。本文介绍了一种同时隔离AM和VM的协议。
Protocol
从中国北京首都医科大学动物中心购买体重20-30g，8-10周龄的成年雄性C57BL / 6小鼠。所有实验程序均由首都医科大学动物护理和使用委员会批准，并按照动物资源研究所提出并由美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》进行。Excel和Origin 8.5用于数据采集和分析。数据以SD±均值呈现，用于统计评估，使用学生t检验，P <0.05被认为具有统计学意义。
1. 溶液和灌注装置的制备
- 组装恒流朗根多夫设备（市售或自制）。 图1 提供了一个简单的原理图。
- 根据表1和表2中给出的试剂制备溶液。
- 打开循环水浴并调整合适的输入温度（我们实验室为42.7°C），以确保灌注液循环系统从套管流出的量达到37°C。
- 通过循环去离子水清洁灌注系统。如果需要无菌情况，通过灌注系统运行75%乙醇15分钟，然后去离子水（至少10个周期以避免酒精对心脏的毒性作用）。
- 测量灌注液循环系统一个周期的时间和体积，以确定在以下灌注步骤中要加载多少毫升含氧Tyrode溶液。
- 以所需的方法对所有手术工具进行消毒。
- 将灌注液灌注系统的流速设置为 4 mL/min。
- 准备两个干净的35毫米培养皿 - 一个含有Tyrode溶液（培养皿1），另一个含有溶液1（培养皿2）。
- 准备一个1 mL注射器，里面装满溶液1和20 G钝钢套管针，其缺口距离为1 mm到尖端。准备一个松散的结，用3-0缝合线到套管轴上。调节立体显微镜的视野，确保套管尖端低于培养皿2的液体表面。
2. 动物准备
- 腹腔内给小鼠注射肝素（浓度，1，000 IU / mL;0.2 mL /小鼠）以避免血栓。10分钟后，用戊巴比妥钠（50mg / kg，IP注射液）麻醉小鼠，并确保小鼠停止对尾部/脚趾捏合的反应。肝素给药后20分钟进行宫颈脱位。
- 将小鼠转移到手术平台上，将小鼠固定在仰卧位置，用75%乙醇对胸部进行消毒，然后用纱布或餐巾纸干燥。
3. 心脏切除和主动脉插管
- 用组织钳抬起镰刀的皮肤，并用组织剪刀在皮肤上做一个小的侧切口。在皮肤和筋膜之间进行钝性解剖，并将皮肤切口以V形向两侧的腋窝延伸。
- 通过肋骨笼继续相同的切口痕迹，然后，通过用组织镊子夹住胸骨来完全暴露心脏和肺部，从而向上偏转肋骨笼。
- 使用弯曲的镊子剥离心包。如果胸腺覆盖了大血管，则用两个弯曲的镊子向两侧撕裂胸腺。用弯曲的镊子轻轻地将心脏底部向尾巴拉动，直到可以看到"Y"形血管（主动脉及其支动脉）。
- 为了保留不同长度的主动脉进行插管和比较，在一些小鼠中横切左颈总动脉的主动脉（ 图2中的绿线）并同时切割臂头动脉。其他小鼠升主动脉处的横断面（ 图2中的黑线）。
注意：对于那些不熟悉此程序的人，也可以在立体显微镜下完成此步骤。 - 切除心脏，立即浸入培养皿1中，清洗并泵出残留的血液。
- 将心脏转移到培养皿2中，并在必要时使用精细的虹膜剪刀修剪任何多余的组织。对于那些不熟悉此程序的人，请在立体显微镜下执行此步骤，以避免错误地切割主动脉或其他心脏结构。
- 在主动脉插管之前推动注射器排出气泡。在立体显微镜下两个直系镊子（光滑的下颌）的帮助下进行逆行主动脉插管。确保整个插管过程都在液体表面下。
- 避免穿透主动脉瓣，并分别调整升主动脉（主动脉在左颈总动脉横切的小鼠）和主动脉根部（主动脉在升主动脉处横断的小鼠）的深度。
注：主动脉插管的深度（ 简称深度）在这里定义为导管尖端在主动脉中的位置或主动脉结扎的位置。 - 用预结3-0缝合线将主动脉固定到套管缺口。轻轻按压注射器内容物以冲洗残留的血液。
注意：如果深度位置正确，血液将离开冠状动脉并从背静脉喷出。心脏和心耳会扩大并变得苍白。 - 取出套管并将其连接到朗根多夫装置。再一次，注意避免任何气泡进入心脏。
注意：请注意，从开胸到初始灌注的时间不应超过5分钟。
4. 心脏灌注
- 首先，如果心房中有残留的血液，则对氧化的Tyrode溶液进行预注并灌注约10秒（本方案中使用的系统中运行10秒的液体体积约为0.7mL），然后切换到溶液1。但是，如果心房中没有残留血液，只需用溶液1灌注即可。给心脏灌注约 2 分钟。
- 切换到解决方案 3。用一次性无菌聚乙烯移液管吸入约2.5mL溶液3，并将其在水浴中预热以备后用，其余用于灌注约11-12分钟。在前2分钟内丢弃灌注的溶液3。通过蠕动泵将其余部分回收到灌注液储液槽中，以便重复使用，直到消化完成。
- 当心脏肿胀并变得略微苍白和松弛（海绵状纹理）时终止消化，或者如果使用齿镊子轻轻捏住心肌，则存在印记。
5. 细胞分离和钙的再引入
- 用镊子取出心室和心房，并将它们放在不同的培养皿中。将预热溶液3加入培养皿中。
- 用钝镊子将组织研磨成浑浊的质地，并轻轻地移液组织以均匀消化。避免引入气泡。
- 用移液管将浑浊的消化组织转移到溶液4中以阻止剩余的酶活性，然后在192×g下离心20秒。除去上清液并将溶液5加入细胞沉淀物中并移液以均匀分散细胞。
- 逐步重新引入钙，以避免钙悖论和钙超负荷。逐渐向细胞悬浮液中加入总共50μL 100 mM / L CaCl2 （分别以5μL，10μL，15μL和20μL的间隔每5分钟一次）。
6. 细胞储存
- 对于膜片钳研究，将细胞储存在Tyrode的溶液中。对于其他细胞研究，将细胞储存在溶液6中。
- 为了确保急性功能研究（例如，Ca2 + 火花，Ca2 + 波，Ca2 + 释放，Ca2 + 泄漏和膜片钳记录）结果的准确性，请在接下来的6小时内完成这些类型的功能实验。
Representative Results
本文将套管尖端定位在主动脉中，其定义为主动脉插管的深度（简称为 深度），也代表了主动脉的结扎位置。从在升主动脉处管和结扎的心脏隔离的 AM 和 VM 分别表示为 AMAA 和 VMAA 。此外，从在主动脉根部管和结扎的心脏隔离的 AM 和 VM 分别表示为 AMAR 和 VMAR 。 图2 显示了主动脉和横断面位置的概览。此外， 图3 显示了与主动脉横断位置相对应的深度和结扎位置。深度与心房和心耳的灌注有关。当套管尖端位于升主动脉时，两个心耳均充气，表明心房灌注充分。然而，当在主动脉根部时，心房灌注不足，两个心耳都枯萎（图4）。钙重新引入后从不同深度的插管心脏分离的CM形态和活力（图5）。AMAA，AMAR，VMAA和VMAR的细胞形态在钙重新引入之前和之后的共聚焦显微镜下。AM 是主轴形的，而 VM 是杆形的，末端是矩形的。此外，AM和VM具有完整的膜，清晰的轮廓，清晰的条纹肌节和光滑的表面（图6）。通过台盼蓝染色评估细胞活力。具有完整膜的正常细胞可以排除台盼蓝并且不会被染色，而细胞丧失活性将在细胞内迅速积累台盼蓝（图7）。将AM和VM放置在不同的对象幻灯片中以执行细胞计数。通过将10μL细胞悬浮液转移到物体载玻片上并在4×10个视场的倒置相差显微镜下计数，确定AM的总产量和活纺锤形CM的百分比（存活率）。使用相同的方法确定 VM（杆形）的总产量和可行 VM 的百分比。这种方法比使用血细胞计数器更可取，因为CM由于其大小和形状而不容易分布到血细胞计数器的计数区域。条形图（图8）显示了钙再引入前后的AMAA，AMAR，VMAA和VMAR的存活率。每个值代表来自10只小鼠的SD±平均值。在钙重新引入之前，AMAA的存活率显着高于AMAR（70.9%±2.8%和41.0%±5.2%; p < 0.01）。钙再引入后，AMAA的存活率明显高于AMAR（69.4%±3.0%和37.7%±4.9%; p < 0.01）。
VMAA存活率与VMAR没有差异（89.5%±2.7%与88.1%±2.6%; p >0.05）钙重新引入之前。同样，VMAA存活率与VMAR的存活率没有差异（82.2%±1.9%与82.9%±1.6%; p >0.05）钙重新引入后。
按照该协议的建议（在升主动脉处）在深度插管的心脏，在钙重新引入后，可行的VM和AM的产量分别约为410万和约180，000。在隔离的AM和VM中记录钠电流（图9A，B）和电流密度（图9C）的全细胞膜片钳证实细胞质量已满足电生理实验的要求。主动脉的解剖结构（图10）显示，心房血管的口靠近主动脉根部，并且与冠状动脉（CA）的口相邻。 表3 分别显示了分别在升主动脉和主动脉根部插管和结扎的心脏的插管尖端到CA口的距离。
图 1.组装的修改过的朗根多夫系统的示意图。 该系统对用户来说既经济又便携。它有两部分塑料管 - 一部分用于水（内径，8毫米），一部分用于香水（内径，1.5毫米） - 其中远端连接到带有鲁尔锁的PE医用三向旋塞阀。装有水的玻璃瓶，带有橡胶塞形式作为热交换器。香水通过蠕动泵泵入热交换器中的塑料管中，并从连接到套管的三向旋塞阀中出来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2.主动脉和周围的组织。 "Y"形血管结构是主动脉及其分支：臂头动脉（箭头1）和左颈总动脉（箭头2）。在左颈总动脉（绿线）之间横断主动脉，同时切开一些小鼠的臂头动脉;在其他小鼠的升主动脉（黑线）处的横断面（立体显微镜10×2放大倍率）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3.被封堵的心脏的正面视图。 黑色曲线代表主动脉的切口边缘，该切口边缘在左颈总动脉之间被横切。红色曲线代表在升主动脉处剖面的主动脉的切口边缘。直线代表主动脉结扎的位置：升主动脉处为黑色，主动脉根部为红色（立体显微镜 10 × 2 倍率）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4.导管心脏的灌注状态。 心房充分灌注，两个心耳在心脏（A）中充气，并在升主动脉处结扎和结扎。然而，两个心耳在心脏（B）中均被拔除，主动脉根部结扎并结扎，提示心房灌注不良。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5.钙再引入后的细胞形态和活力评估。 从心脏导管隔离并在升主动脉处结扎的AM（A）和VM（B）分别表示为AMAAs和VMAAs。从心脏导管和主动脉根部连接的AM（C）和VM（D）分别表示为AMARs和VMAR。高质量的CM是静止的，具有完整的膜，清晰的轮廓，清晰的横纹肌节和光滑的细胞表面。AM 是主轴形的，而 VM 是杆形或砖形的，末端是矩形的。自发收缩或在膜中含有泡状的CM质量较差，而那些收缩成球形的CM是死细胞。随机视场（荧光显微镜，10 ×10放大倍率;比例尺，100μm）。AM = 心房肌细胞，VM = 心室肌细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6.钙重新引入前后共聚焦显微镜下的细胞形态。 在钙重新引入之前，AMAA（A）和AMAR（C）是纺锤形的，具有清晰的轮廓，条纹肌节和光滑的膜表面。钙重新引入后，AMAA（B）和AMAR（D）也呈纺锤形，具有清晰的轮廓，条纹肌节和光滑的膜表面。在钙重新引入之前，VMAA（E）和VMAR（G）是杆状或砖状的，具有清晰的轮廓，条纹肌节和具有矩形末端的光滑膜表面。钙重新引入后，VMAA（F）和VMAR（H）也是杆形或砖形，具有清晰的轮廓，条纹肌节和光滑的膜表面，具有矩形末端（共聚焦显微镜油，63×10倍率;比例尺，50μm）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7.细胞活力评估。 失去活性的受损细胞被台盼染成蓝色。相反，活细胞不能用台盼蓝染色（荧光显微镜，4×10放大;比例尺，100μm）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 8. 条形图显示了钙重新引入前后的AMAA，AMAR，VMAA和VMAR的存活率。CR = 钙再引入。每个值代表来自10只小鼠的SD±平均值。p < 0.01。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 溶液 | 内容物（终浓度，单位：毫摩尔/升，如果未另行指定） | 著名的 |
| 灌注溶液（溶液1） | 113 NaCl， 4.7 KCl， 0.6 KH2PO4， 0.6 Na2HPO4， 1.2 MgSO4， 12 NaHCO3， 10 KHCO3， 10 HEPES， 15 牛磺酸， 5 葡萄糖， 10 2，3-丁二酮一肟（BDM） | 其可在4°C下储存3天。 葡萄糖，牛磺酸和BDM在实验当天添加。为每颗心脏准备200毫升灌注液。 |
| 泰罗德的解决方案（解决方案2） | 140 氯化钠， 4 千氯化， 1 毫克氯 2， 10 丁二醇， 1 氯化钙， 5 葡萄糖 | 其可在4°C下储存3天。 在实验当天加入CaCl2 和葡萄糖，用PH计在室温（28-30°C）下用饱和NaOH调节pH至7.3-7.4。 |
表 1.成人小鼠CM隔离解决方案。
| 溶液 | 内容 | 著名的 |
| 消解液（解体3） | 25 mL 溶液 1，6μL 100 mM/L CaCl2，25mg 胶原酶 II，50μL（2.5 % 10×）胰蛋白酶 | 适合每颗心 |
| 停止解决方案1（解决方案4） | 9 mL 溶液 1，1 mL FBS（胎牛血清），4μL 100 mM/L 氯化钙 | 适合每颗心 |
| 停止溶液2（溶液5） | 9.5 mL 溶液 1，0.5 mL FBS（胎牛血清），4μL 100 mM/L CaCl2 | 适合每颗心 |
| 细胞重悬液（溶液6） | 13 mL溶液1，7μL 1M / L CaCl2，BSA（公牛血清白蛋白），剂量可以形成覆盖液体表面的薄层 | 适合每颗心 |
表 2.成人鼠标CM隔离和存储解决方案。
图 9.钠通道的电流-电压曲线。采用全细胞膜片钳技术记录隔离心肌细胞在电压钳位模式下的钠电流。插页中显示了电压钳位协议。图中显示了从 AM （A） 和 VM （B） 记录的钠电流。在AM中，−45mV、−40mV和−35 mV电位下的电流密度分别明显高于-32.71±1.597 pA/pF、−31.49±1.820 pA/pF和−29.34±1.939 pA/pF;n = 10），分别高于VM（-17.66 pA/pF±1.976 pA/pF、−21.09±1.560 pA/pF和−21.86±1.381 pA/pF; P < 0.05）。（C）I-V曲线显示了归一化为电池电容的钠电流密度。请点击此处查看此图的放大版本。
图 10.心房血管的起源和分布。 面板A中的心房血管（箭头1）和CA（箭头2）是心房血管（箭头3）的仔细观察。（C） 存在两种不同大小的视点;一个（箭头4）对应于灌溉心房附件的心房血管，另一个（箭头5）对应于CA（立体显微镜10×5放大倍率）。CA = 冠状动脉。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 鼠标的序列号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| 主动脉插管的深度在升主动脉 | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| 主动脉插管的深度位于主动脉根部 | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
表 3.从套管尖端到冠状动脉窦的距离。 使用C57BL / 6小鼠（n = 20）的心脏分别在升主动脉和主动脉根的深处对主动脉进行插管和边缘。解剖主动脉，并测量从套管尖端到CA口的距离。距离以毫米为单位测量，正号或负号分别代表CA口上方和下方的套管尖端。
Discussion
单CM是心脏功能和疾病细胞水平研究中有价值且不可或缺的工具20。因此，将可行的CM与人心隔离是第一步，也是最关键的一步。细胞质量是进行成功实验的重要决定因素之一，特别是在光学和电生理实验中。与其他动物的CM相比，啮齿动物CM更容易出现缺血和缺氧，因为细胞内钠离子浓度较高，有利于钙通过Na + / Ca2 + 交换剂流入21。此外，AM的数量远远少于VM的数量。因此，成功隔离是极其困难的。Langendorff方法非常适合分离小鼠VMs22，但分离AM的成功率很低，并且很少有报告可用。主动脉插管的适当深度也是产生理想VM的重要因素，除了用于缓冲液制备的温度、酶活性、PH和水质。朗根多夫方法的原理依赖于心脏的逆行灌注。灌注后，主动脉瓣关闭;因此，灌注液被迫进入冠状动脉，通过血管分支输送酶溶液，并且心肌组织被均匀消化。为了达到这种循环模式，主动脉必须为插管和结扎保留足够的长度，插管尖端也不得穿透主动脉瓣或阻塞CA口。因此，可以合理推测主动脉插管的深度也与心房灌注有关，从而以类似的方式影响心房的消化功效和AM的产量。这里提出的方案证实了这一假设，优化细胞产量的关键步骤以及建议如下所述。
在步骤1.9中，为了更好地固定主动脉，建议使用带有凹口（或圆周凹槽）的20 G钝插管，距离尖端为1 mm。根据我们的经验，发现套管尺寸略大于主动脉直径，以防止套管尖端在插管过程中刺穿主动脉瓣，因为主动脉依靠其内在弹性，可以紧贴在套管中并产生摩擦，这在向前或向后移动调整插管深度时起到保护因素的作用。就缺口的位置而言，如果心脏太靠近插管尖端，由于重力，心脏在插管过程中很容易滑落。相反，如果距离太远，调整插管深度和结扎位置的空间将非常有限。鉴于这些情况，在步骤3.3中，在左颈总动脉之间横切主动脉（如图 2中的绿线）以确保主动脉足够长并且可以在升主动脉处进行插管和结扎更好。虽然在升主动脉处进行横断，但留有的插管长度至少可以将插管尖端固定在靠近主动脉根部的位置，并且在结扎后不会穿透主动脉瓣。主动脉的解剖结构和从套管尖端到CA窦的距离的测量表明，在左颈总动脉之间横切主动脉是达到适当的主动脉插管深度的理想位置。
发现插孔深度与心房的灌注有关，进而作为深度指示器。 图 4 显示，当深度位于升主动脉时，心房灌注良好，并且两个心耳都充气。然而，当深度位于（或接近）主动脉根部并且两个心耳都枯萎时，心房灌注不足。从膨胀的心耳产生的AM的总和可行计数更高（图8）。这些发现表明，主动脉插管深度可以以某种方式影响心房和心耳的灌注和消化，最终影响AM的产量和质量。AM的产量和质量被推断为与供应心房的血管的分布有关。Fernández等人的研究已经 证明了小鼠CA的起源和过程的各种异常。他们发现CA的眼孔是高度可变的，并不都位于主动脉窦。一些CA可能异常地起源于主动脉窦上方，称为高起飞口。一些 CA 可能起源于同一主动脉窦，心房血管的口就在附近。本研究中主动脉的解剖结构（图10）也与Fernández的发现一致。这可能是为什么如果套管深度不合适，则通过Langendorff方法隔离AM的尝试在很大程度上不成功的原因。因此，如果套管尖端和CA口之间没有足够的空间，插管尖端将有更大的机会阻塞与CA窦相邻的心房血管窦。相比之下，只要导管尖端不穿透主动脉瓣，心室的灌注和细胞产量就几乎不受影响。这可能是因为向心室供血的CA具有更大的骨质和更多的起源。如果一个肺口管阻塞，心室灌注可以通过另一个 CA 或侧支循环来补偿，而供应心房的血管相当小并且没有替代品。因此，主动脉插管深度的影响很重要。
消化和细胞储存过程中其他值得注意的因素和故障排除如下。首先，考虑在步骤4.1中灌注含氧的Tyrode溶液，以使肌肉收缩，如果主动脉结扎后心房中的血液尚未冲出，则泵出残留的血液。这可以帮助避免从受损红细胞释放的ca2 + 和其他物质的不良反应。其次，提前注入无ca2+溶液以解离连接并扩大细胞之间的空间可以提高酶消化的功效，因为CM之间的插层盘是钙依赖性的细胞间连接。但是，时间应限制在3-5分钟，以避免 钙悖论 现象24。建议使用混合酶溶液。II型胶原酶破坏细胞外基质网络，如果胶原酶II消化不完全，胰蛋白酶有助于清除残留在细胞表面的颗粒状物质。这确保了电池表面的光滑，这对于在膜片钳记录中形成GΩ密封至关重要。然而，胰蛋白酶浓度应控制在适当的范围内，以避免过度消化和细胞损伤，因为它会降解膜蛋白。单独使用II型胶原酶来提高细胞产量通常可能导致组织过度消化，并且在长时间胶原酶暴露后分离出的CM将不耐钙25。2，3-丁二酮一毒杆菌（BDM）的使用仍然存在争议26，27，28，29，这是一种通过抑制肌球蛋白ATP酶和防止交叉桥形成来防止自发收缩的物质。根据以前的经验，添加 BDM 对于此协议是必需的。酶溶液用溶液1制备，尽管溶液1不含钙，并且添加钙以激活酶。在灌注溶液中添加BDM的好处包括（1）抑制肌细胞收缩和减少酶溶液灌注过程中的氧气消耗，以及（2）防止肌细胞缺氧和提高分离的肌细胞的质量。一些研究报告说，BDM可能对细胞电性能产生潜在的不利影响。然而，全细胞膜片钳记录钠电流的结果并不表明不良影响。在细胞储存步骤（步骤6）中，许多研究选择了KB缓冲液，一种无钙但高钾浓度的溶液，其中细胞可以保持更好的状态，因为它们处于极化和低代谢条件下。然而，在没有外源钙的情况下，细胞膜的糖萼会从脂质双层中分离出一定时间，膜通透性会增加，影响后续的功能分析30，31，32。
目前，所有肌细胞分离技术基本上可以分为酶溶液中的 块 状（一小块组织）消化或酶溶液中的CA灌注（Langendorff灌注）22。与Langendorff方法相比， 块 消化方法更容易执行，并且也经常用于许多实验室的CM分离。然而，这种方法通常从成人组织中产生低质量的CM产量22。此外，通过这种方法分离的细胞可能不适合进行比较实验。例如，当测试AM和VM之间的细胞类型特异性药物效应时，不能忽视或排除不同分离条件的影响。这是因为心肌和心室的组织密度比心房更厚，密度更大，导致消化时间和酶浓度不同。此外，在消化过程中对组织进行过度搅拌和移液会损害细胞并显着影响功能研究。此外，许多先前的研究表明，AMs更容易受到钙的影响。然而，通过当前方案分离的AM可以耐受梯度钙的再引入，可能是因为组织在消化过程结束时容易破裂。因此，机械损伤较小，而细胞将遭受更多的机械损伤，因为块状方法的步骤需要反复破裂和离心。最近，Ackers等人报告了 一种简化的，不含Langendorff的方法，用于分离活的心脏肌细胞和非肌细胞。虚拟机和成纤维细胞可以有效地分离，但没有提到AM的数量。但是，此协议有几个限制。首先，心脏血管的分布可能因个体差异和小鼠应变而有所不同，并且推荐的插管深度不能保证每次都能成功分离AM。其次，对于那些刚接触该手术的人来说，可能需要一定的时间来练习主动脉横断和逆行主动脉插管。最后，除了在健康和老年小鼠中外，这种方法没有在其他心脏病模型中进行测试。因此，由于心脏的纤维化程度，它需要调整酶浓度和消化时间。在块状方法中遇到的不同消化条件的缺点在Langendorff方法中不会成为问题，其中酶溶液通过血管床均匀地分布到组织中。
综上所述，这里描述的同时分离单个AM和VM的方案已经证明，适当的主动脉插管深度可以有效提高心房灌注和AM产量。通过该方法分离的CM质量高，具有良好的钙耐受性，并已成功应用于团队中的膜片钳记录和钙处理（通过 IonOptix系统测量Ca2 +释放和Ca2 + 波测量）34。预计分离方案可用于一系列细胞和亚细胞研究中的细胞制备，这将有助于加深对心脏生理学和病理学的理解。重要的是，它将能够发现更具临床相关性的心脏病机制和干预方法。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（第81770322号、81870244号、81500254号、81870243号、81470465号）和北京市自然科学基金（第7192051号）资助。作者贡献：Bai和Liu设计并构思了这个项目。温家宝和阮为实验提供了宝贵的建议。吴和李琳玲进行了实验工作，并在数据采集、分析和解释中发挥了关键作用。李参加了朗根多夫装置的组装。彭、张、王、杨等在实验前参与了试剂和溶液的制备。吴写了这篇文章。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
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