Summary
פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.
Abstract
קרדיומיוציט יחיד הוא כלי חיוני במחקרים ברמה התאית והתת-תאית של ביולוגיה לבבית ומחלות כיחידה בסיסית של התכווצות ופעילות חשמלית. לפיכך, בידוד קרדיומיוציטים קיימא ואיכותיים מהלב הוא הצעד הניסיוני הראשוני והמכריע ביותר. השוואת הפרוטוקולים השונים לבידוד הקרדיומיוציטים של עכברים בוגרים, זלוף מדרדר לנגנדורף הוא השיטה המוצלחת ביותר לשחזור המדווחת בספרות, במיוחד לבידוד מיוציטים חדריים. עם זאת, בידוד מיוציטים פרוזדורים איכותיים מהלב המנוזל נותר מאתגר, ומעט דיווחי בידוד מוצלחים זמינים. פתרון בעיה מסובכת זו חשוב ביותר כי מלבד מחלת חדרית, מחלת פרזדורים מהווה חלק גדול של מחלות לב. לכן, חקירות נוספות ברמה התאית כדי לחשוף את המנגנונים מוצדקות. במאמר זה, פרוטוקול המבוסס על שיטת זלוף מדרדר Langendorff הוא הציג כמה שינויים בעומק של שימור אבי העורקים ואת הצעדים שעשויים להשפיע על תהליך העיכול כדי לבודד מיוציטים פרוזדורים חדריים נעשו בו זמנית. יתר על כן, קרדיומיוציטים מבודדים מאושרים להיות מקובל כדי תיקון מהדק חקירה.
Introduction
מחלת לב היא אחד הגורמים המובילים בעולם לתמותה1. כדי להתמודד עם נטל זה על מערכת הבריאות, נדרשת הבנה מעמיקה של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הלב. מלבד הכנה מלאה של בעלי חיים ולב שלם, הכנה תאית היא כלי חיוני נוסף לחקר תפקוד ומחלות2. על ידי יישום מהדק התיקון, הדמיית סידן, ביולוגיה מולקולרית וטכנולוגיות מתקדמות אחרות, החוקרים יכולים לקבל מידע נוסף על התכונות האלקטרופיזיולוגיות, הומאוסטזיס סידן, מסלולי איתות, מצבים מטבוליים, ותעתיק גנים בקרדיומיוציטים יחיד (CM). זה עוזר מאוד לחשוף את המנגנונים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של תהליך מחלות הלב3,4,5,6,7. לחקר בעלי חיים, ניתן להשתמש במינים קטנים (למשל, עכברים, חולדות ושפני ניסיונות) ועד בעלי חיים גדולים (למשל ארנבים וכלבים). בעלי חיים קטנים מועדפים בדרך כלל, במיוחד עכברים, משום שהם מקובלים על מניפולציה גנטית ומודל מחלות8,9,10.
טכניקות של CMs מבודדים בחריפות עברו תקופת פיתוח ארוכה ועדיין מתפתחות11. זלוף מדרדר לנגנדורף הוא שיטת הבידוד המצליחה ביותר שניתן לשחזר בה המיושמת בחולדות ועכברים, במיוחד לבידוד מיוציטים חדריים (VMs)12,13,14,15. עם זאת, דיווחים על מיוציטים מפרזדורים מבודדים בהצלחה (AMs) הם נדירים16,17,18. חקירות נוספות בשתי הרמות של האיברים/מערכת כולה והתת-תאיים כדי לחשוף את המנגנונים ולחקור גישות טיפוליות חדשות מוצדקות מכיוון שפרפור פרוזדורים (AF), הסוג הנפוץ ביותר של הפרעות קצב, הופך יותר ויותר נפוץ ברחבי העולם, ומודלים הטיפול הנוכחיים הן בטיפולים פרמקולוגיים והן בבלציה לבבית נשארים לא יעילים בכ -40%-50% מחולי AF19 . בידוד מוצלח של עכבר למבוגרים הוא הצעד הראשון למחקר סלולרי. ניתן להשתמש בשתי שיטות בידוד עיקריות: הנתח ושיטות לנגנדורף. בשיטת זלוף לנגנדורף, עיכול רקמות תלוי בתמיסת האנזים המועברת על ידי העורקים הכליליים וענפיהם למיטות נימיות. עומק שימורי אבי העורקים הנכון שיכול להימנע מחדירה של שסתומי אבי העורקים וחסימת אוסטיה העורק הכלילי הוא תנאי מוקדם להשגת דפוס זלוף כזה, שהוא גם הצעד החיוני לעיכול יעיל ותפוקת VM אידיאלית. לפיכך, סביר להניח כי עומק שימורי העורקים עשוי להשפיע באופן דומה על זלוף כלי האטיה ולבסוף להשפיע על התשואה AM. כדי לבדוק השערה זו, שבוצעה קנוניציה של העורקים בעומקים שונים והשוו את תשואות AM המתאימות. הנתונים הראו כי עומק שימורי העורקים רלוונטי ישירות לתפוקת AM. להלן, פרוטוקול לבידוד AMs ו- VMs מוצג בו זמנית.
Protocol
עכברים בוגרים C57BL/6 במשקל 20-30 גרם, 8-10 שבועות של גיל נרכשו ממרכז החיות של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג'ינג, סין. כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הרפואית קפיטל ובוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שהוצע על ידי המכון למשאבי בעלי חיים ופורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות. Excel ו- Origin 8.5 שימשו לרכישת נתונים וניתוח נתונים. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SD, להערכה סטטיסטית, נעשה שימוש במבחן t של סטודנט ו- P < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
1. הכנת מנגנון פתרון וחדירה
- להרכיב מנגנון Langendorff זרימה מתמדת (זמין מסחרית או מתוצרת עצמית). איור 1 מספק סכמטי פשוט.
- הכן את הפתרונות בהתאם לריגנטים שניתנו בטבלה 1 ובטבלה 2.
- הפעל את אמבט המים במחזור ולהתאים טמפרטורת קלט מתאימה (42 °C (42 °C (7 °F במעבדה שלנו) כדי להבטיח כי זרימת מערכת זרימת הזילוף מן הצינורית מגיע 37 °C (50 °F).
- נקה את מערכת זלוף על ידי מחזור מים deionized. אם יש צורך במצב סטרילי, להפעיל 75% אתנול דרך מערכת זלוף במשך 15 דקות, ואחריו מים deionized (לפחות 10 מחזורים כדי למנוע השפעות רעילות אלכוהול על הלב).
- למדוד את הזמן והנפח עבור מחזור אחד של מערכת זרימת זלוף כדי לקבוע כמה מיליליטרים של הפתרון של טיירוד מחומצן להיות טעון בשלב זלוף הבא.
- לחטא את כל הכלים הכירורגיים בשיטה הרצויה.
- הגדר את קצב הזרימה של מערכת זלוף זלוף ב 4 מ"ל / דקה.
- הכן שתי מנות פטרי נקיות 35 מ"מ - אחת המכילה את הפתרון של טיירודה (צלחת פטרי 1), השנייה המכילה פתרון 1 (צלחת פטרי 2).
- הכן מזרק 1 מ"ל מלא פתרון 1 ומחט צינורית פלדה קהה 20 גרם עם חריץ מהמקום שבו המרחק הוא 1 מ"מ לקצה. הכן קשר רופף עם תפירה 3-0 לפיר הצינורית. לווסת את שדה הצפייה של סטריאומיקוסקופ ולוודא כי קצה הצינורית הוא מתחת לפני השטח הנוזלי של צלחת פטרי 2.
2. הכנת בעלי חיים
- ניהול הפרין (ריכוז, 1,000 IU/mL; 0.2 מ"ל/עכבר) תוך-פריטון לעכברים כדי למנוע קרישי דם. לאחר 10 דקות, למרדים את העכברים עם נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג, הזרקת I.P. ) ולהבטיח כי העכברים להפסיק להגיב זנב / בוהן קמטים. בצע נקע צוואר הרחם 20 דקות לאחר מתן הפרין.
- מעבירים את העכברים לפלטפורמה הכירורגית, מתקנים את העכברים בתנוחת עלון, מחטאים את החזה עם 75% אתנול ומייבשים אותו בגאזה או מפית.
3. כריתת לב ו cannulation aorta
- הרם את העור של xiphoid עם מלקחיים רקמה ולעשות חתכים לרוחב קל דרך העור עם מספריים רקמה. בצע ניתוח בוטה בין העור לבין fascia ולהרחיב את החתירה של העור בצורת V לכיוון האקסילה משני הצדדים.
- המשך את אותו עקבות חתיכה דרך כלוב הצלעות, ולאחר מכן, להסיט את כלוב הצלעות כלפי מעלה על ידי הידוק החזה עם מלקחיים רקמה לחשוף באופן מלא את הלב והריאות.
- לקלף את קרום הלב באמצעות מלקחיים מעוקלים. לקרוע את בלוטת התימוס לכיוון שני הצדדים על ידי שני מלקחיים מעוקלים אם זה מכסה את הכלים הגדולים. משוך בעדינות את בסיס הלב לכיוון הזנב עם מלקחיים מעוקלים עד שניתן לראות כלי דם בצורת "Y" (העורקים והעורקים הענפיים שלו).
- כדי להזמין אורכים שונים של הארי העורקים לחיתוך והשוואה, חצו את העורקים בעורק העורק הראשי המשותף השמאלי (קו ירוק באיור 2) וחתכו את העורק הברכיויצפלי בו-זמנית בעכברים מסוימים. נצלו את העורקים העולה בעכברים אחרים (קו שחור באיור 2).
הערה: עבור אלה חדשים בהליך זה, שלב זה יכול להיעשות גם תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. - Excise את הלב, ומיד לטבול בצלחת פטרי 1 לשטוף ולשאוב את הדם שיורית.
- מעבירים את הלב לצלחת פטרי 2, ומקצצים כל רקמה עודפת באמצעות מספריים קשתית עדינה במידת הצורך. עבור אלה חדשים בהליך זה, לעשות את הצעד הזה תחת סטריאומיקוסקופ כדי למנוע חיתוך שגוי של אב העורקים או מבני לב אחרים.
- לדחוף את המזרק כדי לגרש בועות אוויר לפני cannulation aorta. בצעו שינון שרירי העורקים מדרדר בסיוע שני מלקחיים ישרים (לסתות חלקות) מתחת לסטריאומיקרוסקופ. ודא כי כל תהליך cannulation הוא מתחת לפני השטח הנוזלי.
- הימנעו מחדירה של שסתומי אבי העורקים והתאמו את המעמקים לאף העורקים העולה (העכבר שחלוק העורקים נפרץ בעורק העורק הראשי המשותף השמאלי) ולשורש אבי העורקים (העכבר שבוט העורקים חוצה בבוטה העורקים העולה), בהתאמה.
הערה: עומק צינורית העורקים (המכונה פשוט עומק) מוגדר כאן כמיקום שבו קצה הצינורית נמצא בבטווה או היכן שאור העורקים נקשר. - ליגת את העורקים עם תבל 3-0 לפני הקשר למעמד הקנולה. יש ללחוץ בעדינות על תכולת המזרק כדי לשטוף את שאריות הדם.
הערה: הדם ישאיר את העורקים הכליליים ויתלהב מהורידים העורפיים אם העומק ממוקם כראוי. הלב ונספחי האיתרים יתרחבו ויהפכו חיוורים. - הסר וחבר את הצינורית למנגנדורף. שוב, יש להקפיד להימנע מבועות אוויר הנכנסות ללב.
הערה: שים לב כי הזמן מ ניקור חזה זלוף ראשוני לא יעלה על 5 דקות.
4. זלוף לב
- ראשית, תמיסה מחומצנת של טיירוד טאג'ורי ראשוני וחדירה במשך כ-10 s (נפח הנוזל הפועל 10 s במערכת המשמשת בפרוטוקול זה הוא כ-0.7 מ"ל) אם יש שאריות דם באטריה, ולאחר מכן עבור לפתרון 1. עם זאת, רק לטבול עם פתרון 1 אם אין שאריות דם אטריה. לטפס את הלב במשך כ 2 דקות.
- עבור לפתרון 3. למצוץ כ 2.5 מ"ל של פתרון 3 עם צינור פוליאתילן סטרילי חד פעמי ו prewarm אותו באמבט המים לשימוש מאוחר יותר, עם השארית משמש זלוף במשך כ 11-12 דקות. יש להשליך את הפתרון 3 ב-2 הדקות הראשונות. למחזר את השאר למאגרים perfusate על ידי המשאבה peristaltic לשימוש חוזר עד העיכול הושלם.
- לסיים את העיכול כאשר הלב הופך נפוח והופך מעט חיוור ורפוי (מרקם ספוגי) או חותם קיים אם שריר הלב הוא צבט בעדינות באמצעות מלקחיים שיניים.
5. בידוד תאים והחזרת סידן
- מוציאים את החדרים ואת האטריה עם מלקחיים, ומניחים אותם בצלחות פטרי שונות. מוסיפים את הפתרון המואר מראש 3 למנות הפטרי.
- להפוך את הרקמה למרקם עגום עם מלקחיים קהים בעדינות pipette את הרקמה לעיכול אפילו. הימנעו מהכנסת בועות אוויר.
- מעבירים את הרקמה המעוכלת עם הפיפטה לפתרון 4 כדי לעצור את פעילות האנזים הנותרת, ולאחר מכן צנטריפוגה ל-20 גרם ב× גרם 192. הסר את supernatant ולהוסיף פתרון 5 לתוך משקעים התא pipette כדי לפזר באופן שווה את התאים.
- להחזיר את הסידן באופן צעד על מנת למנוע פרדוקס סידן ועומס יתר של סידן. הוסף בהדרגה בסך הכל 50 μL 100 mM / L CaCl2 (בכל מרווח של 5 דקות של 5 μL, 10 μL, 15 μL, ו 20 μL, בהתאמה) ההשעיה של התא.
6. אחסון תאים
- למחקר מהדק התיקון, לאחסן את התאים בתמיסה של טיירוד. עבור מחקרים תאיים אחרים, לאחסן את התאים בפתרון 6.
- כדי להבטיח את הדיוק של מחקרים פונקציונליים חריפים' (למשל, Ca2+ ניצוצות, גלי Ca2+ , שחרור Ca2+ , Ca2+ דליפת, והקלטות מהדק תיקון), לסיים סוגים אלה של ניסויים פונקציונליים בתוך 6 שעות הבאות.
Representative Results
נייר זה, שבו קצה הצינורית ממוקם בתחום העורקים, המוגדר כעומק צינור העורקים (המכונה פשוט עומק), מייצג גם את המקום שבו העורקים הוא קשירה. AM ו- VM מבודדים מלב שהיה cannulated ונקשר ב aorta עולה מיוצגים כמו AMAA ו- VMAA, בהתאמה. יתר על כן, AM ו- VM מבודדים מלב שהיה מנור וקשירה בשורש בים העורקים מיוצגים כ- AMAR ו- VMAR, בהתאמה. איור 2 מציג את הסקירה של מיקום העורקים והתמרור. בנוסף, איור 3 מציג את המעמקים ואת מקומות החיבור המתאימים לתנוחות התמתן של בוני העורקים. העומק היה קשור לזלוף של אטריה ופרוזציות. שני נספחי האיתור מנופחים כאשר קצה הצינורית נמצא באפותרה העולה, מה שמצביע על זלוף אטריה מספיק. עם זאת, כאשר בשורש האב העורקים, זלוף אטריה אינו מספיק ושני נספחי פרוזדורים נבזבזים (איור 4). המורפולוגיה והקיימות של CM המבודדים מהלבבות המבודדים בעומקים שונים לאחר החזרת הסידן (איור 5). מורפולוגיות תאים של AMAA, AMAR, VMAA ו- VMAR נמצאות תחת המיקרוסקופ הקונדוקלי לפני ואחרי החזרת הסידן. AMs הם בצורת ציר, ואילו VMs הם בצורת מוט עם קצוות מלבניים. יתר על כן, ל-AMs ול-VMs יש ממברנות שלמות, קווי המתאר הצלולים, הסרקומירים המפוספסים הצלולים והשטח החלק (איור 6). הכדאיות של התא הוערכת באמצעות כתמים כחולים טריפן. תאים רגילים עם ממברנות שלמות יכולים לא לכלול כחול טריפן ולא יהיו מוכתמים, בעוד שפעילות אובדן התאים תצטבר במהירות תאית בכחול טריפן (איור 7). AMs ו- VMs הוצבו בשקופיות אובייקטים שונות כדי לבצע ספירת תאים. התשואות הכוללות של AM ואחוז ה- CMs בצורת ציר קיימא (שיעור הישרדות) נקבעו על-ידי העברת 10 מיקרו-אל של השעיית התא לשקופית אובייקט ונספרו תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה ב- 4 × 10 שדות תצוגה. אותה שיטה שימשה לקביעת התשואות הכוללות של סוגי (בצורת מוט) ואת אחוז סוגי קיימא. שיטה זו עדיפה על פני שימוש בהמוציטומטר, מכיוון שהסמנכ"לים לא התפזרו בקלות לאזור הספירה של המוציטומטר בגלל גודלם וצורה. גרף עמודות (איור 8) מציג את שיעורי ההישרדות של AMAA, AMAR, VMAA ו-VMAR לפני ואחרי החזרת הסידן. כל ערך מייצג את ה- SD ± הממוצע מ- 10 עכברים. לפני החזרת הסידן, שיעורי ההישרדות של AMAA גבוהים משמעותית מאלה של AMAR (70.9% ± 2.8% ו-41.0% ± 5.2%, בהתאמה; עמ ' < 0.01). לאחר החזרת הסידן, שיעורי ההישרדות של AMAA גבוהים משמעותית מאלה של AMAR (69.4% ± 3.0% ו-37.7% ± 4.9%, בהתאמה; עמ' < 0.01).
שיעורי ההישרדות של VMAA לא היו שונים מאלה של VMAR (89.5% ± 2.7% לעומת 88.1% ± 2.6%, בהתאמה; p > 0.05) לפני החזרת הסידן. באופן דומה, שיעורי ההישרדות של VMAA לא היו שונים מאלה של VMAR (82.2% ± 1.9% לעומת 82.9% ± 1.6%, בהתאמה; p > 0.05) לאחר החזרת הסידן.
לב יכול להיות בעומק כפי שפרוטוקול זה המליץ (באצולה העולה), תפוקת VMs ו- AMs בת קיימא של כ -4.1 מיליון וכ -180,000, בהתאמה, לאחר החזרת סידן. הקלטת המהדק של התא כולו של זרם הנתרן (איור 9A, B) והצפיפות הנוכחית (איור 9C) ב-AM וב-VM המבודדות מאשרות שאיכות התא עמדה בדרישות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים. האנטומיה של האב העורקים (איור 10) מראה כי האוסטניום של כלי האיתור נמצא ליד שורש האב העורקים וצמוד לאוסטיום של העורק הכלילי (CA). טבלה 3 מציגה את המרחק מקצה הצינורית לאוסטיום CA של לבבות משופעים וקשירה בבטווה המרקיע ובשורשת העורקים, בהתאמה.
איור 1. דיאגרמה סכמטית של מערכת לנגנדורף שהשתנתה. מערכת זו חסכונית וניידת עבור המשתמשים. יש לו שני חלקים של צינורות פלסטיק - אחד עבור המים (קוטר פנימי, 8 מ"מ) ואחד עבור perfusate (קוטר פנימי, 1.5 מ"מ) - אשר הקצה הדיסטלי מחובר stopcock משולש רפואי PE עם מנעול Luer. בקבוק זכוכית המכיל מים ועם פקק גומי בצורת מחליף חום. החלפולת נשאבת לתוך צינורות הפלסטיק במחליף החום על ידי המשאבה הפריסטלטית ויוצאת מהסטופקוק המשולש המחובר לצינורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. בצטי העורקים והרקמות מסביב. מבנה כלי דם בצורת "Y" הוא מבנה מבנה העורקים וענפיו: העורק ה ברכיוסקופאלי (חץ 1) וה בעורק הראשי המשותף השמאלי (חץ 2). חתוך את שריר העורקים בין עורק העורק הראשי המשותף השמאלי (קו ירוק) ובו זמנית לחתוך את העורק brachiocephalic בכמה עכברים; ניתח בבטוח העולה (קו שחור) בעכברים אחרים (סטריומיקרוסקופ 10 × 2 הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. מבט חזיתי על הלב המנוקד. הקו המעוקל השחור מייצג את הקצה הנותן של בינוי שהיה חוצה בין העורק הראשי המשותף השמאלי. הקו המעוקל האדום מייצג את הקצה הסינג של העורקים החצה באצלת העורקים העולה. הקו הישר מייצג את המקום שבו קשירתו את העורקים: שחור בבטווה המרקיע ואדום בשורש העורקים (סטריאומיקוסקופ 10 × 2 הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. מצב זלוף של הלבבות המנוצלים. האטריה מנופחת במידה מספקת, ושני נספחי האיתור מנופחים בלב (א) מקונפים ונקשרים בבטווה העולה. עם זאת, שני נספחי פרוזדורים הם wizened בלב (B) cannulated ונקשר בשורש באטי העורקים, המציין זלוף אטריה עני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. מורפולוגיה של תאים והערכת כדאיות לאחר החזרת הסידן. AMs (A) ו- VMs (B) מבודדים מהלב המנוקד וקשירה באצ"ה העולה מיוצגים כ- AMAAs ו- VMAAs, בהתאמה. AMs (C) ו- VMs (D) מבודדים מהלב המבודדים וקשירה בשורש בוני העורקים מיוצגים כ- AMARs ו- VMARs, בהתאמה. CMs באיכות גבוהה הם ססגוניים ויש להם ממברנות שלמות, קווי המתאר הברורים, sarcomeres מפוספס ברור, ומשטח תא חלק. AMs הם בצורת ציר, ואילו VMs הם מוט או בצורת לבנים עם קצוות מלבניים. CMs כי באופן ספונטני להתכווץ או מכילים blebs בממברנה הם באיכות ירודה, ואלה מתכווצים לצורה כדורית הם תאים מתים. שדה ראייה אקראי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, 10 × 10 הגדלה; מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר). AM = מיוצייט של פרזדורים, VM = מיוצייט חדרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. מורפולוגיה של תאים תחת מיקרוסקופ קונפוקל לפני ואחרי החזרת הסידן. לפני החזרת הסידן, AMAA (A) ו- AMAR (C) הם בצורת ציר עם קווי המתאר הברורים, הסרקומורים המפוספסים ומשטחי הממברנה החלקים. לאחר החזרת הסידן, AMAA (B) ו- AMAR (D) הם גם בצורת ציר עם קווי המתאר הברורים, הסרקומורים המפוספסים ומשטחי הממברנה החלקים. לפני חידוש הסידן, VMAA (E) ו- VMAR (G) הם בצורת מוט או לבנים עם קווי המתאר הברורים, סרקומורים פסים ומשטחי ממברנה חלקים עם קצוות מלבניים. לאחר החזרת הסידן, VMAA (F) ו- VMAR (H) הם גם בצורת מוט או לבנים עם קווי המתאר הברורים, הסרקומורים המפוספסים ומשטחי הממברנה החלקים עם קצוות מלבניים (שמן מיקרוסקופ קונפוקלי, 63 × 10 הגדלה; מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. הערכת כדאיות התא. תאים פגומים שמאבדים פעילות מוכתמים בכחול טריפן. לעומת זאת, תאים בני קיימא לא יכולים להיות מוכתמים בכחול טריפן (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, 4 × 10 הגדלה; מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8. גרף עמודות המציג את שיעורי ההישרדות של AMAA, AMAR, VMAA ו- VMAR לפני ואחרי החזרת הסידן. CR = החזרת סידן. כל ערך מייצג את ה- SD ± הממוצע מ- 10 עכברים. p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| תמיסה | תוכן (ריכוז סופי ב mmol/L, אם לא צוין אחרת) | ציין |
| פתרון זלוף (פתרון 1) | 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 טאורין, 5 גלוקוז, 10 מונוקסימה 2,3-בוטנדיון (BDM) | אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 °C (5 °F). גלוקוז, טאורין ו- BDM מתווספים ביום הניסוי. הכן 200 מ"ל של פתרון זלוף לכל לב. |
| הפתרון של טיירוד (פתרון 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 גלוקוז | אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 °C (5 °F). CaCl2 וגלוקוז מתווספים ביום הניסוי, להתאים את ה- pH ל 7.3-7.4 עם NaOH רווי בטמפרטורת החדר (28-30 מעלות צלזיוס) עם מד PH. |
טבלה 1. פתרונות לבידוד CM של עכבר בוגר.
| תמיסה | תוכן | ציין |
| פתרון עיכול(פתרון 3) | פתרון 25 מ"ל 1, 6μL 100 mM / L CaCl2, 25 מ"ג קולגנאז II, 50μL (2.5 % 10×) טריפסין | לכל לב |
| עצור פתרון 1(פתרון 4) | פתרון 9 מ"ל 1, 1 מ"ל FBS (סרום בקר עוברי), 4μL 100 mM / L CaCl2 | לכל לב |
| עצור פתרון 2(פתרון 5) | פתרון 9.5 מ"ל 1, 0.5 מ"ל FBS (סרום בקר עוברי), 4μL 100 mM / L CaCl2 | לכל לב |
| פתרון התחדשות תאים(פתרון 6) | פתרון 13 מ"ל 1, 7μL 1M / L CaCl2, BSA (אלבומין סרום שור) במינון שיכול ליצור שכבה דקה המכסה את פני השטח של הנוזל | לכל לב |
טבלה 2. פתרונות לבידוד ואחסון CM של עכבר בוגר.
איור 9. עקומות מתח זרם של תעלות הנתרן. טכניקות מהדק תיקון תא שלם שימשו לתיעוד זרמי נתרן של cardiomyocytes מבודד במצב מהדק מתח. פרוטוקול מהדק המתח מוצג ב- inset. זרמי נתרן שנרשמו מ- AM (A) ו- VM (B) מוצגים. הצפיפות הנוכחית בפוטנציאל של −45mV, −40mV ו- −35 mV גבוהה משמעותית ב- AM (−32.71 ± 1.597 pA / pF, −31.49 ± 1.820 pA / pF, ו - − 29.34 ± 1.939 pA / pF, בהתאמה; n = 10) מאשר ב- VM (−17.66 pA /pF ± 1.976 pA/pF, −21.09 ± 1.560 pA/pF, ו- −21.86 ± 1.381 pA/pF, בהתאמה; n = 8; P < 0.05). (C) עקומות ה- I-V מראות את דחיסות זרם הנתרן שנרמלו לקיכויות התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10. מקור והפצה של כלי האיתורה. כלי האיתרסיון (חץ 1) ו- CA (חץ 2) בלוח A. Panel B הוא מבט מקרוב על כלי האיתרסים (חץ 3). (ג) קיימות שתי אוסטיה בגודל שונה; אחד (חץ 4) מתאים לספינת האיתרסונים שהשקיה את נספחי האיתרוזים, והשני (חץ 5) מתאים ל- CA (סטריאומיקוסקופ 10 × 5 הגדלה). CA = עורק כלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| המספר הסידורי של העכברים | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| עומק שימורי העורקים נמצא באנטנת העורקים העולה | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| עומק קנוניציה של העורקים הוא בשורש בים העורקים | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
טבלה 3. מרחק מקצה הצינורית לאוסטיום העורק הכלילי. ליבם של עכברי C57BL/6 (n = 20) שימשו לתמצית ולגביית של העורקים במעמקי העורקים העולה והשורש של בוני העורקים, בהתאמה. העורקים הוא אנטומי, והמרחק מקצה הצינורית לאוסטיום CA נמדד. המרחק נמדד במילימטרים, וסימנים חיוביים או שליליים מייצגים את קצה הצינורית מעל ומתחת לאוסטיום CA, בהתאמה.
Discussion
CM יחיד הוא כלי בעל ערך וחיוני במחקרי רמת התאים של תפקוד הלב ומחלות20. לפיכך, הבידוד של CMs קיימא מהלבבות הוא הצעד הראשוני והמכריע ביותר. איכות התא היא אחד הגורמים המשמעותיים לעריכת ניסויים מוצלחים, במיוחד בניסויים אופטיים ואלקטרופיזיולוגיים. בהשוואה ל- CMs של בעלי חיים אחרים, CMs מכרסמים פגיעים יותר לאיסכמיה והיפוקסיה בגלל ריכוז גבוה יותר של יוני נתרן תאיים, אשר מעדיף זרם סידן באמצעות Na +/Ca2+ מחליף21. יתר על כן, מספר AMs הוא הרבה פחות מזה של VMs; לכן, בידוד מוצלח קשה מאוד להשגה. שיטת לנגנדורף מצוינת לבידוד עכברים VMs22, אך שיעור ההצלחה בבידוד AMs נמוך, ודיווחים מעטים זמינים. העומק הנכון של שימורי העורקים הוא גם גורם חיוני בהניב סוגי אידיאליים מלבד טמפרטורה, פעילות אנזימים, PH ואיכות מים המשמשים להכנת חיץ. העיקרון של שיטת לנגנדורף מסתמך על זלוף מדרדר של הלב. עם זלוף, שסתום אבי העורקים סגור; ובכך, זלוף נאלץ לתוך העורקים הכליליים, מתן פתרון אנזימים דרך ענפי הכלי, ואת רקמת שריר הלב מתעכל באופן שווה. כדי להשיג סוג זה של דפוס מחזור, אבי העורקים חייב לשמור מספיק אורך עבור cannulation ו קשירה, גם קצה הקנולה לא חייב לחדור את שסתומי אבי העורקים או לחסום את ostium CA. לכן, סביר לשער כי עומק cannulation אב העורקים קשור גם עם זלוף אטריה, אשר משפיע על יעילות העיכול של atria ואת התשואות של AM באופן דומה. הפרוטוקול המוצג כאן אישר את ההשערה, וצעדים חיוניים למיטוב תפוקת התא יחד עם ההצעות נרשמים להלן.
בשלב 1.9, כדי לאבטח טוב יותר את ביש"ט, צינורית קהה 20 G עם חריץ (או חריץ היקפי) מהמקום שבו המרחק הוא 1 מ"מ לקצה מומלץ. בהתבסס על החוויות שלנו, גודל הצינורית כי הוא קצת יותר גדול מאשר הקוטר של אבי העורקים נמצא כדי למנוע את קצה הצינורית מלנקב את שסתומי אבי העורקים במהלך cannulation כי אבי העורקים, המסתמך על האלסטיות המהותית שלה, יכול להתאים באופן נוח לתוך הצינורית ולייצר חיכוך, אשר משמש כגורם מגן בעת נע קדימה או אחורה התאמת עומק הצינור. במונחים של המיקום של החרץ, הלב יחליק בקלות במהלך cannulation בגלל כוח המשיכה אם הוא קרוב מדי קצה הצינורית. לעומת זאת, המרחב להתאמת עומק הקנולציה ותנוחת הקשירה יהיה מוגבל מאוד אם רחוק מדי. בהתחשב בנסיבות אלה, חלוקת צינור העורקים בין עורק העורק הראשי המשותף השמאלי (כקו הירוק באיור 2) כדי להבטיח שאור העורקים ארוך מספיק וניתן יהיה לקשירה ולקשירה בבוטה העורקים העולה עדיף בשלב 3.3. בעוד טרנסג'נקט ב אבי העורקים העולה, האורך השמור לצמחייה לפחות יכול לאבטח את קצה הצינורית קרוב לשורש אבי העורקים ולא יחדור את שסתומי אבי העורקים לאחר קשירה. האנטומיה של aorta ואת מדידת המרחק מקצה הצינורית לאוסטיום CA מצביעים על כך שחלוקת צינור העורקים בין עורק העורק הראשי המשותף השמאלי היא מיקום אידיאלי להשגת עומק צינוריות נאות.
עומק הקנוניציה נמצא קשור לחדירה של האטריה, אשר בתורו משמש אינדיקטור עומק. איור 4 מראה שחדירת אטריה טובה כאשר העומק נמצא באפהעורקים העולה, ושני נספחי האיתור מנופחים. עם זאת, זלוף אטריה אינו מספיק כאשר העומק הוא (או מתקרב) השורש בים העורקים ושני נספחי פרוזדורים הם wizened. הספירה הכוללת והקיימה של AM שהונפקו מנספחי האיתור המנופחים הייתה גבוהה יותר (איור 8). ממצאים אלה מצביעים על כך שעומק שימורי העורקים יכול להשפיע על זלוף ועיכול של אטריה ונספחי פרוזדורים בצורה מסוימת ולבסוף להשפיע על התשואה והאיכות של AM. התשואה והאיכות של AM היו להסיק להיות קשור עם הפצת כלי המספקים את atria. המחקר של פרננדז ואח '23 הראה אנומליות שונות במקור ומהלך של עכבר CA. הם מצאו כי אוסטיה CAs היו משתנים מאוד ולא היו כולם ממוקמים בסינוס בים העורקים. חלק מה-CAs עשויים לנבוע באופן חריג מעל הסינוסים של בים העורקים, הנקראים אוסטיום ההמראה הגבוה. חלק מה-CAs עשויים לנבוע מאותו סינוס בים העורקים, והאוסטיום של כלי האטריום נמצא ממש בקרבת מקום. האנטומיה של אבי העורקים במחקר הנוכחי (איור 10) עולה בקנה אחד גם עם מציאתו של פרננדז. זו עשויה להיות הסיבה מדוע ניסיונות לבודד AM על ידי שיטת Langendorff לא הצליחו במידה רבה אם עומק cannulation אינו מתאים. לכן, קצה הצינורית יהיה סיכוי גדול יותר של חסימת אוסטיום כלי אטריום כי הוא סמוך אוסטיום CA אם אין מספיק מקום זמין בין קצה הצינורית אוסטיום CA. לעומת זאת, זלוף ותפוקת התא של החדר בקושי הושפעו כל עוד שסתומי אבי העורקים לא חדרו על ידי קצה הצינורית. הסיבה לכך היא כנראה כי CAs המספקים דם לחדר יש אוסטיה גדולה יותר ומקורות נוספים. אם אוסטיום אחד נחסם על ידי הצינורית, זלוף חדרים יכול להיות פיצוי על ידי CA אחר או מחזור המשנה, ואילו כלי הדם המספק את האטריום הוא קטן למדי ואין לו תחליף. לכן, ההשפעה של העומק ב cannulation aorta חשוב.
גורמים ראויים לציון אחרים וירי צרות בתהליך העיכול ואחסון התא מפורטים כדלקמן. ראשית, שקול לזילוף הפתרון של טיירוד מחומצן בשלב 4.1 כדי להפוך את השריר להתכווץ ולשאוב את הדם שיורית אם הדם באטריה לא הובהל החוצה לאחר קשירת כאבי העורקים. זה יכול לעזור למנוע את ההשפעה השלילית של ca2+ וחומרים אחרים ששוחררו אריתרוציטים פגום. שנית, זלוף תמיסה ca2 + חינם מראש כדי לנתק את החיבור ולהרחיב את המרחב בין תאים יכול לשפר את היעילות של עיכול אנזימים כי דיסקים intercalated בין CMs הם צמתים בין תאיים תלויי סידן. עם זאת, יש להגביל את הזמן ל 3-5 דקות כדי למנוע את תופעת פרדוקס סידן24. מומלץ תפתרון אנזימים מעורב. קולגנאז סוג II משבש את רשת המטריצה החוץ-תאית, ותפסין מסייע לנקות את החומר הגרגרי שנותר על פני התא אם העיכול של קולגנאז II אינו שלם. זה מבטיח משטח תא חלק, שהוא קריטי ליצירת חותם GΩ בהקלטת מהדק התיקון. עם זאת, ריכוז טריפסין צריך להיות נשלט בטווח הנכון כדי למנוע עיכול יתר ופגיעה בתא כי זה יכול לבזות את חלבון הממברנה. שימוש בקולגנאז מסוג II בלבד כדי לשפר את תפוקת התאים עלול להוביל לעתים קרובות לרקמות על פני העיכול, וה- CMs המבודדים יהיו עמידים לסידן לאחר חשיפה ממושכת לקולגן25. השימוש במונוקסימה 2,3-butanedione (BDM), חומר המונע התכווצות ספונטנית על ידי עיכוב ATPase המיוסין ומניעת היווצרות גשר חוצה, עדיין שנוי במחלוקת26,27,28,29. על פי ניסיון קודם, הוספת BDM נחוצה לפרוטוקול זה. תמיסה אנזימים מוכנה עם פתרון 1 למרות תמיסה 1 אינו מכיל סידן, סידן מתווסף כדי להפעיל את האנזים. היתרון של הוספת BDM בתמיסת זלוף כולל (1) עיכוב התכווצות מיוציטים והפחתת צריכת חמצן במהלך זלוף פתרון אנזימים ו -(2) מניעת מיוציטים מהיפוקסיה ושיפור איכות המיוציטים המבודדים. מספר מחקרים דיווחו כי BDM עשויה להיות השפעה שלילית פוטנציאלית על תכונות חשמליות הסלולר. עם זאת, התוצאות של הקלטת מהדק תיקון התא כולו של זרם הנתרן לא הצביעו על השפעה בלתי רצויה. בשלב אחסון התאים (שלב 6), מחקרים רבים בחרו את מאגר KB, פתרון ללא סידן אך ריכוז אשלגן גבוה, שבו תאים יכולים לשמור על מצב טוב יותר מכיוון שהם נמצאים במצבים מקוטבים ומטבוליים נמוכים. עם זאת, הגליקוקליקס של קרום התא ייפרד מביל השומנים בהיעדר סידן אקסוגני לפרק זמן מסוים וחדירות הממברנה תגדל, ותשפיע על הניתוח התפקודי הבא30,31,32.
כל טכניקות הבידוד myocytes ניתן לסווג כיום לתוך כל נתח (חתיכה קטנה של רקמה) עיכול בתמיסה אנזימטית או זלוף CA עם פתרון אנזימטי (זלוף Langendorff)22. בהשוואה לשיטת לנגנדורף, שיטת העיכול של הנתח קלה יותר לביצוע ומשמשת גם באופן שגרתי לבידוד CMs במעבדות רבות. עם זאת, שיטה זו מייצרת בדרך כלל תשואה נמוכה של CMs באיכות ירודה מרקמות מבוגרות22. יתר על כן, תאים מבודדים בשיטה זו עשויים שלא להתאים לעריכת ניסויים השוואתיים. לדוגמה, בעת בדיקת השפעות סמים ספציפיות לסוג התא בין AM ו- VM, לא ניתן להזניח או לא לכלול את ההשפעה של תנאי בידוד שונים. הסיבה לכך היא שריר הלב וצפיפות הרקמות של החדר הם הרבה יותר עבה וצפוף מזה של האטריום, וכתוצאה מכך זמני עיכול שונים וריכוזים אנזימים. יתר על כן, תסיסה מוגזמת וצינורות של הרקמה במהלך העיכול יפגעו בתאים וישפיעו באופן משמעותי על מחקרים פונקציונליים. יתר על כן, מחקרים קודמים רבים הראו כי AMs פגיעים יותר לסידן. עם זאת, AMs מבודד על ידי הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות סובלני של סידן הדרגתי reintroduction כנראה בגלל הרקמה קלה לקרע בסוף תהליך העיכול. לכן, נזק מכני הוא פחות, בעוד תאים יסבלו יותר נזקים מכניים כמו צעדים של שיטת נתח צריך קרע חוזר וצנטריפוגלי. לאחרונה, Ackers et al.33 דיווחו על שיטה פשוטה, ללא לנגנדורף לבידוד של מיוציטים לב קיימא nonmyocytes. ניתן לבודד ביעילות את ה- VMs ואת הפיברובלסטים, אך כמות ה- AMs לא הוזכרה. עם זאת, לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות. ראשית, התפלגות כלי הדם של הלב עשויה להיות וריאציות עבור הבדלים בודדים ומתח עכברים, ואת עומק cannulation המומלץ לא יכול להבטיח בידוד AMs מוצלח עבור כל פעם. שנית, עבור אלה חדשים בהליך זה עשוי לקחת כמות מסוימת של זמן כדי לתרגל טרנספרציה של אב העורקים ו cannulation אב העורקים מדרדר. לבסוף, שיטה זו לא נבדקה במודלים אחרים של מחלות לב אלא בעכברים בריאים וקשישים. לפיכך, זה ידרוש התאמות בריכוזים אנזימים וזמן העיכול בגלל היקף פיברוזיס של הלב. החיסרון של תנאי עיכול שונים שנתקלו בשיטת הנתח לא יהיה בעיה בשיטת לנגנדורף שבה תמיסת האנזים מופצת באופן שווה לרקמה על ידי מיטות כלי הדם.
לסיכום, הפרוטוקולים לבידוד בו זמנית של AM יחיד ו- VM המתוארים כאן הוכיחו כי עומק שימורי העורקים הנכון יכול לשפר ביעילות זלוף אטריום ותפוקת AM. ה- CMs המבודדים בשיטה זו הם באיכות גבוהה, בעלי עמידות טובה לסידן, והם הוחלו בהצלחה על הקלטת מהדק תיקון וטיפול בסידן (שחרור Ca2+ ומדידת גל Ca2+ על ידי מערכת IonOptix) בצוות34. צפוי כי פרוטוקול הבידוד יכול לשמש להכנת התא בסדרה של חקירות תאיות ותת-תאיות, אשר יסייעו להעמיק את ההבנה של פיזיולוגיה לב ופתולוגיה. חשוב לציין, זה יאפשר גילוי של מנגנוני מחלות לב רלוונטיים יותר מבחינה קלינית ושיטות התערבות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) והקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (מס '7192051). תרומות מחברים: באי וליו עיצבו והרו את הפרויקט. וון ורואן סיפקו עצות חשובות לניסויים. וו ולילינג לי ביצעו את העבודה הניסיונית ומילאו תפקידי מפתח ברכישת נתונים, ניתוח ופרשנות. לי השתתף בהרכבת מנגנון לנגנדורף. פנג, ג'אנג, וואנג ויאנג השתתפו בהכנת ריאגנטים ופתרונות לפני הניסוי. וו כתב את המאמר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
- Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
- Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
- Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
- Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
- Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
- Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
- Dobrev, D., Wehrens, X. H. T.
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109 (2014).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823 (2014).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606 (2016).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).
