Summary
이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.
Abstract
단일 심근세포는 수축 및 전기 활동의 근본적인 단위로 심장 생물학 과 질병의 세포 및 세포 외 수준 연구에서 중요한 도구입니다. 따라서, 심장에서 실행 가능한, 고품질 심근 세포는 초기와 가장 중요한 실험 단계입니다 고립. 성인 마우스의 심근세포 를 분리하기 위한 다양한 프로토콜을 비교한 Langendorff 역행 성 구류는 특히 심실 심근세포를 분리하기 위해 문헌에서 보고된 가장 성공적이고 재현 가능한 방법입니다. 그러나, perfused 된 심혼에서 질 심방 심근세포를 격리하는 것은 도전남아 있고, 몇몇 성공적인 격리 보고는 유효합니다. 심실 질환을 제외하고, 심방 질환은 심장 질환의 큰 부분을 차지하기 때문에이 복잡한 문제를 해결하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, 메커니즘을 밝히기 위해 세포 수준에 대한 추가 조사가 보증된다. 본 논문에서, 랑엔도르프 역행 관류 방법에 기초한 프로토콜이 도입되고 대동맥 통포심과 심방 근구를 분리하기 위한 소화 과정에 영향을 미칠 수 있는 단계들이 동시에 이루어졌다. 더욱이, 고립된 심근세포는 클램프 조사를 패치할 수 있는 것으로 확인되었다.
Introduction
심장 질환은 사망의 주요 글로벌 원인 중 하나입니다1. 의료 시스템에 이 부담을 해결하기 위해 심장의 생리학과 병리학에 대한 심층적인 이해가 필수적입니다. 전체 동물과 온전한 심장 준비 외에도 세포 준비는 기능 및 질병 연구를위한 또 다른 필수 도구입니다2. 패치 클램프, 칼슘 이미징, 분자 생물학 및 기타 첨단 기술을 적용함으로써 연구자들은 단일 심근세포(CM)에서 전기 생리학적 특성, 칼슘 항상성, 신호 경로, 대사 상태 및 유전자 전사에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 이것은 심장 질병 프로세스의 생리적 및 병리학 적 메커니즘을 밝히는 데 매우 도움이됩니다3,4,5,6,7. 동물 연구를 위해, 작은 (예를 들어, 마우스, 쥐 및 기니 피그)에서 큰 (예를 들어, 토끼와 개)에 이르기까지 종을 사용할 수 있습니다. 작은 동물은 일반적으로 선호, 특히 마우스, 그들은 유전 및 질병 모델 조작에 순종하기 때문에8,9,10.
급성 격리 된 CM의 기술은 긴 개발 기간을 거쳤으며 여전히 진화하고 있습니다11. Langendorff 역행 관류는 쥐와 마우스에 적용되는 가장 성공적이고 재현 가능한 CM 격리 방법이며, 특히 심실 근세포(VM)12,13,14,15를 분리하는 데 사용됩니다. 그러나, 성공적으로 격리된 심방 근세포(AMS)의 보고는 부족16,17,18입니다. 전체 장기/시스템 및 세포/세포/세포/세포 에 대한 추가 조사는 기전을 드러내고 새로운 치료 접근법을 탐구하는 데 있어 가장 흔한 유형인 심방 세동(AF)이 전 세계적으로 점점 더 널리 퍼지고 있으며, 약리요법과 심장 절제 모두에서 현재 치료 양식은 약 40%-50%의 AF1 9%에서 효과가 없기 때문입니다. . 성공적인 성인 마우스 CM 격리는 셀룰러 연구를 위한 첫번째 단계입니다. 두 가지 기본 격리 방법을 사용할 수 있습니다: 청크 및 랑엔도르프 메서드. Langendorff 관류 방법에서 조직 소화는 관상 동맥과 그들의 가지가 모세관 침대에 전달한 효소 용액에 달려 있습니다. 대동맥 판막을 관통하고 관상 동맥 오스티아를 차단하는 것을 피할 수 있는 적절한 대동맥 통조림 깊이는 효율적인 소화와 이상적인 VM 수율을 위한 필수적인 단계인 관류 패턴을 달성하기 위한 전제 조건입니다. 따라서 대오르타 캐니어의 깊이가 아리아 선박의 관류에 유사하게 영향을 미치고 마지막으로 AM 수율에 영향을 미칠 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 다른 깊이에서 대어타 캐니언이 수행되었고 해당 AM 수율을 비교하였다. 데이터는 대자 통조림 깊이가 AM 수율과 직접 관련이 있음을 보여 주었다. 본 원에서, AMS와 VM을 동시에 격리하는 프로토콜이 도입된다.
Protocol
성인 남성 C57BL/6 무게 20-30 g, 8-10 주 자본 의과 대학의 동물 센터에서 구입, 베이징, 중국. 모든 실험 절차는 자본 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었으며 동물 자원 연구소가 제안하고 국립 보건 원에 의해 출판 된 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드를 준수하여 수행되었습니다. Excel 및 Origin 8.5는 데이터 수집 및 분석에 사용되었습니다. 데이터는 통계 평가를 위해 SD± 수단으로 제시되며, 학생의 t 시험이 사용되었고 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
1. 용액 및 관류 장치 준비
- 일정한 흐름 랑엔도르프 장치(시판또는 자체 제작)를 조립합니다. 그림 1 은 간단한 회로도를 제공합니다.
- 표 1 및 표 2에 주어진 시약에 따라 솔루션을 준비합니다.
- 순환 수조를 켜고 적절한 입력 온도(실험실내 42.7°C)를 조정하여 캐뉼라에서 의 분파 순환 시스템의 유출이 37°C에 도달할 수 있도록 합니다.
- 산화된 물을 순환하여 관류 시스템을 청소하십시오. 멸균 상태가 필요한 경우, 15분 동안 관류 시스템을 통해 75% 에탄올을 실행하고, 그 다음에 는 탈이온화된 물(심장에 알코올 독성 효과를 피하기 위해 최소 10사이클).
- 난투 순환 시스템의 한 주기에 대한 시간과 부피를 측정하여 다음 관류 단계에서 로드할 산소티로드솔루션의 밀리리터 수를 결정합니다.
- 원하는 방법으로 모든 수술 도구를 살균합니다.
- perfusate 관류 시스템의 유량을 4 mL/분에서 설정합니다.
- 티로드의 용액(페트리 디쉬 1), 다른 하나는 액1(페트리 디쉬 2)이 들어 있는 깨끗한 35mm 페트리 접시 1개를 준비합니다.
- 용액 1mL로 채워진 1mL 주사기와 20G 무딘 강철 캐뉼라 바늘을 원거리에서 팁까지 1mm의 노치로 준비합니다. 캐뉼라 샤프트에 3-0 봉합사로 느슨한 매듭을 준비합니다. 스테레오현미경의 시야를 조절하고 캐뉼라 팁이 페트리 접시 2의 액체 표면 아래에 있는지 확인합니다.
2. 동물 준비
- 혈전을 피하기 위해 마우스에 헤파린(농도, 1,000IU/mL; 0.2 mL/마우스)을 관전적으로 투여한다. 10 분 후, 나트륨 펜토 바르 비탈 (50 mg/kg, I.P. 주입)으로 마우스를 마취하고 마우스가 꼬리 / 발가락 핀치에 반응하는 것을 멈추게합니다. 헤파린 투여 후 20분 간 자궁경부 탈구를 수행합니다.
- 마우스를 수술 플랫폼으로 옮기고, 쥐를 수핀 자세로 고정하고, 75%에탄올로 가슴을 살균하고, 거즈 나 냅킨으로 건조시한다.
3. 심장 절제 및 대오르타 캐니션
- 조직 집게로 xiphoid의 피부를 들어 올리고 조직 가위로 피부를 통해 경미한 측면 절개를합니다. 피부와 근막 사이의 무딘 해부를 수행하고 양쪽의 축실을 향해 V 모양으로 피부의 절개를 확장합니다.
- 흉곽을 통해 동일한 절개 흔적을 계속 한 다음, 흉골을 조직 집게로 고정하여 흉곽을 위쪽으로 편향시켜 심장과 폐를 완전히 노출시합니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 심낭을 벗깁니다. 큰 배를 덮으면 두 개의 구부러진 집게로 양쪽을 향해 흉선을 찢습니다. "Y"모양의 혈관 (대동맥과 그 가지 동맥)이 보일 때까지 구부러진 집게로 심장의 기초를 부드럽게 꼬리쪽으로 당깁니다.
- 캐니언레이션 및 비교를 위해 대동맥의 다른 길이를 예약하려면, 좌측 일반적인 경동맥( 도 2의 녹색선)에서 대동맥을 분리하고 일부 마우스에서 동시에 브라치오셉할릭 동맥을 잘라낸다. 다른 마우스에서 오름차순 대어에서 의전 ( 도 2의 검은 선).
참고: 이 절차에 익숙하지 않은 사람들을 위해, 이 단계는 또한 입체 현미경의 밑에 행해질 수 있습니다. - 심장을 절제하고 페트리 접시 1에 즉시 몰입하여 잔류 혈액을 씻어 내시습니다.
- 페트리 접시 2에 심장을 옮기고 필요한 경우 미세홍채 가위를 사용하여 잉여 조직을 다듬습니다. 이 절차에 새로운 사람들을 위해, 잘못 대장 또는 다른 심장 구조를 절단 피하기 위해 스테레오 현미경에서이 단계를 수행.
- 주사기를 밀어 대르타 캐니언 전에 기포를 추방합니다. 스테레오 현미경에서 두 개의 직선 타이포프 (부드러운 턱)의 도움으로 역행 대금통을 수행합니다. 전체 캐너레이션 프로세스가 액체 표면 아래에 있는지 확인합니다.
- 대동맥 판막을 관통하지 말고 오름차순 대동맥(대동맥이 좌측 일반적인 경동맥에서 대동맥을 변형한 마우스)과 대동맥 뿌리(대동맥이 상승대동맥에서 대동맥을 변형한 마우스)에 각각 깊이를 조절한다.
참고: 대오르타 캐뉼레이션의 깊이(단순히 깊이라고 함)는 캐뉼라 팁이 대오르타에 있거나 대어타가 합리되는 위치로 정의됩니다. - 캐뉼라 노치에 미리 매듭 3-0 봉합사로 대자를 리게이트. 주사기 함량을 부드럽게 눌러 잔류 혈액을 헹구십시오.
참고 : 혈액은 관상 동맥을 떠나 깊이가 제대로 배치되면 등쪽 정맥에서 effuse합니다. 심장과 심방 부속기는 확장되고 창백해질 것입니다. - 캐뉼라를 제거하고 랑엔도르프 장치에 연결합니다. 다시 한번, 심장에 들어가는 기포를 피하기 위해주의하십시오.
참고: 흉부 절제술에서 초기 관류까지의 시간은 5분 이상이어야 합니다.
4. 심장 관류
- 첫째, 약 10s(이 프로토콜에 사용되는 시스템에서 10s를 실행하는 액체의 부피는 약 0.7mL)에 대한 산소산소 티로드의 용액을 아드리고, 그 후 용액 1로 전환한다. 그러나, 다만 용액으로 perfuse 1 atria에 잔류 혈액이 없는 경우에. 약 2 분 동안 심장을 퍼퓨즈하십시오.
- 솔루션 3으로 전환합니다. 용액 3의 약 2.5mL를 일회용 멸균 폴리에틸렌 파이펫으로 빨아 나중에 사용하기 위해 수조에 미리 데우며, 나머지는 약 11-12 분 동안 관류에 사용됩니다. 처음 2분 동안 용액 3을 폐기하십시오. 나머지는 연동 펌프에 의해 난투 저장소에 나머지를 재활용하여 소화가 완료될 때까지 재사용하십시오.
- 심혼이 부어오르고 약간 창백해지고 flaccid (스폰지 질감)로 변하거나 심근이 치아 집게를 사용하여 부드럽게 꼬집으면 각인이 존재할 때 소화를 종료합니다.
5. 세포 격리 및 칼슘 재도입
- 집안과 아틀리아를 집게로 제거하고 다른 페트리 요리에 넣습니다. 페트리 요리에 미리 따뜻해지는 용액 3을 추가합니다.
- 조직을 무딘 집게로 탁한 질감으로 삼각조하고 소화를 위해 조직을 부드럽게 피펫합니다. 기포를 도입하지 마십시오.
- 피펫으로 탁탁구 소화 조직을 용액 4로 옮기고, 19×2g에서 20s의 원심분리기를 체포한다. 상체를 제거하고 셀 퇴적물 및 파이펫에 용액 5를 추가하여 셀을 고르게 분산시합니다.
- 칼슘 역설과 칼슘 과부하를 피하기 위해 단계적으로 칼슘을 다시 도입하십시오. 점차적으로 셀 현탁액에 총 50 μL 100 mM /L CaCl2 (5 μL, 10 μL, 15 μL 및 20 μL의 간격마다)를 셀 서스펜션에 추가합니다.
6. 셀 스토리지
- 패치 클램프 스터디의 경우 타이로드의 용액에 셀을 저장합니다. 다른 세포 연구의 경우 세포를 용액 6에 저장합니다.
- 급성 기능 연구의 정확성을 보장하기 위해'(예 : Ca2 + 불꽃, Ca2 + 파도, Ca2 + 릴리스, Ca2 + 누출 및 패치 클램프 레코딩) 결과, 다음 6 시간 이내에 기능 실험의 이러한 종류를 완료합니다.
Representative Results
캐뉼라 팁이 대어타에 위치하는 이 논문은 대르타 캐뉼레이션(단순히 깊이라고 함)의 깊이로 정의되며 대자가 계합되는 위치를 나타냅니다. AM과 VM은 오름차순 대오르타에서 캔누킹되고 결찰된 심장에서 분리된 AM과 VM은 각각 AMAA 및 VMAA로 표현된다. 더욱이, 대동맥 뿌리에서 수거되고 결찰된 심장으로부터 분리된 AM과 VM은 각각 AMAR 및 VMAR로 표현된다. 그림 2 는 대동맥 과 횡선 위치의 개요를 나타낸다. 또한 도 3 은 대동맥 배치 위치에 해당하는 깊이 및 결찰 장소를 나타낸다. 깊이는 심방 부속기의 관류와 연관되었다. 두 심방 부속기는 캐뉼라 팁이 오름차순 대오르타에있을 때 팽창되어 충분한 atria 관류를 나타냅니다. 그러나 대동맥 뿌리에서, 동맥 관류가 불충분하고 심방 부속술이 모두 양면(도 4). CM 형태와 칼슘 재도입 후 다른 깊이에서 수양 된 심혼에서 격리되는 생존가능성 (그림 5). AMAA, AMAR, VMAA 및 VMAR의 세포 형태는 칼슘 재도입 전후에 공초점 현미경의 밑에 있습니다. AMS는 스핀들 모양이며 VM은 직사각형 끝이있는 막대 모양입니다. 또한, AMS와 VM은 그대로 멤브레인, 명확한 윤곽, 명확한 사코레, 매끄러운 표면 (그림 6)을 가지고있다. 세포 생존력은 트라이판 블루 염색을 통해 평가되었다. 그대로 막이 있는 정상 세포는 trypan blue를 제외할 수 있고 염색되지 않을 것이고, 세포 손실 활동은 세포내 에 빠르게 트라이판 블루를 축적합니다(그림 7). AMM 및 VM은 셀 계산을 수행하기 위해 서로 다른 개체 슬라이드에 배치되었습니다. AM의 총 수율 및 실행 가능한 스핀들 형 CM(생존율)의 백분율은 세포 현탁액의 10 μL을 물체 슬라이드로 이송하여 결정되었으며, 4× 10개의 시야에서 반전된 위상 대비 현미경으로 계산하였다. 동일한 방법을 사용하여 VM(막대 모양)의 총 수율과 실행 가능한 VM의 백분율을 결정하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 CM이 크기와 모양 때문에 혈종계의 계수 영역으로 쉽게 분산되지 않았기 때문에 혈전계를 사용하는 것이 바람직하다. 바 그래프(그림 8)는 칼슘 재도입 전후AMAA, AMAR, VMAA 및 VMAR의 생존율을 나타낸다. 각 값은 10마우스에서 평균 ± SD를 나타낸다. 칼슘 재도입 전에, AMAA의 생존율은 AMAR의 생존율이 각각 2.8%와 41.0 ±%± 5.2%보다 현저히 높습니다. p < 0.01). 칼슘 재도입 후, AMAA의 생존율은 AMAR(69.4%± 3.0% 및 37.7%± 4.9%보다 현저히 높습니다. p < 0.01).
VMAA 생존율은 VMAR의 생존율(89.5%± 2.7% vs 88.1% ± 2.6%와 다르지 않았습니다. p > 0.05) 칼슘 재도입 전에. 유사하게, VMAA 생존율은 VMAR의 생존율(82.2%± 1.9% vs 82.9%± 1.6%와 다르지 않았습니다. p > 0.05) 칼슘 재도입 후.
이 프로토콜이 권장하는 대로 심도에서 심장을 심층적으로 할 수 있습니다 (오름차순 대어에서), 칼슘 재도입 후 각각 약 410 만 및 약 180,000의 실행 가능한 VM 및 AM의 수율. 고립된 AM 및 VM에서 나트륨 전류(도 9A, B) 및 현재 밀도(도 9C)의 전세포 패치 클램프 기록은 세포 품질이 전기생리학적 실험에 대한 요구 사항을 충족했는지 확인한다. 대동맥(도 10)의 해부학은 심방 용기의 타편이 대동맥 근근처에 있고 관상동맥(CA)의 타편에 인접하고 있음을 보여준다. 표 3 은 캐뉼라 팁에서 상승하는 대동맥과 대동맥 뿌리에서 각각 기울어진 하트의 CA 타골까지의 거리를 나타낸다.
그림 1. 조립 된 랑엔도르프 시스템의 회로도. 이 시스템은 사용자에게 경제적이고 휴대성이 뛰어나습니다. 그것은 물 (내부 직경, 8mm)에 대한 플라스틱 튜브 - 하나의 두 부분으로, 하나는 난투 (내부 직경, 1.5 mm)-그 중 말단은 Luer 잠금 장치가있는 PE 의료 3 방향 스톱콕에 연결되어 있습니다. 물을 포함하고 열 교환기로 고무 스토퍼 형태와 유리 병. 난투는 연동 펌프에 의해 열교환기의 플라스틱 튜브로 펌핑되어 캐뉼라에 연결된 3 방향 스톱콕에서 나옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 주변에 대어타와 조직. "Y"모양의 혈관 구조는 대동맥과 그 가지입니다 : brachiocephalic 동맥 (화살표 1) 및 왼쪽 일반적인 경동맥 (화살표 2). 좌측 일반적인 경동맥(green line) 사이의 대동맥을 분리하고 동시에 일부 마우스에서 브라치오셉할릭 동맥을 절단하는 단계; 다른 마우스에서 오름차순 대어타 (검은 선)에서 변환 (스테레오 현미경 10 × 2 배율). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 수양 된 심장의 정면보기. 검은 곡선선은 왼쪽 공통 경동맥 사이에 분리된 대동맥의 절개 가장자리를 나타낸다. 빨간색 곡선선은 오름차순 대오르타에서 대회된 대오르트의 절개 가장자리를 나타냅니다. 직선은 대동맥이 합리된 위치를 나타냅니다: 오름차순 대동맥에서 검은색과 대동맥 뿌리에서 빨간색(스테레오현미경 10 × 2 배율). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 수중 마음의 관류 상태. 아리아는 충분히 perfed, 그리고 심방 부속기 는 심장에 팽창 (A) 캐누와 상승 대어에 리그. 그러나 심방 부속기는 심장 (B)에서 양면되어 대동맥 뿌리에서 칸핑되고 구비되어 가난한 동맥 관류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 칼슘 재도입 후 세포 형태 및 생존 가능성 평가. AMS(A) 및 VM(B)은 심장으로부터 분리되어 오름차순 대오르타에서 분리되고 각각 AMA및 VMA로 표현된다. 대동맥 뿌리에서 분리된 심혼으로부터 분리된 AMM(C) 및 VM(D)은 각각 AMMA및 VMA로 표현된다. 고품질 의 CM은 정지하고 그대로 멤브레인, 명확한 윤곽, 명확한 striated sarcomeres, 부드러운 세포 표면을 가지고있다. AMM은 스핀들 모양이며, VM은 직사각형 끝이있는 막대 또는 벽돌 모양입니다. 자발적으로 수축하거나 막에 흠을 포함하는 CM은 품질이 좋지 않으며 구형 모양으로 축소되는 CM은 죽은 세포입니다. 임의의 시야(형광 현미경, 10× 10배율, 스케일 바, 100 μm). AM = 심방 심근세포, VM = 심실 심근세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 칼슘 재도입 전후의 공초점 현미경하에서 세포 형태. 칼슘 재도입 전에 AMAA(A)와 AMAR(C)는 투명한 윤곽, 새트리트 사코메리, 매끄러운 멤브레인 표면이 있는 스핀들 모양입니다. 칼슘 재도입 후, AMAA(B)와 AMAR(D)도 투명한 윤곽, 새트리트 사코메리, 매끄러운 멤브레인 표면으로 스핀들 모양입니다. 칼슘 재도입 전에 VMAA(E)와 VMAR(G)는 명확한 윤곽, 사코메레, 직사각형 끝이 있는 매끄러운 멤브레인 표면이 있는 막대 또는 벽돌 모양입니다. 칼슘 재도입 후 VMAA(F)와 VMAR(H)는 명확한 윤곽, 조각된 사코메레 및 직사각형 끝이 있는 매끄러운 멤브레인 표면(공초점 현미경 오일, 63× 10배율, 스케일 바, 50 μm)을 가진 막대 또는 벽돌 모양입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 세포 생존 가능성 평가. 활동을 잃는 손상된 세포는 트라이판 블루에 의해 염색됩니다. 대조적으로, 실행 가능한 세포는 trypan blue (형광 현미경, 4 × 10 배율; 스케일 바, 100 μm)에 의해 염색될 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. AMAA, AMAR, VMAA 및 VMAR의 생존율을 보여주는 바 그래프는 칼슘 재도입 전후에 있습니다. CR = 칼슘 재도입. 각 값은 10마우스에서 평균 ± SD를 나타낸다. p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 내용(mmol/L의 최종 농도, 다르게 지정되지 않은 경우) | 유명한 |
| 관류 용액(용액 1) | 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 타우린, 5 포도당, 10 2,3-부디온 모노시메 (BDM) | 이는 4°C에서 3일 동안 보관할 수 있다. 포도당, 타우린 및 BDM은 실험 당일에 추가됩니다. 각 심장에 대한 200mL의 관류 용액을 준비합니다. |
| 타이로드의 솔루션 (솔루션 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 포도당 | 이는 4°C에서 3일 동안 보관할 수 있다. CaCl2 및 포도당은 실험 당일에 첨가되며, PH 미터를 사용하여 실온(28-30°C)에서 포화 된 NaOH와 함께 pH를 7.3-7.4로 조정합니다. |
표 1. 성인 마우스 CM 절연용 솔루션입니다.
| 용액 | 목차 | 유명한 |
| 소화 용액(용액 3) | 25 mL 용액 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg 콜라게나아제 II, 50μL (2.5% 10×) 트립신 | 각 심장에 대해 |
| 정지 용액 1(솔루션 4) | 9 mL 용액 1, 1 mL FBS (태아 소 세럼), 4μL 100 mMM / L CaCl2 | 각 심장에 대해 |
| 정지 용액 2(용액 5) | 9.5 mL 용액 1, 0.5 mL FBS (태아 소 세럼), 4μL 100 mM /L CaCl2 | 각 심장에 대해 |
| 셀 리서스펜션 용액(용액 6) | 13 mL 용액 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (황소 세럼 알부민) 액체의 표면을 덮고 얇은 층을 형성할 수 있는 복용량에서 | 각 심장에 대해 |
표 2. 성인 마우스 CM 절연 및 저장을위한 솔루션.
그림 9. 나트륨 채널의 전류 전압 곡선입니다. 전세포 패치 클램프 기술은 전압 클램프 모드에서 절연된 심근세포의 나트륨 전류를 기록하는 데 사용되었습니다. 전압 클램프 프로토콜은 인세트에 표시됩니다. AM(A) 및 VM(B)으로부터 기록된 나트륨 전류가 표시됩니다. -45mV, -40mV 및 -35 mV의 잠재력에 현재 밀도는 AM에서 상당히 높다 (-32.71 ± 1.597 pA / pF, -31.49 ± 1.820 pA / pF, 및 -29.34 ± 1.939 pA/pF, 각각; n = 10) VM에서 보다 (-17.66 pA/pF ± 1.976 pA/pF, -21.09 ± 1.560 pA/pF, 및 -21.86 ± 1.381 pA/pA/ pA; 8F; P < 0.05). (C) I-V 곡선은 세포 정전용량으로 정규화된 나트륨 전류 밀도를 보여 준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10. 심방 선박의 원산지 및 분배. 심방 용기(화살표 1)와 패널 A. 패널 B의 CA(화살표 2)는 심방 용기(arrow 3)를 자세히 살펴본다. (C) 두 개의 상이한 크기의 오스티아가 존재한다. 1(화살표 4)은 심방 부속물을 관개한 심방 용기에 대응하고, 다른 하나(화살표 5)는 CA(스테레오현미경 10× 5배율)에 해당한다. CA = 관상 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 마우스의 일련 번호 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| 대르타 캐니핑의 깊이는 오름차순 대오르타에 있습니다. | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| 대동맥 통조림의 깊이는 대동맥 뿌리에 있습니다. | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
표 3. 캐뉼라 팁에서 관상 동맥 타골까지의 거리. C57BL/6 마우스(n=20)의 심장은 각각 오름차순 대동맥 및 대동맥 뿌리의 깊이에서 대동맥을 캔누레이하고 리게이트하는 데 사용되었다. 대자는 해부학되고, 캐뉼라 팁에서 CA 오스트리움까지의 거리를 측정했다. 거리는 밀리미터단위로 측정되며, 양수 또는 음수 징후는 CA 오스티움 위와 아래 의 캐뉼라 팁을 각각 나타냅니다.
Discussion
단일 CM은 심장 기능 및 질병의 세포 수준 연구에서 귀중하고 필수 불가결한 도구입니다20. 따라서, 마음에서 실행 가능한 CM의 격리는 초기와 가장 중요한 단계입니다. 세포 질은 성공적인 실험을 수행하는 중요한 결정요인 중 하나입니다, 특히 광학 및 전기 생리실험에서. 다른 동물의 CM과 비교하여 설치류 심소는 Na+/Ca2+ 교환기를 통한 칼슘 유입을 선호하는 세포내 나트륨 이온의 농도가 높기 때문에 허혈과 저산소증에 더 취약합니다. 또한 AM의 수는 VM보다 훨씬 적습니다. 따라서 성공적인 격리는 달성하기가 매우 어렵습니다. Langendorff 방법은 마우스 VMs22를 격리하는 데 탁월하지만 AM을 격리하는 성공률은 낮으며 몇 가지 보고서를 사용할 수 있습니다. 대르타 캐넌트의 적절한 깊이는 완충 제고에 사용되는 온도, 효소 활성, PH 및 수질을 제외하고 이상적인 VM을 산출하는 데 필수적인 요소입니다. 랑엔도르프 방법의 원리는 심장의 역행 적 관류에 의존한다. 관류시 대동맥 판막이 닫힙시; 따라서, 난투는 관상 동맥으로 강제로 들어가 혈관 가지를 통해 효소 용액을 전달하며 심근 조직을 고르게 소화한다. 이러한 종류의 순환 패턴을 달성하기 위해 대동맥은 캐뉼레이션 및 결찰을 위해 충분한 길이를 예약해야 하며, 캐뉼라 팁은 대동맥 판막을 관통하거나 CA 오스트륨을 차단해서는 안 됩니다. 따라서, 대르타 통포의 깊이는 또한 아리아 관류와 연관되어 있다고 추측하는 것이 합리적이며, 이는 아리아의 소화 효능과 AM의 수율에 유사한 방식으로 영향을 미친다. 여기에 제시된 프로토콜은 가설을 확인했으며 제안과 함께 세포 수율을 최적화하기위한 중요한 단계는 아래에 나와 있습니다.
1.9 단계에서, 대동맥을 더 잘 고정하기 위해, 거리가 1mm인 곳에서 팁까지 노치(또는 둘레 홈)가 있는 무딘 20 G 캐뉼라를 추천한다. 우리의 경험에 기초하여, 대동맥의 직경보다 약간 더 큰 캐뉼라 크기는 대동맥 이절 동안 대동맥 판막을 뚫는 것을 막기 위해 발견되었는데, 이는 대동맥이 내장탄성에 의존하여 캐뉼라에 잘 맞고 앞으로 움직일 때 보호 요인으로 작용하여 마찰을 일으킵니다. 노치의 위치의 관점에서, 심장은 캐뉼라 팁에 너무 가까운 경우 중력 때문에 통조림 중에 쉽게 미끄러집니다. 반대로, 캐닝 깊이및 결찰 위치를 조정하는 공간은 너무 멀리 가면 매우 제한됩니다. 이러한 상황을 감안할 때, 좌측 일반적인 경동맥( 도 2의 그린 라인)을 대동맥사이로 대관하는 것은 대동맥이 충분히 길고 승천 대동맥에서 칸누우고 결찰될 수 있도록 3.3단계에서 더 낫다. 오름차순 대동맥에서 대회하는 반면, 캐뉼레이션을 위한 예약 된 길이는 적어도 대동맥 뿌리에 가까운 캐뉼라 팁을 고정할 수 있으며 결찰 후 대동맥 판막을 관통하지 않습니다. 대동맥의 해부학과 캐뉼라 팁에서 CA 오스트리움까지의 거리의 측정은 좌측 일반적인 경동맥 사이대동맥을 비장염시키는 것이 적절한 대동맥 수분 깊이를 달성하기에 이상적인 위치임을 나타낸다.
수분 깊이는 아리아의 관류와 연관되는 것으로 나타났으며, 이는 차례로 깊이 표시기역할을 한다. 도 4 는 심도가 상승 대오르타에 있을 때 아리아 관류가 좋고 심방 부속서가 팽창된다는 것을 보여줍니다. 그러나, 심도가 대동맥 뿌리에 있을 때(또는 접근)하고 심방 부속서가 모두 비정할 때 동맥 관류는 불충분하다. 팽창된 심방 부속물에서 산출된 AM의 총 및 실행 가능한 수는 더 높았습니다(그림 8). 이러한 연구 결과는 대마 통포 깊이가 특정 방식으로 심방 부속기의 관류 및 소화에 영향을 미치고 마침내 AM 수율과 품질에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다. AM의 수율과 품질은 아리아를 공급하는 선박의 분포와 관련이 있다고 추론되었다. 페르난데스 외.23 의 연구는 마우스 CA의 기원과 과정에서 다양한 이상을 입증했다. 그(것)들은 CAs ostia가 높게 가변적이고 모두 대동맥 부비동에 있지 않다는 것을 것을을 발견했습니다. 일부 CA는 대동맥 부비동 위에서 비정상적인 것으로 유래할 수 있으며, 높은 이륙 오스티움이라고 명명되었습니다. 일부 카라는 동일한 대동맥 부비동에서 유래할 수 있으며 아트리움 선박의 타륨은 바로 근처에 있습니다. 본 연구에서 대어의 해부학 (그림 10) 또한 페르난데스의 발견과 일치. 이는 랭엔도르프 법에 의한 AM을 격리하려는 시도가 캐너레이션 깊이가 적절하지 않은 경우 크게 실패한 원인이 될 수 있다. 따라서, 캐뉼라 팁은 캐뉼라 팁과 CA 오스트리움 사이에 충분한 공간이 없다면 CA 오스트륨에 인접한 아트리움 혈관 타당을 차단할 확률이 더 크다. 대조적으로, 대동맥 판막이 캐뉼라 팁에 의해 침투되지 않는 한 심실의 관류 및 세포 수율은 거의 영향을 받지 않았다. 이것은 아마 심실에 혈액을 공급하는 CA가 더 큰 ostia 및 더 많은 기원이 있기 때문일 것입니다. 한 개의 타골이 캐뉼라에 의해 가려진 경우, 심실 관류는 다른 CA 또는 부수적 순환에 의해 보상될 수 있는 반면, 아트리움을 공급하는 혈관은 다소 작고 대체품이 없습니다. 따라서 대오르타 캐니튜레이션에 깊이의 영향이 중요하다.
소화 및 세포 저장 공정에서 다른 주목할만한 요인과 문제 촬영은 다음과 같이 나열됩니다. 첫째, 근육 계약을 하고 아리아의 혈액이 대르타 결찰 후에 돌진되지 않은 경우 잔류 혈액을 펌핑하기 위해 4.1 단계에서 산소티로드의 용액을 인하여 사용하는 것을 고려하십시오. 이것은 손상된 적혈구에서 풀어 놓인 ca2+ 및 그밖 물자의 부작용을 방지하는 것을 도울 수 있습니다. 둘째, CA2+없는 용액을 미리 침투하여 연결을 분리하고 세포 간 공간을 확장하면 CM 간의 상호 작용 디스크가 칼슘 의존식 세포 간 접합이기 때문에 효소 소화의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 칼슘 역설 현상을 피하기 위해 3-5분으로 제한해야 한다.24. 혼합 효소 용액을 권장합니다. 콜라게나아제 타입 II는 세포외 매트릭스 네트워크를 방해하고, 트립신은 콜라게나아제 II 소화가 불완전한 경우 세포 표면에 남아있는 세분화된 물질을 지우는 데 도움이 됩니다. 이렇게 하면 패치 클램프 레코딩에서 GΩ 씰을 형성하는 데 중요한 매끄러운 셀 표면이 보장됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 트립신 농도 막 단백질을 저하시킬 수 있기 때문에 소화 와 세포 손상을 피하기 위해 적절 한 범위에서 제어 해야 합니다. 콜라게나아제 타입 II를 단독으로 사용하여 세포 수율을 향상시키는 것은 종종 소화를 통해 조직으로 이어질 수 있으며, 격리된 CM은 콜라게나아제 노출25를 연장한 후 칼슘 내성이 될 것이다. 미오신 ATPase를 억제하고 교단 형성을 방지하여 자발적수축을 방지하는 물질인 2,3-부탄단 단조음(BDM)의 사용은 여전히 논란의 여지가 있다26,27,28,29. 이전 경험에 따르면 이 프로토콜에 BDM을 추가하는 것이 필요합니다. 효소 용액은 용액 1을 사용하여 제조되지만 용액 1은 칼슘을 포함하지 않으며, 효소를 활성화하기 위해 칼슘을 첨가한다. 관류 용액에 BDM을 첨가하는 이점은 (1) 효소 용액 관류 동안 근구 수축을 억제하고 산소 소비를 감소시키고 (2) 저산소증에서 심세포를 방지하고 격리된 심근세포의 품질을 향상시키는 것을 포함한다. 일부 연구는 BDM 세포 전기 속성에 잠재적인 불리 한 영향을 미칠 수 있습니다 보고. 그러나, 나트륨 전류의 전세포 패치 클램프 기록의 결과는 바람직하지 않은 효과를 나타내지 않았다. 세포 저장 단계(6단계에서)에서, 칼슘이 없지만 높은 칼륨 농도 용액인 KB 버퍼를 선택하여 세포가 편광되고 낮은 대사 조건에 있기 때문에 더 나은 상태를 유지할 수 있다. 그러나, 세포막의 글리코칼릭스는 일정 시간 동안 외인성 칼슘이 없는 지질 이중층으로부터 분리되며 멤브레인 투과성이 증가하여 후속 기능 분석에 영향을 미칠 것이다30,31,32.
모든 근세포 절연 기술은 효소 용액또는 효소 용액(Langendorff 관류)22를 가진 CA 관류에서 현재 두 덩어리(작은 조직의 작은 조각) 소화로 분류될 수 있다. Langendorff 방법과 비교하여 청크 소화 방법은 수행하기가 더 쉬울 수 있으며 많은 실험실에서 CM을 격리하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나,이 방법은 일반적으로 성인 조직에서 가난한 품질의 CM의 낮은 수율을 생성22. 더욱이, 이 방법에 의해 분리된 세포는 비교 실험을 수행하기에 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, AM과 VM 사이의 세포 유형 별 약물 효과를 테스트할 때, 상이한 격리 조건의 영향을 무시하거나 배제할 수 없다. 이는 심실의 심근과 조직 밀도가 아트리움보다 훨씬 두껍고 밀도가 높기 때문에 소화 시간과 효소 농도가 다르기 때문입니다. 더욱이, 소화 중 조직의 과도한 동요와 배관은 세포를 손상시키고 기능 연구에 크게 영향을 미칩니다. 더욱이, 많은 이전 연구는 AMS가 칼슘에 더 취약하다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 현재 프로토콜에 의해 분리된 AMM은 소화 과정의 끝에 조직이 파열되기 쉽기 때문에 아마 그라데이션 칼슘 재도입에 관대할 수 있다. 따라서, 기계적 손상은 덜, 반면 세포는 청크 방법의 단계가 반복 파열 및 원심을 필요로하기 때문에 더 많은 기계적 손상을 겪을 것이다. 최근에는 Ackers 외.33이 실행 가능한 심장 근세포 및 비근구체의 분리를 위한 단순화된 랑엔도르프 프리 방법을 보고했습니다. VM과 섬유아세포는 효과적으로 분리될 수 있지만, AM의 양은 언급되지 않았다. 그러나 이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 심장 혈관의 분포는 개별적인 다름 및 마우스 긴장에 대한 변이를 가질 수 있고, 추천된 캐너레이션 깊이는 매번 성공적인 AMM 격리를 보장할 수 없다. 둘째, 이 절차에 익숙하지 않은 사람들을 위해 대동맥 절제술을 연습하고 대동맥을 역행하는 데 일정 시간이 걸릴 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 건강하고 노인 마우스를 제외하고 다른 심장 질환 모델에서 테스트되지 않았습니다. 따라서, 그것은 효소 농도와 심장의 섬유증 정도 때문에 소화의 시간에 조정을 필요로 할 것 이다. 청크 방법에 발생하는 상이한 소화 조건의 단점은 효소 용액이 혈관 침대에 의해 조직에 균등하게 분포되는 Langendorff 방법에서 문제가 되지 않을 것이다.
요약하자면, 여기에 설명된 단일 AM 및 VM의 동시 절연을 위한 프로토콜은 적절한 대오르타 수분 깊이가 아트리움 관류 및 AM 수율을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 이 방법에 의해 분리 된 CM은 고품질이며, 좋은 칼슘 내성을 가지고 있으며, 성공적으로 ionOptix 시스템에 의해 패치 클램프 레코딩 및 칼슘 처리 (Ca2 + 릴리스 및 Ca2 + 웨이브 측정)에 적용되었습니다34. 격리 프로토콜은 일련의 세포 및 세포 세포 조사에서 세포 준비를 위해 사용될 수 있으며, 이는 심장 생리학 및 병리학에 대한 이해를 심화시키는 데 도움이 될 것입니다. 중요한 것은, 그것은 더 임상적으로 관련있는 심장병 기계장치 및 내정간섭 방법의 발견을 가능하게 할 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) 및 베이징 자연과학 재단(no. 7192051)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자 기여: 바이와 리우는 이 프로젝트를 설계하고 구상했습니다. 웬과 루안은 실험에 귀중한 조언을 제공했다. 우와 린링 리는 실험작업을 수행하고 데이터 수집, 분석 및 해석에서 핵심적인 역할을 수행했습니다. 리 리는 랑엔도르프 장치 조립에 참여했다. 펑, 장, 왕, 양은 실험 전에 시약과 솔루션의 준비에 참여했다. 우는 기사를 썼다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
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