Summary
Dieses Protokoll beschreibt Modifikationen der Langendorff-Methode einschließlich der Tiefe der Aortenkanülierung zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen.
Abstract
Ein einzelner Kardiomyozyt ist ein wichtiges Werkzeug in den zellulären und subzellulären Studien der Herzbiologie und -krankheiten als grundlegende Einheit der Kontraktion und elektrischen Aktivität. Daher ist die Isolierung lebensfähiger, hochwertiger Kardiomyozyten aus dem Herzen der erste und wichtigste experimentelle Schritt. Vergleicht man die verschiedenen Protokolle zur Isolierung der Kardiomyozyten erwachsener Mäuse, ist die Langendorff-Retrogradperfusion die erfolgreichste und reproduzierbarste Methode, die in der Literatur berichtet wird, insbesondere zur Isolierung ventrikulärer Myozyten. Die Isolierung hochwertiger Vorhofmyozyten aus dem durchbluteten Herzen bleibt jedoch eine Herausforderung, und es liegen nur wenige erfolgreiche Isolationsberichte vor. Die Lösung dieses komplizierten Problems ist äußerst wichtig, da neben der Ventrikelerkrankung die Vorhoferkrankung einen großen Teil der Herzerkrankungen ausmacht. Daher sind weitere Untersuchungen auf zellulärer Ebene zur Aufdeckung der Mechanismen angebracht. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, das auf der Langendorff-Retrogradperfusionsmethode basiert, und einige Modifikationen in der Tiefe der Aortenkanülierung und den Schritten, die den Verdauungsprozess beeinflussen können, um atriale und ventrikuläre Myozyten zu isolieren, wurden gleichzeitig vorgenommen. Darüber hinaus wird bestätigt, dass die isolierten Kardiomyozyten für eine Patch-Clamp-Untersuchung geeignet sind.
Introduction
Herzerkrankungen sind weltweit eine der häufigsten Todesursachen1. Um diese Belastung für das Gesundheitssystem anzugehen, ist ein tiefes Verständnis der Physiologie und Pathologie des Herzens unerlässlich. Neben der Präparation des ganzen Tieres und des intakten Herzens ist die Zellpräparation ein weiteres unverzichtbares Werkzeug für funktionelle und Krankheitsstudien2. Durch die Anwendung der Patch-Clamp, Der Kalziumbildgebung, der Molekularbiologie und anderer fortschrittlicher Technologien können Forscher mehr Informationen über die elektrophysiologischen Eigenschaften, die Calciumhomöostase, signalwege, Stoffwechselzustände und Gentranskriptionen in einem einzigen Kardiomyozyten (CM) erhalten. Dies ist äußerst hilfreich, um die physiologischen und pathologischen Mechanismen des Herzkrankheitsprozesses aufzudecken3,4,5,6,7. Für Tierversuche können Arten verwendet werden, die von kleinen (z. B. Mäuse, Ratten und Meerschweinchen) bis hin zu großen Tieren (z. B. Kaninchen und Hunde) reichen. Kleine Tiere werden normalerweise bevorzugt, insbesondere Mäuse, weil sie für genetische und Krankheitsmodellmanipulationen zugänglich sind8,9,10.
Techniken akut isolierter CMs haben eine lange Entwicklungsphase durchlaufen und befinden sich noch in der Entwicklung11. Die Langendorff retrograde Perfusion ist die erfolgreichste und reproduzierbarste CMs-Isolationsmethode, die bei Ratten und Mäusen angewendet wird, insbesondere zur Isolierung ventrikulärer Myozyten (VMs)12,13,14,15. Berichte über erfolgreich isolierte Vorhofmyozyten (AMs) sind jedoch selten16,17,18. Weitere Untersuchungen auf beiden Ebenen des gesamten Organs/Systems und des zellulären/subzellulären Systems, um die Mechanismen aufzudecken und neue therapeutische Ansätze zu erforschen, sind gerechtfertigt, da Vorhofflimmern (AF), die häufigste Form von Arrhythmie, weltweit zunehmend vorherrscht und die derzeitigen Behandlungsmodalitäten sowohl in pharmakologischen Therapien als auch in der Herzablation bei etwa 40%-50% der Vorhofflimmern-Patienten unwirksam bleiben19 . Eine erfolgreiche Isolierung von adulten Maus-CMs ist der erste Schritt für zelluläre Studien. Es können zwei primäre Isolationsmethoden verwendet werden: die Chunk- und die Langendorff-Methode. Bei der Langendorff-Perfusionsmethode hängt die Gewebeverdauung von der Enzymlösung ab, die von den Koronararterien und deren Verzweigungen an die Kapillarbetten abgegeben wird. Eine richtige Aortenkanültiefe, die das Eindringen in die Aortenklappen und das Blockieren der Koronararterien ostia vermeiden kann, ist die Voraussetzung für ein solches Perfusionsmuster, das auch der wesentliche Schritt für eine effiziente Verdauung und eine ideale VM-Ausbeute ist. Daher ist es vernünftig anzunehmen, dass die Tiefe der Aortenkanüle in ähnlicher Weise die Perfusion des Vorhofgefäßes beeinflussen und schließlich die AM-Ausbeute beeinflussen kann. Um diese Hypothese zu testen, wurde eine Aortenkannulierung in verschiedenen Tiefen durchgeführt und die entsprechenden AM-Erträge verglichen. Die Daten zeigten, dass die Aortenkanültiefe direkt für die AM-Ausbeute relevant ist. Hierin wird ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von AMs und VMs eingeführt.
Protocol
Erwachsene männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 20-30 g und einem Alter von 8-10 Wochen wurden vom Animal Centre der Capital Medical University in Peking, China, gekauft. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Capital Medical University genehmigt und in Übereinstimmung mit dem vom Institute of Animal Resources vorgeschlagenen und von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Excel und Origin 8.5 wurden für die Datenerfassung und -analyse verwendet. Die Daten werden als Mittel ± SD dargestellt, für die statistische Auswertung wurde der Student's t-Test verwendet und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
1. Zubereitung von Lösungs- und Perfusionsapparaten
- Montieren Sie eine Langendorff-Apparatur mit konstantem Durchfluss (handelsüblich oder selbst hergestellt). Abbildung 1 zeigt ein einfaches Schema.
- Die Lösungen werden entsprechend den in Den Tabellen 1 und 2 angegebenen Reagenzien hergestellt.
- Schalten Sie das zirkulierende Wasserbad ein und stellen Sie eine geeignete Eingangstemperatur (42,7 °C in unserem Labor) ein, um sicherzustellen, dass der Abfluss des Perfusat-Kreislaufsystems aus der Kanüle 37 °C erreicht.
- Reinigen Sie das Perfusionssystem, indem Sie entionisiertes Wasser zirkulieren lassen. Wenn ein steriler Zustand erforderlich ist, lassen Sie 75% Ethanol 15 Minuten lang durch das Perfusionssystem laufen, gefolgt von deionisiertem Wasser (mindestens 10 Zyklen, um alkoholschädliche Auswirkungen auf das Herz zu vermeiden).
- Messen Sie die Zeit und das Volumen für einen Zyklus des Perfusat-Zirkulationssystems, um zu bestimmen, wie viele Milliliter sauerstoffhaltige Tyrode-Lösung im folgenden Perfusionsschritt geladen werden sollen.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge in der gewünschten Methode.
- Stellen Sie die Durchflussrate des Perfusat-Perfusionssystems auf 4 ml/min ein.
- Bereiten Sie zwei saubere 35-mm-Petrischalen vor - eine mit Tyrode-Lösung (Petrischale 1), die andere mit Lösung 1 (Petrischale 2).
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit Lösung 1 und einer stumpfen Stahlkanülennadel von 20 G gefüllt ist, mit einer Kerbe, von der aus der Abstand von 1 mm zur Spitze 1 mm beträgt. Bereiten Sie einen losen Knoten mit 3-0 Naht am Kanülenschaft vor. Regulieren Sie das Sichtfeld des Stereomikroskops und stellen Sie sicher, dass sich die Kanülenspitze unter der Flüssigkeitsoberfläche der Petrischale 2 befindet.
2. Tierpräparation
- Den Mäusen Heparin (Konzentration, 1.000 I.E./ml; 0,2 ml/Maus) intraperitoneal verabreichen, um Blutgerinnsel zu vermeiden. Nach 10 Minuten betäuben Sie die Mäuse mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg, I.P.-Injektion) und stellen Sicher, dass die Mäuse nicht mehr auf Schwanz/Zehen-Pinch reagieren. Führen Sie eine zervikale Luxation 20 Minuten nach der Verabreichung von Heparin durch.
- Übertragen Sie die Mäuse auf die chirurgische Plattform, fixieren Sie die Mäuse in Rückenlage, sterilisieren Sie die Brust mit 75% Ethanol und trocknen Sie sie mit Gaze oder Serviette.
3. Herzexzision und Aortenkanülulation
- Heben Sie die Haut des Xiphoids mit einer Gewebezange an und machen Sie mit einer Gewebeschere einen kleinen seitlichen Schnitt durch die Haut. Führen Sie eine stumpfe Dissektion zwischen Haut und Faszie durch und verlängern Sie den Schnitt der Haut in einer V-Form in Richtung der Achselhöhlen auf beiden Seiten.
- Setzen Sie die gleiche Inzisionsspur durch den Brustkorb fort und beugen Sie dann den Brustkorb nach oben, indem Sie das Brustbein mit einer Gewebezange einklemmen, um Herz und Lunge vollständig freizulegen.
- Ziehen Sie das Perikard mit einer gekrümmten Pinzette ab. Reißen Sie die Thymusdrüse zu beiden Seiten durch zwei gebogene Pinzetten, wenn sie die großen Gefäße bedeckt. Ziehen Sie die Basis des Herzens vorsichtig mit einer gekrümmten Pinzette in Richtung Schwanz, bis ein "Y" -förmiges Blutgefäß (die Aorta und ihre Astarterien) zu sehen ist.
- Um verschiedene Längen der Aorta für die Kanülierung und den Vergleich zu reservieren, transektieren Sie die Aorta an der linken gemeinsamen Halsschlagader (grüne Linie in Abbildung 2) und schneiden Sie bei einigen Mäusen gleichzeitig die Brachiocephalusarterie ab. Transekt an der aufsteigenden Aorta bei anderen Mäusen (schwarze Linie in Abbildung 2).
HINWEIS: Für diejenigen, die neu in diesem Verfahren sind, kann dieser Schritt auch unter einem stereoskopischen Mikroskop durchgeführt werden. - Schneiden Sie das Herz aus und tauchen Sie sofort in Petrischale 1 ein, um das restliche Blut zu waschen und abzupumpen.
- Übertragen Sie das Herz in die Petrischale 2 und schneiden Sie überschüssiges Gewebe bei Bedarf mit einer feinen Irisschere ab. Für diejenigen, die neu in diesem Verfahren sind, führen Sie diesen Schritt unter dem Stereomikroskop durch, um zu vermeiden, dass die Aorta oder andere Herzstrukturen fälschlicherweise geschnitten werden.
- Drücken Sie die Spritze, um Luftblasen vor der Aortenkanülierung auszustoßen. Führen Sie eine retrograde Aortenkanüle mit Hilfe von zwei geraden Bindezangen (glatte Kiefer) unter dem Stereomikroskop durch. Stellen Sie sicher, dass sich der gesamte Kanülierungsprozess unter der Flüssigkeitsoberfläche befindet.
- Vermeiden Sie das Eindringen in die Aortenklappen und passen Sie die Tiefen an die aufsteigende Aorta (die Maus, dass die Aorta an der linken gemeinsamen Halsschlagader durchtrennt wurde) bzw. die Aortenwurzel (die Maus, dass die Aorta an der aufsteigenden Aorta durchtrennt wurde) an.
HINWEIS: Die Tiefe der Aortenkanülierung (einfach als Tiefe bezeichnet) ist hier definiert als die Position, an der sich die Kanülenspitze in der Aorta befindet oder wo die Aorta ligatiert ist. - Ligat die Aorta mit der Vorknotennaht 3-0 an die Kanülenkerbe. Drücken Sie vorsichtig auf den Spritzeninhalt, um das Restblut zu spülen.
HINWEIS: Das Blut verlässt die Koronararterien und strahlt aus den Dorsalvenen aus, wenn die Tiefe richtig positioniert ist. Das Herz und die Vorhofanhänge werden sich ausdehnen und blass werden. - Entfernen Sie die Kanüle und verbinden Sie sie mit dem Langendorff-Gerät. Achten Sie noch einmal darauf, dass Luftblasen nicht in das Herz eindringen.
HINWEIS: Beachten Sie, dass die Zeit von der Thorakotomie bis zur anfänglichen Perfusion 5 Minuten nicht überschreiten sollte.
4. Herzdurchblutung
- Zuerst primieren und perfundieren Sie Tyrodes Lösung für ungefähr 10 s (das Flüssigkeitsvolumen, das 10 s in dem in diesem Protokoll verwendeten System läuft, beträgt ungefähr 0,7 ml), wenn sich Restblut in den Vorhöfen befindet, und wechseln Sie dann zu Lösung 1. Ziehen Sie jedoch einfach mit Lösung 1 durch, wenn sich kein Restblut in den Vorhöfen befindet. Das Herz ca. 2 min durchtränken.
- Wechseln Sie zu Lösung 3. Saugen Sie ca. 2,5 ml Lösung 3 mit einem sterilen Polyethylen-Einwegpipet und wärmen Sie es im Wasserbad für den späteren Gebrauch vor, wobei der Rest für die Perfusion für ca. 11-12 min verwendet wird. Verwerfen Sie Lösung 3 in den ersten 2 Min. Recyceln Sie den Rest mit der Peristaltikpumpe in die Perfusat-Reservoirs zur Wiederverwendung, bis die Vergärung abgeschlossen ist.
- Beenden Sie die Verdauung, wenn das Herz anschwillt und leicht blass und schlaff wird (schwammige Textur) oder ein Abdruck entsteht, wenn das Myokard mit einer Zahnzange sanft eingeklemmt wird.
5. Zellisolierung und Calcium-Wiedereinführung
- Entfernen Sie die Ventrikel und die Vorhöfe mit einer Pinzette und legen Sie sie in verschiedene Petrischalen. Die vorgewärmte Lösung 3 in die Petrischale geben.
- Triturieren Sie das Gewebe mit einer stumpfen Pinzette in eine trübe Textur und pipettieren Sie das Gewebe sanft für eine gleichmäßige Verdauung. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen.
- Übertragen Sie das trübe verdaute Gewebe mit der Pipette in Lösung 4, um die verbleibende Enzymaktivität zu stoppen, und zentrifugieren Sie dann für 20 s bei 192×g. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie Lösung 5 in das Zellsediment und pipettieren Sie, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
- Führen Sie Kalzium schrittweise wieder ein, um Kalziumparadoxon und Kalziumüberlastung zu vermeiden. Nach und nach insgesamt 50 μL 100 mM/L CaCl2 (alle 5 min Intervall von 5 μL, 10 μL, 15 μL bzw. 20 μL) in die Zellsuspension geben.
6. Zellspeicherung
- Für die Patch-Clamp-Studie lagern Sie die Zellen in Tyrodes Lösung. Für andere zelluläre Studien lagern Sie die Zellen in Lösung 6.
- Um die Genauigkeit der Ergebnisse akuter Funktioneller Studien (z. B. Ca2+- Funken, Ca2+- Wellen, Ca2+- Freisetzung, Ca2+- Leck und Patch-Clamp-Aufzeichnungen) zu gewährleisten, schließen Sie diese Art von Funktionsexperimenten innerhalb der nächsten 6 Stunden ab.
Representative Results
Dieses Papier, in dem die Kanülenspitze in der Aorta positioniert ist, die als Tiefe der Aortakanüle definiert ist (einfach als Tiefe bezeichnet), stellt auch dar, wo die Aorta ligatiert ist. Die AM und VM, die aus einem Herz isoliert wurden, das an der aufsteigenden Aorta kanüliert und ligatiert wurde, werden als AMAA bzw. VMAA dargestellt. Darüber hinaus werden AM und VM, die aus einem Herz isoliert wurden, das an der Aortenwurzel kanüliert und ligatiert wurde, als AMAR bzw. VMAR dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Übersicht der Aorta und der Transektionspositionen. Abbildung 3 zeigt auch die Tiefen und die Ligaturstellen, die den Aorta-Transektionspositionen entsprechen. Die Tiefe war mit der Perfusion der Vorhöfe und Vorhofanhänge verbunden. Beide Vorhofanhängsel sind aufgeblasen, wenn sich die Kanülenspitze an der aufsteigenden Aorta befindet, was auf eine ausreichende Vorhofperfusion hinweist. An der Aortenwurzel ist die Vorhofperfusion jedoch unzureichend und beide Vorhofanhängsel sind verwischt (Abbildung 4). Die CM-Morphologie und Lebensfähigkeit, die nach der Wiedereinführung von Kalzium in verschiedenen Tiefen aus den kanülierten Herzen isoliert werden (Abbildung 5). Die Zellmorphologien von AMAA, AMAR, VMAA und VMAR befinden sich vor und nach der Wiedereinführung von Kalzium unter dem konfokalen Mikroskop. AMs sind spindelförmig, während VMs stangenförmig mit rechteckigen Enden sind. Darüber hinaus haben AMs und VMs intakte Membranen, klare Konturen, klare gestreifte Sarkomere und glatte Oberflächen (Abbildung 6). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Trypanblaufärbung beurteilt. Normale Zellen mit intakten Membranen können Trypanblau ausschließen und werden nicht angefärbt, während die Zellverlustaktivität intrazellulär schnell Trypanblau ansammelt (Abbildung 7). AMs und VMs wurden in verschiedenen Objektfolien platziert, um die Zellenzählung durchzuführen. Die Gesamtausbeute von AM und der Prozentsatz lebensfähiger spindelförmiger CMs (Überlebensrate) wurden durch Übertragung von 10 μL der Zellsuspension auf einen Objektträger bestimmt und unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop bei 4 × 10 Sichtfeldern gezählt. Die gleiche Methode wurde verwendet, um die Gesamtausbeute von VMs (stabförmig) und den Prozentsatz der lebensfähigen VMs zu bestimmen. Diese Methode wird gegenüber der Verwendung eines Hämozytometers bevorzugt, da sich die CMs aufgrund ihrer Größe und Form nicht leicht in den Zählbereich des Hämozytometers verteilen konnten. Ein Balkendiagramm (Abbildung 8) zeigt die Überlebensraten von AMAA, AMAR, VMAA und VMAR vor und nach der Wiedereinführung von Kalzium. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SD von 10 Mäusen dar. Vor der Wiedereinführung von Kalzium sind die Überlebensraten von AMAA signifikant höher als die von AMAR (70,9% ± 2,8% bzw. 41,0% ± 5,2%; S . < 0,01). Nach der Wiedereinführung von Kalzium sind die Überlebensraten von AMAA signifikant höher als die von AMAR (69,4% ± 3,0% bzw. 37,7% ± 4,9%; S . < 0,01).
Die VMAA-Überlebensraten unterschieden sich nicht von denen der VMAR (89,5% ± 2,7% gegenüber 88,1% ± 2,6%; p > 0,05) vor der Wiedereinführung von Kalzium. In ähnlicher Weise unterschieden sich die VMAA-Überlebensraten nicht von denen der VMAR (82,2% ± 1,9% gegenüber 82,9% ± 1,6%; p > 0,05) nach der Wiedereinführung von Kalzium.
Ein Herz, das in der Tiefe kanüliert wird, wie es dieses Protokoll empfiehlt (an der aufsteigenden Aorta), eine lebensfähige VMs und AMs ergibt nach der Wiedereinführung von Kalzium etwa 4,1 Millionen bzw. etwa 180.000. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung des Natriumstroms (Abbildung 9A, B) und der Stromdichte (Abbildung 9C) in den isolierten AM und VM bestätigt, dass die Zellqualität die Anforderungen für elektrophysiologische Experimente erfüllt hat. Die Anatomie der Aorta (Abbildung 10) zeigt, dass das Ostium des Vorhofgefäßes in der Nähe der Aortenwurzel liegt und an das Ostium der Koronararterie (CA) angrenzt. Tabelle 3 zeigt den Abstand von der Kanülenspitze zum CA-Ostium der an der aufsteigenden Aorta bzw. der Aortenwurzel kanülierten und ligatierten Herzen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung eines montierten modifizierten Langendorff-Systems. Dieses System ist wirtschaftlich und für die Benutzer tragbar. Es besteht aus zwei Teilen Kunststoffschlauch - einer für das Wasser (Innendurchmesser, 8 mm) und einer für das Perfusat (Innendurchmesser, 1,5 mm) -, von denen das distale Ende mit einem PE-medizinischen Drei-Wege-Absperrhahn mit einem Luer-Schloss verbunden ist. Eine Wasser enthaltende Glasflasche mit einem Gummistopfen bildet sich als Wärmetauscher. Das Perfusat wird von der Peristaltikpumpe in den Kunststoffschlauch im Wärmetauscher gepumpt und kommt aus dem mit der Kanüle verbundenen Dreiwegehahn heraus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Aorta und Gewebe um. Eine "Y"-förmige Blutgefäßstruktur ist die Aorta und ihre Äste: die Arteria brachiocephalica (Pfeil 1) und die linke gemeinsame Halsschlagader (Pfeil 2). Transsektieren Sie die Aorta zwischen der linken gemeinsamen Halsschlagader (grüne Linie) und schneiden Sie gleichzeitig die Brachiozephalarterie bei einigen Mäusen; Transekt an der aufsteigenden Aorta (schwarze Linie) bei anderen Mäusen (Stereomikroskop 10 × 2 Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Frontalansicht des kanülierten Herzens. Die schwarze gekrümmte Linie stellt den Schneiderand der Aorta dar, die zwischen der linken gemeinsamen Halsschlagader durchschnitten wurde. Die rote gekrümmte Linie stellt den Schneiderand der Aorta dar, die an der aufsteigenden Aorta durchtrennt wird. Die gerade Linie stellt dar, wo die Aorta ligatiert war: schwarz an der aufsteigenden Aorta und rot an der Aortenwurzel (Stereomikroskop 10 × 2 Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Perfusionszustand der kanülierten Herzen. Die Vorhöfe sind ausreichend durchblutet, und beide Vorhofanhänge sind im Herzen aufgeblasen (A) kanüliert und an der aufsteigenden Aorta ligatiert. Beide Vorhofanhänge sind jedoch im Herzen (B) kanüliert und an der Aortenwurzel ligiert, was auf eine schlechte Vorhofperfusion hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Zellmorphologie und Lebensfähigkeitsbewertung nach Calcium-Wiedereinführung. AMs (A) und VMs (B), die aus dem an der aufsteigenden Aorta kanülierten und ligatierten Herzen isoliert sind, werden als AMAAs bzw. VMAAs dargestellt. AMs (C) und VMs (D), die aus dem an der Aortenwurzel kanülierten und ligierten Herzen isoliert sind, werden als AMARs bzw. VMARs dargestellt. Hochwertige CMs sind ruhig und haben intakte Membranen, klare Konturen, klare gestreifte Sarkomere und eine glatte Zelloberfläche. AMs sind spindelförmig, während VMs stangen- oder ziegelförmig mit rechteckigen Enden sind. CMs, die sich spontan zusammenziehen oder Bleche in der Membran enthalten, sind von schlechter Qualität, und diejenigen, die in eine kugelförmige Form schrumpfen, sind tote Zellen. Ein zufälliges Sichtfeld (Fluoreszenzmikroskop, 10 × 10 Vergrößerung; Maßstabsbalken, 100 μm). AM = Atrialmyozyten, VM = ventrikuläre Myozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Zellmorphologie unter einem konfokalen Mikroskop vor und nach der Calcium-Wiedereinführung. Vor der Calcium-Wiedereinführung sind AMAA (A) und AMAR (C) spindelförmig mit klaren Konturen, gestreiften Sarkomeren und glatten Membranoberflächen. Nach der Calcium-Wiedereinführung sind auch AMAA (B) und AMAR (D) spindelförmig mit klaren Konturen, gestreiften Sarkomeren und glatten Membranoberflächen. Vor der Calcium-Wiedereinführung sind VMAA (E) und VMAR (G) stab- oder ziegelförmig mit klaren Konturen, striaten Sarkomeren und glatten Membranoberflächen mit rechteckigen Enden. Nach der Calcium-Wiedereinführung sind VMAA (F) und VMAR (H) ebenfalls stab- oder ziegelförmig mit klaren Konturen, gestreiften Sarkomeren und glatten Membranoberflächen mit rechteckigen Enden (konfokales Mikroskopöl, 63 × 10 Vergrößerung; Mensurbalken, 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Bewertung der Zelllebensfähigkeit. Beschädigte Zellen, die an Aktivität verlieren, werden durch Trypanblau gefärbt. Im Gegensatz dazu können lebensfähige Zellen nicht mit Trypanblau (Fluoreszenzmikroskop, 4 × 10 Vergrößerung; Skalenbalken, 100 μm) gefärbt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8. Balkendiagramm mit den Überlebensraten von AMAA, AMAR, VMAA und VMAR vor und nach der Wiedereinführung von Kalzium. CR = Calcium-Wiedereinführung. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SD von 10 Mäusen dar. P < 0.01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Gehalt (Endkonzentration in mmol/L, falls nicht anders angegeben) | Verstanden |
| Perfusionslösung (Lösung 1) | 113 NaCl, 4,7 kCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurin, 5 Glucose, 10 2,3-Butanedionmonoxim(BDM) | Die 3 Tage bei 4 °C gelagert werden kann. Glukose, Taurin und BDM werden am Tag des Experiments hinzugefügt. Bereiten Sie 200 ml Perfusionslösung für jedes Herz vor. |
| Tyrodes Lösung (Lösung 2) | 140 NaCl, 4 kCl, 1 mgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glucose | Die 3 Tage bei 4 °C gelagert werden kann. CaCl2 und Glucose werden am Tag des Experiments hinzugefügt, stellen Sie den pH-Wert auf 7,3-7,4 mit gesättigtem NaOH bei Raumtemperatur (28-30 ° C) mit einem PH-Meter ein. |
Tabelle 1. Lösungen für die CM-Isolierung von Erwachsenenmäusen.
| Lösung | Inhalt | Verstanden |
| Verdauungslösung (Lösung 3) | 25 mL Lösung 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg Kollagenase II, 50μL (2,5 % 10×) Trypsin | für jedes Herz |
| Stopplösung 1(Lösung 4) | 9 ml Lösung 1,1 mL FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 | für jedes Herz |
| Stoppen Sie Lösung 2 (Lösung 5) | 9,5 mL Lösung 1, 0,5 mL FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 | für jedes Herz |
| Zell-Resuspensionslösung (Lösung 6) | 13 ml Lösung 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) in einer Dosis, die eine dünne Schicht bilden kann, die die Oberfläche der Flüssigkeit bedeckt | für jedes Herz |
Tabelle 2. Lösungen für die Isolierung und Lagerung von Mäusen für Erwachsene.
Abbildung 9. Strom-Spannungs-Kurven der Natriumkanäle. Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken wurden verwendet, um Natriumströme der isolierten Kardiomyozyten im Spannungsklemmenmodus aufzuzeichnen. Das Spannungsklemmenprotokoll ist im Einschub dargestellt. Natriumströme, die von am (A) und VM (B) aufgezeichnet wurden, werden angezeigt. Die Stromdichten bei Potentialen von −45mV, −40mV und −35 mV sind bei AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1,820 pA/pF bzw. −29,34 ± 1,939 pA/pF; n = 10) signifikant höher als in VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF bzw. −21,86 ± 1,381 pA/pF; n = 8; P < 0,05). (C) Die I-V-Kurven zeigen die Natriumstromdichten, die auf die Zellkapazität normiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10. Herkunft und Verbreitung des Vorhofgefäßes. Das Vorhofgefäß (Pfeil 1) und das CA (Pfeil 2) in Tafel A. Tafel B ist ein genauerer Blick auf das Vorhofgefäß (Pfeil 3). (C) Es gibt zwei verschieden große Ostia; eines (Pfeil 4) entspricht dem Vorhofgefäß, das die Vorhofanhängsel bewässert hat, und das andere (Pfeil 5) entspricht dem CA (Stereomikroskop 10 × 5 Vergrößerung). CA = Koronararterie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Die Seriennummer der Mäuse | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| Die Tiefe der Aortenkanüle liegt an der aufsteigenden Aorta | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| Die Tiefe der Aortenkanülierung befindet sich an der Aortenwurzel | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
Tabelle 3. Abstand von der Kanülenspitze zur Koronararterie Ostium. Die Herzen von C57BL/6-Mäusen (n = 20) wurden verwendet, um die Aorta in tiefen Tiefen der aufsteigenden Aorta bzw. der Aortenwurzel zu kanülieren und zu ligatieren. Die Aorta ist anatomisiert und der Abstand von der Kanülenspitze zum CA-Ostium wurde gemessen. Der Abstand wird in Millimetern gemessen, und positive oder negative Vorzeichen stellen die Kanülenspitze oberhalb bzw. unterhalb des CA-Ostiums dar.
Discussion
Ein einzelnes CM ist ein wertvolles und unverzichtbares Werkzeug bei Studien über Herzfunktionen und Herzerkrankungen auf zellulärer Ebene20. Daher ist die Isolierung lebensfähiger CMs von den Herzen der erste und wichtigste Schritt. Die Zellqualität ist eine der wesentlichen Determinanten für die Durchführung erfolgreicher Experimente, insbesondere bei optischen und elektrophysiologischen Experimenten. Im Vergleich zu den CMs anderer Tiere sind Nagetier-CMs aufgrund einer höheren Konzentration intrazellulärer Natriumionen anfälliger für Ischämie und Hypoxie, was den Kalziumeintrag durch den Na + / Ca2 + -Austauscher21 begünstigt. Darüber hinaus ist die Anzahl der AMs weitaus geringer als die der VMs. Daher ist eine erfolgreiche Isolation äußerst schwierig zu erreichen. Die Langendorff-Methode eignet sich hervorragend für die Isolierung von Mäusen VMs22, aber die Erfolgsrate bei der Isolierung von AMs ist gering, und es liegen nur wenige Berichte vor. Die richtige Tiefe der Aortenkanülierung ist neben Temperatur, Enzymaktivität, pH-Wert und Wasserqualität, die für die Puffervorbereitung verwendet werden, auch ein wesentlicher Faktor für die Erzielung idealer VMs. Das Prinzip der Langendorff-Methode beruht auf einer retrograden Durchblutung des Herzens. Bei der Perfusion ist die Aortenklappe geschlossen; Dadurch wird das Perfusat in die Koronararterien gepresst, wobei Enzymlösung durch die Gefäßäste abgegeben wird und das Myokardgewebe gleichmäßig verdaut wird. Um ein solches Zirkulationsmuster zu erreichen, muss die Aorta genügend Länge für Kanülierung und Ligatur reservieren, auch die Kanülenspitze darf nicht in die Aortenklappen eindringen oder das CA-Ostium blockieren. Daher ist es vernünftig zu spekulieren, dass die Tiefe der Aortenkanülierung auch mit der Vorhofperfusion verbunden ist, was die Verdauungswirksamkeit der Vorhöfe und die Ausbeuten von AM in ähnlicher Weise beeinflusst. Das hier vorgestellte Protokoll bestätigte die Hypothese, und entscheidende Schritte zur Optimierung der Zellausbeute zusammen mit den Vorschlägen sind unten aufgeführt.
In Schritt 1.9 wird zur besseren Sicherung der Aorta eine stumpfe 20 G Kanüle mit einer Kerbe (oder einer umlaufenden Nut) empfohlen, von der aus der Abstand 1 mm zur Spitze beträgt. Basierend auf unseren Erfahrungen wurde festgestellt, dass die Kanülengröße, die etwas größer ist als der Durchmesser der Aorta, verhindert, dass die Kanülenspitze die Aortenklappen während der Kanülierung durchsticht, da die Aorta aufgrund ihrer intrinsischen Elastizität eng in die Kanüle passen und Reibung erzeugen kann, die als Schutzfaktor wirkt, wenn sie sich vorwärts oder rückwärts bewegt und die Kanültiefe anpasst. In Bezug auf die Position der Kerbe rutscht das Herz während der Kanülierung aufgrund der Schwerkraft leicht ab, wenn es sich zu nahe an der Kanülenspitze befindet. Umgekehrt wird der Raum für die Einstellung der Kanültiefe und der Ligaturposition sehr begrenzt sein, wenn er zu weit ist. Unter diesen Umständen ist es in Schritt 3.3 besser, die Aorta zwischen der linken gemeinsamen Halsschlagader (wie die grüne Linie in Abbildung 2) zu transektieren, um sicherzustellen, dass die Aorta lang genug ist und an der aufsteigenden Aorta kanüliert und ligiert werden kann. Während an der aufsteigenden Aorta transektiert wird, könnte die für die Kanülierung reservierte Länge zumindest die Kanülenspitze in der Nähe der Aortenwurzel sichern und nach der Ligatur nicht in die Aortenklappen eindringen. Die Anatomie der Aorta und die Messung des Abstands von der Kanülenspitze zum CA-Ostium deuten darauf hin, dass die Transektion der Aorta zwischen der linken gemeinsamen Halsschlagader eine ideale Position ist, um eine richtige Aortenkanültiefe zu erreichen.
Es wurde festgestellt, dass die Kanültiefe mit der Perfusion der Vorhöfe zusammenhängt, die wiederum als Tiefenindikator fungiert. Abbildung 4 zeigt, dass die Vorhofperfusion gut ist, wenn die Tiefe an der aufsteigenden Aorta liegt und beide Vorhofanhänge aufgeblasen sind. Die Vorhofperfusion ist jedoch unzureichend, wenn die Tiefe an der Aortenwurzel liegt (oder sich ihr nähert) und beide Vorhofanhänge verwischt sind. Die Gesamt- und lebensfähige Anzahl von AM, die aus den aufgeblasenen Vorhofanhängseln ergab, war höher (Abbildung 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aortenkanültiefe die Perfusion und Verdauung der Vorhöfe und Vorhofanhänge in gewisser Weise beeinflussen und schließlich die AM-Ausbeute und -Qualität beeinflussen kann. Die Ausbeute und Qualität von AM wurden abgeleitet, um mit der Verteilung der Gefäße verbunden zu sein, die die Vorhöfe versorgen. Die Studie von Fernández et al.23 hat verschiedene Anomalien im Ursprung und Verlauf der Maus-CA gezeigt. Sie fanden heraus, dass die CAs Ostia sehr variabel waren und sich nicht alle im Aortensinus befanden. Einige CAs können anomal von oberhalb der Aortennebenhöhlen entstehen, die als Ostium mit hohem Start bezeichnet werden. Einige CAs können aus demselben Aortensinus stammen, und das Ostium des Atriumgefäßes befindet sich in unmittelbarer Nähe. Die Anatomie der Aorta in der vorliegenden Studie (Abbildung 10) stimmt ebenfalls mit dem Befund von Fernández überein. Dies kann die Ursache dafür sein, dass Versuche, AM nach der Langendorff-Methode zu isolieren, weitgehend erfolglos geblieben sind, wenn die Kanülierungstiefe nicht angemessen ist. Somit hat die Kanülenspitze eine größere Chance, das an das CA-Ostium angrenzende Atriumgefäß Ostium zu blockieren, wenn nicht genügend Platz zwischen der Kanülenspitze und dem CA-Ostium zur Verfügung steht. Dagegen waren die Perfusion und Zellausbeute des Ventrikels kaum betroffen, solange die Aortenklappen nicht von der Kanülenspitze durchdrungen wurden. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die CAs, die den Ventrikel mit Blut versorgen, größere Ostia und mehr Ursprünge haben. Wenn ein Ostium von der Kanüle verschlossen wurde, kann die Ventrikelperfusion durch eine andere CA oder den Kollateralkreislauf kompensiert werden, während das Blutgefäß, das den Vorhof versorgt, eher klein ist und keinen Ersatz hat. Daher ist der Einfluss der Tiefe in der Aortenkanüle wichtig.
Andere bemerkenswerte Faktoren und Fehlerbehebungen im Verdauungs- und Zellspeicherprozess sind wie folgt aufgeführt. Erwägen Sie zunächst, die oxygenierte Tyrode-Lösung in Schritt 4.1 zu perfundieren, um den Muskel zusammenzuziehen und Restblut abzupumpen, wenn das Blut in den Vorhöfen nach der Aortenligatur nicht herausgestürzt wurde. Dies kann dazu beitragen, die nachteiligen Auswirkungen von ca2 + und anderen Materialien, die aus den beschädigten Erythrozyten freigesetzt werden, zu vermeiden. Zweitens kann die frühzeitige Perfusion einer ca2+-freien Lösung, um die Verbindung zu dissoziieren und den Raum zwischen den Zellen zu erweitern, die Wirksamkeit der Enzymverdauung verbessern, da interkalierte Scheiben zwischen CMs Calcium-abhängige interzelluläre Verbindungen sind. Die Zeit sollte jedoch auf 3-5 min begrenzt werden, um das Phänomen des Kalziumparadoxons zu vermeiden24. Eine gemischte Enzymlösung wird empfohlen. Kollagenase Typ II stört das extrazelluläre Matrixnetzwerk, und Trypsin hilft, das körnige Material zu entfernen, das auf der Zelloberfläche verbleibt, wenn die Kollagenase-II-Verdauung unvollständig ist. Dies gewährleistet eine glatte Zelloberfläche, die für die Bildung einer GΩ-Dichtung in der Patchklemmenaufnahme entscheidend ist. Dennoch sollte die Trypsinkonzentration im richtigen Bereich kontrolliert werden, um eine Überverdauung und Zellverletzungen zu vermeiden, da sie das Membranprotein abbauen kann. Die alleinige Verwendung von Kollagenase Typ II zur Verbesserung der Zellausbeute kann häufig zu einer Überverdauung des Gewebes führen, und die isolierten CMs sind nach längerer Kollagenase-Exposition calciumintolerant25. Die Verwendung von 2,3-Butanedion-Monoxim (BDM), einer Substanz, die eine spontane Kontraktion verhindert, indem sie die Myosin-ATPase hemmt und die Bildung von Brücken verhindert, ist immer noch umstritten26,27,28,29. Nach bisherigen Erfahrungen ist das Hinzufügen von BDM für dieses Protokoll erforderlich. Enzymlösung wird mit Lösung 1 hergestellt, obwohl Lösung 1 kein Kalzium enthält, und Kalzium wird hinzugefügt, um das Enzym zu aktivieren. Der Vorteil der Zugabe von BDM in der Perfusionslösung umfasst (1) die Hemmung der Myozytenkontraktion und die Verringerung des Sauerstoffverbrauchs während der Enzymlösungsperfusion und (2) die Verhinderung der Hypoxie von Myozyten und die Verbesserung der Qualität der isolierten Myozyten. Einige Studien berichteten, dass BDM einen potenziell nachteiligen Einfluss auf zelluläre elektrische Eigenschaften haben kann. Die Ergebnisse der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung des Natriumstroms deuteten jedoch nicht auf eine unerwünschte Wirkung hin. Im Zellspeicherschritt (Schritt 6) haben sich zahlreiche Studien für den KB-Puffer entschieden, eine calciumfreie, aber kaliumreiche Lösung, in der Zellen einen besseren Zustand beibehalten können, weil sie sich in polarisierten und niedrigen Stoffwechselbedingungen befinden. Die Glykokalyx der Zellmembran trennt sich jedoch in Abwesenheit von exogenem Calcium für eine bestimmte Zeit von der Lipiddoppelschicht und die Membranpermeabilität nimmt zu, was sich auf die nachfolgende Funktionsanalyse auswirkt30,31,32.
Alle Myozyten-Isolationstechniken können derzeit im Wesentlichen entweder in die Chunk-Verdauung (ein kleines Stück Gewebe) in einer enzymatischen Lösung oder die CA-Perfusion mit enzymatischer Lösung (die Langendorff-Perfusion) eingeteilt werden22. Im Vergleich zur Langendorff-Methode ist die Chunk-Fermentationsmethode einfacher durchzuführen und wird in vielen Laboren auch routinemäßig zur Isolierung von CMs eingesetzt. Diese Methode erzeugt jedoch normalerweise eine geringe Ausbeute an CMs von schlechter Qualität aus adultem Gewebe22. Darüber hinaus sind Zellen, die nach diesem Verfahren isoliert wurden, möglicherweise nicht für die Durchführung von Vergleichsexperimenten geeignet. Wenn beispielsweise die zelltypspezifischen Arzneimittelwirkungen zwischen AM und VM getestet werden, können die Auswirkungen unterschiedlicher Isolationsbedingungen nicht vernachlässigt oder ausgeschlossen werden. Dies liegt daran, dass das Myokard und die Gewebedichte des Ventrikels viel dicker und dichter sind als die des Vorhofs, was zu unterschiedlichen Verdauungszeiten und Enzymkonzentrationen führt. Darüber hinaus wird übermäßiges Rühren und Pipettieren des Gewebes während der Verdauung die Zellen schädigen und funktionelle Studien erheblich beeinflussen. Darüber hinaus haben viele frühere Studien gezeigt, dass AMs anfälliger für Kalzium sind. AMs, die nach dem aktuellen Protokoll isoliert wurden, können jedoch tolerant gegenüber gradienten kalziumischer Wiedereinführung sein, wahrscheinlich weil das Gewebe am Ende des Verdauungsprozesses leicht zu reißen ist. Somit ist der mechanische Schaden geringer, während die Zellen mehr mechanische Schäden erleiden würden, da die Schritte der Chunk-Methode einen wiederholten Bruch und eine Zentrifugalisierung erfordern. In jüngerer Zeit berichteten Ackers et al.33 über eine vereinfachte, Langendorff-freie Methode zur Isolierung lebensfähiger Herzmyozyten und Nichtmyozyten. Die VMs und die Fibroblasten können effektiv isoliert werden, aber die Menge der AMs wurde nicht erwähnt. Dieses Protokoll hat jedoch mehrere Einschränkungen. Erstens kann die Verteilung der Herzblutgefäße Variationen für individuelle Unterschiede und Mäusebelastung aufweisen, und die empfohlene Kanülierungstiefe kann keine erfolgreiche AMs-Isolierung für jedes Mal garantieren. Zweitens, für diejenigen, die neu in diesem Verfahren sind, kann es eine gewisse Zeit dauern, Aortentransektion und retrograde Aortenkanülierung zu üben. Schließlich wurde diese Methode in anderen Herzkrankheitsmodellen außer an gesunden und älteren Mäusen nicht getestet. Daher erfordert es Anpassungen der Enzymkonzentrationen und der Verdauungszeit aufgrund des Fibroseausmaßes des Herzens. Der Nachteil unterschiedlicher Verdauungsbedingungen bei der Chunk-Methode wird bei der Langendorff-Methode, bei der die Enzymlösung gleichmäßig über die Gefäßbetten auf das Gewebe verteilt wird, kein Problem darstellen.
Zusammenfassend haben die hier beschriebenen Protokolle zur gleichzeitigen Isolierung einzelner AM und VM gezeigt, dass die richtige Aortenkanültiefe die Vorhofperfusion und die AM-Ausbeute effektiv verbessern kann. Die mit dieser Methode isolierten CMs sind von hoher Qualität, besitzen eine gute Calciumtoleranz und wurden erfolgreich auf patch clamp recording und calcium handling (Ca2+ release and Ca2+ wave measurement by the IonOptix system) im team34 angewendet. Es wird erwartet, dass das Isolationsprotokoll für die Zellvorbereitung in einer Reihe von zellulären und subzellulären Untersuchungen verwendet werden kann, die dazu beitragen werden, das Verständnis der Herzphysiologie und -pathologie zu vertiefen. Wichtig ist, dass es die Entdeckung klinisch relevanterer Herzkrankheitsmechanismen und Interventionsmethoden ermöglichen wird.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) und der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7192051) unterstützt. Autorenbeiträge: Bai und Liu entwarfen und konzipierten das Projekt. Wen und Ruan gaben wertvolle Ratschläge für die Experimente. Wu und Linling Li führten die experimentelle Arbeit durch und spielten Schlüsselrollen bei der Datenerfassung, -analyse und -interpretation. Li beteiligte sich an der Langendorff-Gerätemontage. Peng, Zhang, Wang und Yang beteiligten sich vor dem Experiment an der Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen. Wu schrieb den Artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
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