Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mikrotensiometer för konfokalmikroskopivisualisering av dynamiska gränssnitt

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Detta manuskript beskriver utformningen och driften av ett mikrotensiometer / konfokalmikroskop för att göra samtidiga mätningar av gränsspänning och ytutvidgningsreologi samtidigt som man visualiserar den interfaciala morfologin. Detta ger realtidskonstruktion av struktur-egenskapsrelationer mellan gränssnitt som är viktiga inom teknik och fysiologi.

Abstract

Adsorption av ytaktiva molekyler till vätske-vätskegränssnitt är allestädes närvarande i naturen. För att karakterisera dessa gränssnitt krävs mätning av ytaktiva adsorptionshastigheter, utvärdering av jämviktsytspänningar som en funktion av bulktens ytaktiva koncentration och relaterar hur ytspänningen förändras med förändringar i gränsområdet efter jämvikt. Samtidig visualisering av gränssnittet med hjälp av fluorescensavbildning med ett höghastighets konfokalmikroskop möjliggör direkt utvärdering av struktur-funktionsrelationer. I kapillärtrycksmikrotensiometern (CPM) fästs en halvklotformig luftbubbla i slutet av kapillären i en vätskebehållare med 1 ml volym. Kapillärtrycket över bubbelgränssnittet styrs via en kommersiell mikrofluidisk flödesregulator som möjliggör modellbaserad tryck-, bubbelkröknings- eller bubbelområdeskontroll baserat på Laplace-ekvationen. Jämfört med tidigare tekniker som Langmuir-tråget och hängdroppen förbättras mät- och kontrollprecisionen och svarstiden kraftigt; kapillärtrycksvariationer kan appliceras och kontrolleras i millisekunder. Det dynamiska svaret från bubbelgränssnittet visualiseras via en andra optisk lins när bubblan expanderar och drar ihop sig. Bubbelkonturen är anpassad till en cirkulär profil för att bestämma bubbelkrökningsradien, R, samt eventuella avvikelser från cirkularitet som skulle ogiltigförklara resultaten. Laplace-ekvationen används för att bestämma gränssnittets dynamiska ytspänning. Efter jämvikt kan små tryckoscillationer införas av den datorstyrda mikrofluidiska pumpen för att svänga bubbelradien (frekvenser på 0,001-100 cykler / min) för att bestämma dilatationsmodulen Systemets övergripande dimensioner är tillräckligt små för att mikrotensiometern passar under linsen på ett höghastighets konfokalmikroskop som gör att fluorescerande märkta kemiska arter kan spåras kvantitativt med submikron lateral upplösning.

Introduction

Luft-vattengränssnitt som omfattas av ytaktiva filmer är allestädes närvarande i det dagliga livet. Ytaktiva vatteninjektioner används för att förbättra oljeåtervinningen från utarmade fält och används som hydrauliska sprickbildningslösningar för skiffergas och skifferolja. Gas-flytande skum och flytande-flytande emulsioner är vanliga för många industriella och vetenskapliga processer som smörjmedel och rengöringsmedel och är vanliga i livsmedel. Ytaktiva ämnen och proteiner vid gränssnitt stabiliserar antikroppskonformationer under förpackning, lagring och administrering 1,2,3,4,5, tårfilmsstabilitet i ögat 6,7,8 och lungmekanik 9,10,11,12,13,14, 15.

Studien av ytaktiva medel eller ytaktiva ämnen som adsorberar till gränssnitt och deras egenskaper har en lång historia med många olika experimentella tekniker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En ny utveckling är kapillärtrycksmikrotensiometern (CPM), som möjliggör undersökning av gränssnittsegenskaper på mycket krökta gränssnitt, i mycket mindre längdskalor, samtidigt som man använder betydligt färre material än andra vanliga metoder 9,23,24,25. Konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) kan användas för att studera morfologin hos lipider och proteiner vid luft-vattengränssnitten i CPM22 eller på Langmuir-tråg 20,26,27,28,29. Här har en CPM och CFM kombinerats för att koppla morfologiska fenomen till dynamiska och jämviktsgränssnitt för att utveckla struktur-funktionssamband för biologiska och tekniska gränssnitt.

Det finns många parametrar av betydelse i gränssnittsaktiva ytaktiva system som är tillgängliga för CPM-CFM. I CPM fästs en luftbubbla med en diameter på 30-200 μm på spetsen av ett glaskapillärrör. I tidigare versioner av CPM styrdes kapillärtrycksskillnaden mellan bubblans insida och utsida via en vattenpelare och oscillerande sprutpump 9,30 ; den nya versionen som beskrivs här ersätter dessa med en datorstyrd mikrofluidisk pump med högre precision. Ytspänningen (γ) bestäms via Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ/R, från tryckfallet över gränssnittet som ställts in av pumpen, ΔP, och optisk analys av bubblans krökningsradie, R. Gränssnittets dynamiska ytspänning kan bestämmas med 10 ms tidsupplösning efter generering av en ny bubbla i kontakt med en bulkvätska som innehåller ett lösligt ytaktivt medel. Den ytaktiva adsorptionsdynamiken kan beskrivas med den klassiska Ward-Tordai-ekvationen10,31 för att bestämma väsentliga egenskaper hos det ytaktiva ämnet, inklusive diffusivitet, yttäckning och förhållandet mellan bulkkoncentration och jämviktsytspänning. När en jämviktsytspänning har uppnåtts kan gränsområdet svängas för att mäta dilatationsmodulen, Equation 1, genom att registrera förändringarna i ytspänningen, inducerade av små förändringar i bubbelytan, A32. För mer komplexa gränssnitt som utvecklar sina egna inre strukturer såsom intrasslade polymerer eller proteiner ersätts ytspänningen, , med en mer allmän ytspänning 4,33, Equation 2.

Lungstabilitet under andning kan vara direkt knuten till att upprätthålla både en låg ytspänning och en hög dilatationsmodul vid det alveolära luft-vätskegränssnittet 9,10. Alla inre lungytor är fodrade med en kontinuerlig, mikron tjock film av epitelfodervätska för att upprätthålla vävnadshydrering34. Denna epitelfodervätska är främst vatten, med salter och olika andra proteiner, enzymer, sockerarter och lungtensider. Som det är fallet för alla krökta vätske-ånggränssnitt induceras ett kapillärtryck med trycket högre på insidan av alveolus (eller bubblan). Men om ytspänningen var konstant överallt i lungorna visar Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ / R, att mindre alveoler skulle ha ett högre inre tryck i förhållande till större alveoler, vilket tvingade gasinnehållet i de mindre alveolerna att strömma till större alveoler med lägre tryck. Detta kallas "Laplace Instabilitet"9,35. Nettoresultatet är att de minsta alveolerna skulle kollapsa och fyllas med vätska och bli svåra att blåsa upp igen vilket får en del av lungan att kollapsa, och andra delar skulle överblåsa, som båda är typiska symtom på akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS). Men i en väl fungerande lunga förändras ytspänningen dynamiskt när gränssnittet mellan luft-epitelvätska i alveolusgränssnittet expanderar och drar ihop sig under andningen. Om Equation 3, eller Equation 4, minskar Laplace-trycket med minskande radie och ökar med ökande radie för att eliminera Laplace-instabiliteten och därigenom stabilisera lungan9. Därför , Equation 5och hur det beror på frekvens, monolagermorfologi och sammansättning och alveolär vätskekomposition kan vara avgörande för lungstabilitet. CPM-CFM har också tillhandahållit de första demonstrationerna av effekterna av gränsfallskurvatur på ytaktiv adsorption25, monolagermorfologi22 och dilatationsmodul9. Den lilla volymen (~ 1 ml) av behållaren i CPM möjliggör snabb introduktion, borttagning eller utbyte av vätskefasen och minimerar den erforderliga mängden dyra proteiner eller ytaktiva ämnen10.

Kontrast i en CPM-CFM-bild beror på fördelningen av små fraktioner av fluorescerande taggade lipider eller proteiner vid gränssnittet16,27. Tvådimensionella ytaktiva monolager uppvisar ofta lateral fasseparation som en funktion av ytspänning eller yttryck, Equation 6 π är skillnaden mellan ytspänningen hos ett rent vätske-vätskegränssnitt, γ0, och ett ytaktivt täckt gränssnitt, γ. π kan tänkas som 2-D "trycket" som orsakas av interaktionerna mellan ytaktiva molekyler vid gränssnittet som verkar för att sänka den rena vätskans ytspänning. Vid låga yttryck är lipidmonoskikt i ett vätskeliknande oorganiserat tillstånd; detta är känt som den vätskeutvidgade (LE) fasen. När yttrycket ökar och arean per lipidmolekyl minskar orienterar lipiderna med varandra och kan genomgå en första ordningens fasövergång till den långväga beställda vätskekondenserade (LC) fasen 16,20,27. LE- och LC-faserna kan samexistera vid olika yttryck och kan visualiseras när fluorescerande märkta lipider utesluts från LC-fasen och separeras till LE-fasen. Således är LE-fasen ljus och LC-fasen är mörk när den avbildas med CFM16.

Målet med detta manuskript är att beskriva de steg som krävs för att bygga och driva den kombinerade konfokala mikroskopmikrotensiometern. Detta gör det möjligt för läsaren att utföra adsorptionsstudier, mäta ytspänning, reologiskt beteende och undersöka gränssnittsmorfologi samtidigt på ett mikronskala luft / vatten eller olja / vatten gränssnitt. Detta inkluderar en diskussion om hur man drar, skär och hydrofoberar de nödvändiga kapillärerna, instruktioner för användning av tryck-, kröknings- och ytområdeskontrolllägen och gränssnittsöverföring av olösligt ytaktivt medel till det mikrotensiometerböjda gränssnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av kapillärrör

  1. Placera kapillären i en kapillärdragare och kör önskat dragprogram för att göra två avsmalnande kapillärer med en ytterdiameter (OD) på ~ 1 μm vid spetsen.
    OBS: Kapillärens OD innan du drar måste vara den OD som anges för att passa i kapillärhållaren i mikrotensiometercellen. Kapillärens innerdiameter (ID) kan variera, men kommer att påverka kapillärens kritiska radie efter dragning. Ett dragprogram väljs så att den resulterande avsmalningen initialt minskar kapillär OD och ID snabbt, når sedan en radie nära önskad kapillär OD och ID och sedan minskar i diameter långsammare. Detta kommer att skapa en större kapillärlängd som kan poängsättas för att ge en användbar kapillär på 30-100 μm i ID.
  2. Rikta kapillärspetsen på önskad plats för att få ett ID på 30-100 μm och bryt av spetsen. Kapillären kommer nu att ha en OD och ID med önskad radie vid spetsen (figur 1A). Kapillärerna kan lagras till steg 2.
    OBS: Kapillärens skäregg måste vara en 90 ° ren paus. Varje defekt i skäreggen kommer att leda till dålig fästning av bubblan till kapillären och dåliga ytegenskapsmätningar. Avsmalnande kapillärspetsar är mycket känsliga. De kommer att förstöras om de kommer i kontakt med något annat än lösningarna (t.ex. injektionsflaskans väggar, blåsmunstycke).

2. Hydrofobisering av kapillärer

  1. Samla dragna glaskapillärer, syrarengöringslösning, plastpincett, avjoniserat (DI) vatten, hydrofobiseringslösning (2% silan i etanol), vakuumpump och etanollösning. Se materialtabell för mer information.
    VARNING: Syrarengöringslösning är acutly giftig, orsakar hud- och ögonkorrosion / irritation, oxiderar. Hydrofobiseringslösning är irriterande för hud/öga/andningsvägar. Använd ögonskydd, labbrockar och handskar och arbeta med lösningar i en dragskåp.
  2. Syra-rengör kapillären
    OBS: Syrarengöring av kapillären tar bort eventuella organiska rester inuti kapillären och förbereder glasytan för silaniseringsreaktionen som gör kapillären hydrofob.
    1. Ta en kapillär ordentligt nära dess breda ände med pincetten.
    2. Doppa den avsmalnande spetsen i syrarengöringslösningen medan du fäster slangen från vakuumpumpen i den breda änden av kapillären. Detta kommer att suga lösningen in i kapillären.
      OBS: En pipettspets kan fästas i slutet av kapillärslangen för att möjliggöra en bättre passform med kapilläränden.
    3. Sluta när syrarengöringslösningen har fyllt ungefär hälften av kapillären.
      OBS: Efter avlägsnande av kapillärspetsen från syrarengöringslösningen bildar lösningen på utsidan av kapillären ofta en pärla nära kapillärspetsen. Rör försiktigt kapillären mot halsen på injektionsflaskan för att ta bort överflödig lösning.
    4. Låt syrarengöringslösningen förbli i kapillärerna i minst 30 minuter, se till att vätskans plugg förblir i den avsmalnande änden av kapillären.
    5. Ta bort syrarengöringslösningen från kapillären genom att hålla kapillären ordentligt med pincetten och använda vakuumslangen för att dra ut vätskan från kapillärens stora ände.
  3. Skölj kapillären
    1. Sänk ner den avsmalnande änden av kapillären i DI-vatten så att den är nedsänkt tillräckligt djupt för att täcka alla yttre som var nedsänkta i syrarengöringslösningen. Medan spetsen är nedsänkt, använd vakuumslangen för att dra DI-vatten genom kapillären. Ta bort kapillären från vattnet och ta bort det återstående vattnet med vakuumslangen.
    2. Upprepa ovanstående steg minst 4x.
  4. Utför steg 2.3 igen och ersätt etanol med DI-vatten.
  5. Applicera sug kontinuerligt tills etanolen helt avdunstar från kapillärens inre. Kapillären blir grumlig och sval att röra vid när etanolen börjar avdunsta men kommer att rensas efter 30 till 45 s.
  6. Täck kapillären med hydrofobiseringslösningen
    1. Doppa kort den breda änden av kapillären i ~ 2% silan i etanollösning. Kapillärverkan kommer att få beläggningslösningen att stiga i kapillären. Ta bort kapillären från lösningen när en plugg på ~ 1 cm har stigit i kapillären.
    2. Orientera kapillären så att den avsmalnande spetsen vetter nedåt, så att beläggningslösningen kan falla med tyngdkraften mot den avsmalnande spetsen.
    3. Låt beläggningslösningen ligga kvar i kapillären i minst 3 minuter.
      OBS: Det får inte finnas några luftbubblor i pluggen på beläggningslösningen som är i kontakt med insidan av den avsmalnande spetsen. Om det finns en luftbubbla, var kapillärinteriören sannolikt inte tillräckligt torkad i steg 2.5. För att åtgärda detta, upprepa steg 2.4-2.6 efter behov.
  7. Skölj kapillärerna med etanol 1x på samma sätt som steg 2.3.
  8. Ställ in den hydrofoba beläggningen på kapillären
    1. Placera rena och torra scintillationsflaskor i en vakuumugn inställd på 120 °C. Placera belagda kapillärer i injektionsflaskorna (helst en kapillär per injektionsflaska) med breda ändar vilande på injektionsflaskans botten. Låt kapillärerna förbli i ugnen i minst 6 timmar (över natten föredras) för att uppnå permanent bindning av det hydrofoba silanskiktet till kapillärerna. Kapillärerna kan lagras till steg 4.

3. Provberedning och lagring

  1. Blanda och förvara ytaktiva ämnen och fluoroforlösningar i rena syratvättade injektionsflaskor för att undvika kontaminering.
    OBS: Kommersiellt tillgängliga lipider måste vara av högsta renhet och förvaras mellan användning vid - 20 °C. Gamla eller förorenade lipider gör ofta att resultaten är svåra att reproducera.

4. Ställa in mikrotensiometern

  1. Sätt ihop CPM-cellen enligt beskrivningen i figur 2.
    1. Placera den stora sidan av kapillären i toppen av CPM-cellen tills den skjuter igenom till undersidan av cellen.
    2. Dra försiktigt åt PEEK-kontakten för att säkra kapillären och fäst sedan röret från mikrofluidpumpen på den stora sidan av kapillären. Var försiktig så att du inte rör vid den avsmalnande kapillärspetsen.
  2. Vid behov, fäst reservoarbytes- och/eller temperaturregleringsslangarna på respektive inlopp och utlopp på CPM-cellen (figur 2). annars ansluter du de oanvända inloppen och uttagen.
  3. Fäst CPM-cellen i konfokalmikroskopsteget och justera den grovt mot CFM-målet, CPM-kameran och CPM-ljuskällan (figur 3).
  4. Öppna gasflödet till mikrofluidpumpen vid pumpens rekommenderade arbetstryck (150 mbar för den mikrofluidiska pumpen som används här) och se till att flödet till kapillären är öppet.
  5. Börja köra det virtuella CPM-gränssnittet (Kompletterande kodningsfil 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) i tryckkontrollläge med kapillärtrycksoscillationsfrekvensen och amplituden inställd på noll (figur 4-7). Bild 4 visar en skärmdump av det virtuella gränssnittet. För DI-vatten och en kapillärradie på ~ 35 μm säkerställer ett tryck på ~ 20 mbar att inget vatten kommer in i kapillären.
  6. Fyll CPM-cellen med vatten med en pipett.
  7. Fokusera på kapillärspetsen med hjälp av mikrotensiometerkameran.
  8. Fokusera på kapillärspetsen med CFM. Om det är svårt att hitta kapillären, använd CPM-kameran för att hitta CFM-målet. Detta hjälper till att approximera avståndet mellan CFM-målet och bubblan och uppnå rätt arbetsavstånd.
  9. När ringformen (grön sektorprojektion) är centrerad på bubblan, justera fokus manuellt så att bubbelkanten kan ses tydligt (figur 4-3).
    OBS: Ringens position, start- och slutvinkel och inre och yttre radier kan justeras via menyn under visningsfönstret.
  10. Klicka på Återställ bubbla och se till att en ny bubbla bildas (man kommer att kunna höra den gamla bubblan dyka upp, och den nya bubblan kommer att kunna observeras från kontrollpanelens visningsfönster; Figur 4-3). Om bubblan inte dyker upp ökar du återställningstrycket eller ökar återställningsfördröjningstiden på fliken Bubbelåterställning under visningsfönstret. Kontrollera om ytspänningen är cirka 73 mN/m (för saltlösning eller vatten/luftbubblor) (figur 4-9).
  11. Ta ut vattnet via direkt-till-cell-sprutan (figur 3-13), töm det och sätt tillbaka det. Exemplet är klart för inläsning för att köra experimentet.

5. Adsorptionsstudie

  1. Fyll cellen med önskat prov med en autoklaverad pipett som håller CPM-programvaran i tryckkontrollläge . Se till att den initiala ytspänningen är cirka 73 mN/m när ett nytt bubbelgränssnitt skapas.
  2. Bestäm radien för den nybildade bubblan och mata in det värdet i mittlinjeområdets kontroll (figur 4-7) och ändra kontrolltypen till områdeskontroll genom att klicka på fliken Områdeskontroll (figur 4-8).
    OBS: Konstant tryckreglering kan också användas, men detta gör att bubbelradien ändras kontinuerligt när gränssnittets ytspänning ändras. Detta förändringsområde kan komplicera analysen av ytaktiva adsorptionshastigheter och få bubblan att dyka upp under studien.
  3. Börja spela in konfokalvideon.
  4. Klicka på Återställ bubbla (figur 4-5) och klicka omedelbart på Samla in data (figur 4-6). Signallampan på knappen blir grön.
  5. Justera dataregistreringshastigheten enligt provets koncentration genom att skjuta fältet som visas i figur 4-6. För långsammare adsorptioner, använd en långsammare inspelningshastighet. Detta kan justeras mitt i en körning om en högre inspelningshastighet önskas tidigt, men en långsammare hastighet är att föredra för långa studier för att minska filstorleken.
  6. Efter experimentets slut (när en slutlig ytspänningsplatå har uppnåtts) sparar du filen genom att välja rätt filsökväg (figur 4-1) och klicka på Spara-knappen (figur 4-2).
  7. Stoppa och spara inspelningen på CFM också.

6. Oscillation/avslappningsstudie

  1. Fyll cellen med provet med en autoklaverad pipett som håller CPM-programvaran i tryckkontrollläge . Se till att ytspänningen är cirka 73 mN/m när ett nytt bubbelgränssnitt skapas.
  2. Vänta tills provet är helt adsorberat till gränssnittet. Detta kan utföras direkt efter en adsorptionsstudie istället för att börja om med ett nytt bubbelgränssnitt.
  3. Bestäm om oscillation ska vara en tryckoscillation, areaoscillation eller krökningsoscillation genom att välja lämplig flik (figur 4-8) och ange önskat baslinjevärde, svängningsprocent och svängningsfrekvens (figur 4-7).
    OBS: Sågtands-, fyrkantiga och triangulära vågområdesoscillationer är också tillgängliga från rullgardinsmenyn på fliken Annat område oscillation .
  4. Starta inspelningen av konfokalvideon och klicka på Samla in data (figur 4-6) på CPM-programvaran.
  5. Starta svängningen. Var noga med att spela in minst sju cykler för bästa resultat. Välj en datainsamlingshastighet (figur 4-6) för att ge ett tillräckligt antal datapunkter för varje svängningscykel.
  6. Om andra oscillationsamplituder eller frekvenser önskas, ändra värdena under experimentet.
  7. Spara resultaten som i steg 5.6 och 5.7.

7. Utbyte av lösningsmedel

  1. Fyll cellen med provet med en autoklaverad pipett som håller CPM-programvaran i tryckkontrollläge. Se till att ytspänningen är cirka 73 mN/m när ett nytt bubbelgränssnitt skapas.
    OBS: Adsorptions- och/eller svängningsstudier kan utföras före lösningsmedelsutbytesstudien.
  2. Anslut inloppsröret med flaskan med önskad utbyteslösning (figur 3-11) till den peristaltiska pumpen (figur 3-10).
  3. Starta inspelningen av videon i konfokal programvara och klicka på Samla in data (figur 4-6) på CPM-programvaran.
  4. Ställ in den peristaltiska pumphastigheten. Detta kommer att styra vätskeutbyteshastigheten och måste väljas utifrån kraven för experimentet, dvs hur snabbt lösningsmedlet behöver bytas ut.
  5. Om flera vätskor behöver bytas ut, stoppa den peristaltiska pumpen och anslut inloppet till en annan utbyteslösning.
  6. När utbytet är klart (~20 min) sparar du resultaten som i steg 5.6 och 5.7.

8. Olöslig adsorption av ytaktivt medel

OBS: Om det ytaktiva ämnet som ska adsorberas inte är lösligt i reservoarvätskan kan denna metod användas för att överföra ett monolager från cellens luft/vatten-gränssnitt till bubbelytan. Många dubbelskiktsbildande lipider är nästan olösliga i saltlösning och absorberar inte spontant till bubblan när de suspenderas i reservoarlösningen.

  1. Fyll cellen med provet med en autoklaverad pipett som håller CPM-programvaran i tryckkontrollläge . Se till att ytspänningen är cirka 73 mN/m när ett nytt bubbelgränssnitt skapas.
  2. Deponera ett monolager av olösligt ytaktivt medel på cellens luft-vattengränssnitt från en lösning i en flyktig organisk lösning. Använd en spruta, sätt av små droppar vid gränssnittet och låt lösningsmedlet avdunsta och lämna lipiden bakom sig som en tunn film.
    VARNING: Kloroform används som lösningsmedel för fosfolipider såsom fosfatidylkoliner och fettsyror. Spridningslösningar är vanligtvis 0,01-0,02 mg lipid per ml av lösningsmedlet. Kloroform är akut giftigt, kan orsaka hud- och ögonirritation och är cancerframkallande. Använd lämpligt ögonskydd, labbrock och handskar och gör lösningen i en dragskåp.
  3. Minska ytan via mittlinjetryckkontrollen (figur 4-7) i bubblan tills den är nästan plan. Detta förhindrar att bubblan poppar efter att ytaktivt medel har adsorberats.
  4. Ta bort reservoarvätskan från cellen via direkt-till-cell-sprutan tills luft/ vattengränssnittet rör sig förbi kapillärspetsen. Medan en sprutpump kan användas kan detta steg uppnås genom att manuellt använda sprutan.
  5. Öka behållarens vätskehöjd till sin ursprungliga nivå.
    OBS: Efter att spetsen har nedsänkts igen blir bubblan större på grund av det ytaktiva ämnet som nu adsorberas på gränssnittet. Monolagret kommer nu att vara redo för svängnings- eller lösningsmedelsutbytesexperiment.

9. Städa upp

  1. Stäng av CFM.
  2. Byt till tryckkontrollläget .
  3. Ta bort provet från cellen med en pipett. Ladda cellen med DI-vatten och vrid upp trycket till ~ 50 mbar för att orsaka att bubblor ständigt släpper ut kapillären och rengör kapillärspetsen. Upprepa denna process 2x.
  4. Stäng säkerhetsventilen och stäng av CPM genom att klicka på den röda knappen i det övre vänstra hörnet, stäng av ljus- och blåtryckskontrollpanelen och stäng av tryckkällan.
  5. Ta bort cellen från konfokalmikroskopsteget. Skölj ut cellen med etanol och DI-vatten. Ta bort kapillärröret från CPM-cellen.

10. Rengöring av cellen

  1. Demontera cellen. Borsta innerväggen med en tandborste medan du sköljer under DI-vatten. Sänk ner delarna i etanol och sonikera den i ~ 30 min.
  2. Skölj alla delar med DI-vatten några gånger. Torka delarna genom att antingen blåsa dem med kvävgas eller torka dem i en vakuumugn.

11. Oscillationsanalys

  1. Kör Dilatational_Rheology_Analysis.m-koden (Supplemental Coding File 2) och välj önskad fil som sparats från det virtuella CPM-gränssnittet. Exempeldata ingår i tilläggsfilerna.
  2. Diagrammet tryck kontra tid visas som i kompletterande figur 1. Vänsterklicka på den punkt där svängningen börjar och vänsterklicka igen där svängningen slutar. Om data innehåller flera svängningar upprepar du den här processen för alla svängningar.
    1. När alla start- och slutpunkter har vänsterklickats högerklickar du med musen var som helst. Till exempel, som visas i kompletterande figur 1, kan man vänsterklicka på punkterna 1, 2, 3 och 4, följt av ett högerklick.
      OBS: Koden kommer att beräkna dilatationsmodulen och fasvinkeln och resultaten kommer att skrivas till en ny .csv fil på den ursprungliga filplatsen. Resultaten för exempeldata kan ses i kodresultaten som anges i den kompletterande kodningsfilen 2. MATLAB kommer också att generera flera grafiska representationer av data som visas i kompletterande figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En viktig källa till mätfel uppstår från kapillärerna som har defekter antingen från skärprocessen (figur 5A,B) eller beläggningsprocessen (figur 5D). Båda typerna av defekter leder till fel vid bestämning av bubbelform och storlek av det optiska bildanalyssystemet, vilket leder till felaktiga ytspänningsvärden. Det är viktigt att noggrant undersöka varje ny kapillär efter att den har dragits och belagts under det optiska mikroskopet innan kapillären sätts in i CPM. En felskuren kapillär måste kasseras, men en dåligt belagd kapillär kan syrarengöras och beläggas om för att förbättra bubbelstiftningen i slutet av kapillären (steg 2 i protokollet). Kapillärer fungerar bäst om ändskärningen är helt vinkelrät mot kapillären (figur 5C) och bubbelstiften direkt i slutet av kapillären (figur 5E). Den hydrofoba beläggningen på kapillären blir mindre effektiv vid pinning med användning, vilket kräver att kapillären rengörs och beläggs om.

Representativa data för adsorption av tensider jämfört med tid presenteras i figur 6. Tidigare experimentella tekniker såsom ett hänge eller sessila droppar som används för att mäta ytaktiv adsorption hade ingen mekanism för att dynamiskt justera kapillärtrycket eftersom förändringen i ytspänningen får bubbelområdet att förändras under adsorption 30,36,37. Faktum är att för större bubblor och droppar krävs förändringar i bubblans eller droppformen (och därmed ytan) för att bestämma ytspänningen från analysen av gränssnittsformen eftersom kapillärtrycket inte mäts oberoende och kapillärtrycket varierar över dropp- eller bubbelytan37. Detta komplicerar också analysen av adsorptionen eftersom när ytaktivt medel adsorberar till gränssnittet minskar ytspänningen, och för att uppfylla Laplace-ekvationen måste bubblans ytarea öka, vilket kräver ytterligare ytaktivt medel för att adsorbera för att nå jämvikt. I CPM kräver ett fast kapillärtryck att den initiala bubbelradien måste ligga inom ett litet intervall före ytaktiv adsorption för att förhindra att bubblan matas ut från kapillären om ytspänningen minskar för mycket. Ytaktiv adsorptionsdynamik modelleras ofta av den klassiska Ward-Tordai-ekvationen31, som beskriver adsorptionen av ytaktiva molekyler till ett rent gränssnitt med konstant gränssnitt med konstant gränssnitt. Medan Ward-Tordai-ekvationen kan modifieras för att ta hänsyn till den förändrade ytan, introducerar detta ytterligare parametrar och komplicerar analysenkraftigt 38,39.

För att övervinna dessa problem utvecklades en modellbaserad återkopplingsslinga med hjälp av Laplace-ekvationen som håller bubblans krökning (och ytarea) konstant under hela adsorptionsprocessen genom att dynamiskt justera kapillärtrycket. Det finns signifikanta skillnader i förändringshastigheten för ytspänningen eftersom bubblans yta inte ständigt ökar. Förändringarna i bubbelområdet under adsorptionen är inte konstanta med tiden eftersom ytspänningen först förändras långsamt och sedan snabbt accelererar före jämvikt. En ytterligare komplikation är att bråkförändringen i området beror på den initiala bubbelradien. En ytterligare fördel med konstant bubbelradie är att avbildning av gränssnittet förenklas eftersom bubbelytan förblir fixerad, vilket förenklar fokuseringen av CFM. Under adsorptionsprocessen, när ytaktivt medel adsorberar till gränssnittet (Video 1), ökar den fluorescerande signalen från gränssnittet. Om det ytaktiva ämnet bildar ytdomäner kan dessa domäner observeras bildas och växa22.

Förändringarna i ytspänning under områdesoscillationer visas i figur 7. I tidigare versioner av CPM gjordes svängningar i bubbelkapillärtrycket; att generera en sinusvåg i kapillärtryck översätts dock inte direkt till en sinusvåg i ytan eftersom de två är relaterade via Laplace-ekvationen. Genom att dra nytta av en modellbaserad återkopplingsslinga med Laplace-ekvationen skapas svängningar i området snarare än i kapillärtryck, vilket leder till data som är lättare att analysera och samla in över ett större antal amplituder. Som ett resultat kan ytspännings- kontra areadata som samlats in från denna metod användas för att direkt beräkna den interfaciala dilatationsmodulen för det ytaktiva skiktet: Equation 7 (Figur 8), där Equation 8 är systemets totala spänning och τ-spänningär icke-isotrop deviatorisk spänning som ofta saknas i enkla ytaktiva lösningar 4,33. Således, för ett enkelt ytaktivt system, Equation 9. För gränssnitt där elastiska nätverk kan bildas, såsom ytaktiva proteiner, är extra spänningar ofta närvarande och måste därför beaktas när man definierar dilatationsmodulen. Video 2 visar en CFM-video av rörelsen av svarta LC-domäner i en kontinuerlig färgad LE-fasmatris i fosfolipidmonolager. De distinkta LC-domänerna på gränssnittet omorganiseras till ett förgreningsnätverk som täcker gränssnittet när svängningar äger rum på den böjda bubblan22,40. Fliken Andra områdesoscillationer kan användas för att skapa sågtands-, fyrkantiga och triangulära vågor som visas i kompletterande figur 3 och fliken Komprimering möjliggör komprimering och expansion med konstant hastighet.

För lösningsmedelsutbytesstudier tillåts ett ytaktivt medel först att adsorbera till gränssnittet, och sedan byts reservoarvätskan ut så att en andra ytaktiv art kan komma i kontakt med det gränssnittet. Det är möjligt att undersöka förändringen i ytspänningen eftersom det andra ytaktiva ämnet konkurrerar med det ursprungliga ytaktiva ämnet vid gränssnittet. Ytdilatationsmodulen är ofta en känsligare sond av ytaktivt utbyte tillsammans med ytmorfologin via CFM. Figur 9 visar förändringen i ytspänning, ytvidgningsmodul och ytmorfologi när ett sådant lösningsmedelsutbyte äger rum. Medan specifikationerna för ett sådant utbyte kan variera, kan en förändring av någon av de tre egenskaperna indikera integration av den andra komponenten i monolagret eller solvation av den primära komponenten i bulk. En andra fluorescerande tagg kan fästas på den sekundära arten för att observera dess interaktion med gränssnittet från CFM-bilderna.

Figure 1
Bild 1: Kapillärbehandling (A) Bild som visar kapillärens poängsättning. Glaslisterkeran hålls i en klämma för att hålla den stadig. (B) Syrarengöring av kapillären. Syrarengöringslösningen dras in i kapillären med vakuumpumpen. (C) Hydrofobisering av kapillären. Silanlösningsplugg som hålls inuti kapillären Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
(1) Stor aluminiumcellhållare, (2) Fluorelastomerpackning (totalt fyra), (3) glasskiva (två totalt), (4) PEEK-cell och (5) liten aluminiumcellhållare. Vid montering placeras en fluorelastomerpackning på vardera sidan av varje glasglas. Cellen hålls ihop med skruvar och bultar. Den inzoomade bilden av PEEK-cellen visar platserna för de olika portarna: (6) kapillärport, (7) lösningsmedelsbytesinlopp, (8) lösningsmedelsutbytesutlopp och (9,10) temperaturkontrollmantelinlopp och utlopp. En PEEK-kontakt kan användas för att fästa slangen eller kapillären i cellen. Portar som inte används kan stängas helt av pluggar utan kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Schematisk över CPM/CFM, inte för att skala. (1) CPM-cellen, (2) kapillärröret med en bubbla i spetsen, (3) konfokalmikroskopmål, (4) mikroskopkameramål med filter, (5) CPM-ljuskälla, (6) mikrofluidisk pump, (7) säkerhetsventil, (8) vätskebytesinlopp, (9) vätskeutbytesutlopp, (10) peristaltisk pump, (11) utbytesvätskebehållare, (12) vätskeutbytesavfall, (13) direkt till cellspruta, (14) inlopp och utlopp för temperaturkontrollmantel och (15) temperaturkontrollerad behållare och pump. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: CPM virtuellt gränssnitt. (1) filvägen där data kommer att sparas; (2) systemparametrar, kommentarer och Spara-knappen. Alla fält i detta område sparas i den slutliga datafilen; (3) CPM-kamerabilden; (4) inställningar som styr bildanalysen, ringformig mätning, bubbelåterställning och bildrutor per sekund spårning; (5) Bubbelåterställning knapp; (6) knappen Samla in data, dataregistreringshastighetskontroll och datainsamlingsindikatorer; (7) kontroller för alla mittlinjevärden för driftläge, svängningsamplitud och svängningsfrekvens; (8) driftlägesomkopplare: om du klickar på varje flik ändras till det kontrollläget. Varje läge visar trycksignalen som skickas till pumpen i grafen "Trycksignal" samt några ytterligare kontroller; 9) Spänningsdata för markytan i realtid. (10) spänningsförande tryckdata; 11) Spänningsdatas spänningsradie. 12) Uppgifter om levande yta. och (13) levande ytspännings- och ytområdesdata, som kan användas för att grovt bestämma fasvinkeln under en svängningsstudie. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kapillärdefekter. (C) korrekt skuren kapillär, (D) kapillär med dålig stiftning på grund av dålig eller försämrad beläggning och (E) korrekt fäst kapillär. De röda pilarna i D och E visar var bubblorna är fästa. För bästa resultat kommer bubblan att stifta vid kapillärspetsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Adsorptionsstudiens mikrotensiometerresultat för både adsorptioner med konstant tryck (orange) och konstant area (blå). Bubbelytan för den konstanta areaadsorptionen ökar signifikant under hela studien och gör att adsorptionen tar längre tid att nå samma ytspänning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Typisk ytområdeskontrolloscillation. Ytområdesdata är en sinusoid medan tryck- och krökningsdata inte är det, vilket framgår av att mittlinjevärdena inte är vid oscillationens mittpunkt. Det matematiska förhållandet mellan de tre värdena betyder att endast en kan vara en sann sinusoid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Exempel på reologiska resultat efter analys. Dilatationsmodul av Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxi-sn-glycero-3-fosfokolin) som en funktion av frekvens för att öka koncentrationerna av Lyso PC för ~ 45 μm radiebubblor. Koncentrationer >0,1 mM av Lyso PC som åtföljer inflammation minskar dilatationsmodulen över intervallet för normal ventilation / andningshastigheter (gul) för att göra 2ε−γ < 0, vilket är delningsvärdet för att inducera Laplace-instabiliteten (prickad röd linje). Låga koncentrationer av Lyso PC ≤0.01 mM, som kan uppstå i normala lungor inducerar inte instabilitet. Vid frekvenser > 10 rad/sek ligger alla Lyso PC-koncentrationer över korsningen och skulle inte vara mottagliga för Laplace-instabiliteten. Heldragna röda linjer är teoripassningar till data. Figur som återges från referens9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: CFM- och CPM-resultat för en lösningsmedelsutbytesstudie för lungtensid utbytt mot DI-vatten och sedan Lyso PC. Grafen är uppdelad i fyra regioner: när lungtensider adsorberas till gränssnittet (blått), när LS byts ut med DI-vatten (grönt), när utbyteslösningen byts till en Lyso PC-lösning (röd) och när cellen fylls med Lyso PC-lösningen (orange). Egenskaperna kan ses förändras under de olika börserna vilket indikerar att gränssnittet förändras. (B) visar en konfokal bild av lungtensider som adsorberats till gränssnittet före utbyte och (C) visar samma yta efter att utbytet med Lyso PC-lösningen är klart. I båda fallen indikerar den vita streckade cirkeln kapillärens inre kant. Strukturen hos domänerna på monolagret förändras drastiskt efter lösningsmedelsutbytet, vilket bekräftar CPM-resultaten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: Konfokal video av adsorptionsstudie med konstant tryck för lungtensid. Den falska färgen visar avståndet i z-riktningen med färgfältet på vänster sida av videon, med lila som indikerar bubblan nära kapillären och grön är toppen av bubblan. Gränssnittet är initialt svagt upplyst eftersom endast lite av det fluorescerande ytaktiva ämnet adsorberas. När fler och fler ytaktiva adsorberar börjar bubblan växa när färgen skiftar mer till grönt och gränssnittet blir befolkat av svarta LC-domäner som kan röra sig över gränssnittet. Aggregat av ytaktivt ämne i lösningen kan ses flyta i lösningen som ljusa amorfa former och flera sätter sig på bubbelgränssnittet, sönderdelas och deponerar sitt ytaktiva ämne på gränssnittet. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: Konfokal video av oscillationsstudie för lungtensid. Den falska färgen visar avståndet i z-riktningen med färgfältet till vänster om videon. Ytan utsätts för flera olika svängningsfrekvenser och de mörka LC-domänerna på gränssnittet kan ses förändras under hela svängningarna. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande figur 1: Exempel på ett mellanliggande steg i koden för att bestämma dilatationsreologin. När den här skärmen visas ska användaren vänsterklicka på den vänstra kanten av svängningen för att analysera och sedan vänsterklicka på kanten längst till höger. Flera svängningar kan analyseras så att användaren kan vänsterklicka på 1, 2, 3 och 4 och sedan högerklicka för att analysera dessa två svängningar. De oscillationer som visas har olika amplituder och frekvenser. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Exempel på de grafiska resultat som produceras av den dilatationella reologikoden. Detta visar sinusoidernas passningar till svängningarna i tryck, radie, ytarea och ytspänning samt Fouriertransformen för varje svängning. Helst bör den andra övertonen i Fouriertransformen vara mindre än 10% av den första övertonen för ytan och ytspänningen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Alternativa driftlägen. (A) Sinusvåg, (B) Sågtandsvåg, (C) Fyrkantsvåg, (D) Triangulär våg, (E) Konstant hastighetsexpansion och (F) Konstant hastighetskompression. Kompressions- och expansiva lägen gör det möjligt att skapa isotermer av Langmuir-typ för olösliga ytaktiva ämnen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 1: Mikrotensiometer virtuell Interface.vi. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 2: Dilatational_Rheology_Analysis Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kombinerade CPM/CFM är ett kraftfullt verktyg för att undersöka gränssnittsdynamik, jämvikt och morfologi. Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att erhålla data med CPM / CFM.

Figur 2 visar celldesignen med kanaler för kapillär-, lösningsmedels- och värmeväxlingen som anges. Inloppet för lösningsmedelsutbyte bör vara längst ner i cellen medan utloppet ska vara högst upp, vilket gör att cellen inte kan rinna över under utbytet. I praktiken kan inlopps- och utloppsflödeshastigheterna vara något annorlunda för samma peristaltiska pump. Ett vanligt problem med denna celldesign läcker från cellen. Detta orsakas oftast av en dålig anslutning mellan cellen och en av anslutningarna, men om alla anslutningar är torra och inte läcker kan det bero på en spricka i cellens glasglas på grund av överdragning av bultarna som omger cellen.

Figur 3 visar anslutningarna mellan de olika pumparna och cellen samt cellens inriktning mot CFM- och CPM-målen. CPM-kameran (4) används för att avbilda bubbelformen under drift. CPM-kameran måste vara utrustad med ett optiskt filter som förhindrar att CFM-laserljuset kommer in i CPM-kameran. Annars gör CFM-lasern bilder i CPM-kameran extremt bullriga och svåra att passa med hjälp av bildanalys. En säkerhetsventil ansluter kapillärpumpen och mikrofluidpumpen (7) och gör det möjligt att ändra pumpen och lufttryckskällan utan risk för att återflödet från cellen når pumpen. En andra ventil (13) ger tillgång till en spruta för att möjliggöra direkt injektion av vätska in i och ut ur behållaren. Vätska kan behöva tillsättas behållaren i händelse av läckage och kan behöva avlägsnas för steg 8 i protokollet (olöslig adsorption av ytaktivt medel) eller för att avlägsna bubblor som rensats från kapillären om de har fäst vid konfokalmålet.

Under varje experiment måste flera viktiga steg utföras noggrant. De flesta problem som uppstår när instrumentet är igång involverar själva kapillären. Som sådan kan noggrann skärning och beläggning minimera svårigheter. Att skära kapillären till önskad diameter är en svår och lågutbytesprocess. Varje chip eller ojämnhet i kapillärspetsen kommer att leda till dåliga avläsningar av bubbelradien. Dessutom, om den hydrofoba beläggningen inte appliceras korrekt, eller om den försämras med tiden och användningen, kommer bubblan inte att stifta ordentligt vid kapillärspetsen. Detta kan indikeras av att bubblan verkar vara fäst inuti kapillären eller glida längs kapillärens insida under en oscillerande studie. En kapillär som skärs väl men inte fästs ordentligt kan rengöras och hydrofobt behandlas.

Ett annat viktigt steg och möjlig felkälla är att rengöra cellbehållaren, slangen och kapillären mellan olika material eller olika koncentrationer av samma material. Det finns många små sprickor i behållaren och ytaktivt ämne kan adsorbera och ändra mätningar som görs vid senare tidpunkter om de inte rengörs ordentligt. Fullständig demontering och blötläggning av cellen krävs ofta för att säkerställa avlägsnande av överskott av ytaktivt material. Det är bättre att börja med att använda den lägsta koncentrationen om en serie koncentrationer av samma ytaktiva ämne ska studeras.

Ibland kan det vara svårt att ställa upp kapillärröret med det konfokala målet. Mikrotensiometerkameran kan användas för att justera konfokalmålet, men för ett stort arbetsavstånd från CFM-målet kanske detta inte är till hjälp. Om konfokalmikroskopet är fokuserat bortom kapillärspetsen kan kapillärtvärsnittet, en region utan fluorescerande material, också användas för att orientera målet. Om kapillärbubblan inte matas ut kan det finnas ett problem med att trycket tillförs kapillären (som ska vara 150 mbar under normal drift). Detta kan kontrolleras genom att gå in i tryckkontrollläge och ställa in trycket till ett högt värde. Om trycket inte når det inställda trycket finns det sannolikt ett läckage i slangen från mikrofluidpumpen eller så får pumpen inte tillräckligt med gastryck. Som med många studier som involverar ytvetenskap är det viktigt att se till att inga förorenande material introduceras till lösningarna när som helst. Om avläsningarna inte är som förväntat (ytspänningen börjar för lågt eller minskar för snabbt) är det också ett bra tidigt steg i felsökningen att göra ett nytt prov eller använda ett välstuderat prov eller ren vätska.

Flera modifieringar kan göras på apparaten för att uppnå andra experimentella mål. Olja eller vatten kan tillsättas i kapillären vilket möjliggör studier av olja-vatten istället för luft-vatten-gränssnitt39. Detta ökar risken för återflöde i pumpen så ytterligare försiktighet måste vidtas, eventuellt kan det till och med vara nödvändigt att lägga till en oljefälla i slangen mellan pumpen och kapillären.

Det finns flera begränsningar för CPM/CFM. CPM har ett begränsat arbetsområde av kapillärstorlek, 20-300 μm för kapillär OD för pumpen och optik i systemet. Även om det är möjligt att tillsätta olösligt ytaktivt medel till gränssnittet med hjälp av lösningsmedelsbyte41 eller den metod som beskrivs här, kan ytkoncentrationen endast härledas från att göra ytspänning kontra arealisotermer och jämföras med de som erhållits från ett Langmuir-tråg. CFM kan bara upptäcka fluorescerande material, så alla icke-fluorescerande eller icke-fluorescerande märkta material kan inte visualiseras. Många ytaktiva ämnen är små molekyler, och märkning av dem kan potentiellt förändra deras egenskaper, även om detta borde vara ett mindre problem för större ytaktiva molekyler som proteiner eller polymerer26,27.

Denna metod har flera viktiga fördelar jämfört med tidigare CPM- och CFM-analyser av ytaktiva gränssnitt. Det viktigaste är att hybridinstrumentet möjliggör visualisering av gränssnittet medan olika dynamiska och jämviktsyteegenskaper mäts. Förändringar i gränssnittets morfologi kan direkt kopplas till gränssnittsdynamiken och reologiska egenskaper. Tidigare CFM av ytaktiva gränssnitt gjordes med hjälp av en platt Langmuir-dal 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, medan metoden som beskrivs här kan utföras på mycket böjda gränssnitt 22 . Dessutom kan hela gränssnittet avbildas på en gång, vilket visar en spårbar förändring i realtid av specifika domäner medan ytflöden på Langmuir-tråget ledde till att domäner flödade in och ut ur det konfokala visuella fönstret. Ytkompressioner på denna apparat är också isotropa, medan barriärerna på Langmuir-tråg har särskilda kompressionsriktningar. CPM möjliggör mycket snabbare områdesoscillationer än vad som skulle vara möjligt på ett Langmuir-tråg.

Den nya krökningen och områdesbaserade styrningen i denna studie har stora fördelar jämfört med tidigare versioner av CPM30. Vanligtvis styrdes bubbelstorleken genom att ställa in ett fast kapillärtryck; för dilatationella modulimätningar svängdes kapillärtrycket. När kapillärtrycket hålls konstant, eftersom ytaktivt medel adsorberar till gränssnittet, minskar bubblans ytspänning. För att uppfylla Laplace-ekvationen, ΔP = 2γ / R, måste krökningsradien minska när ytspänningen minskar. För den halvklotformiga bubblan i CPM ökar bubbelområdet 9,48 genom att minska bubbelradien för krökningen:

Equation 10

där Rcär kapillärradien och R är krökningsradien. Bubblans ändringsradie ändrar gränssnittets yta under adsorptionen, vilket komplicerar analysen av adsorptionen med hjälp av Ward-Tordai-ekvationerna10,38 Dessutom, om bubblans ytspänning sänks tillräckligt, blir bubbelradien mindre än kapillärradien och bubblan matas ut. Återkopplingsslingan i denna nyare CPM/CFM håller bubbelområdet konstant under hela adsorptionen, vilket innebär att den ursprungliga Ward-Tordai-ekvationen kan användas, det finns ingen risk för bubbelutkastning och adsorption sker snabbare eftersom ytan inte ökar i området. För oscillerande studier producerar inte en sinusvåg i ytan 48 att producera en sinusvåg i ytan48. Tidigare CPM-metoder förlitade sig på att hålla svängningarna små för att areaförändringen orsakad av den tryckdrivna svängningen skulle approximera en sinusvåg48. Den beskrivna metoden styr direkt bubblans område och kan användas för att skapa sanna sinusvågsoscillationer i gränsområdet. Det är möjligt att direkt relatera spänningen (förändring i ytspänning) till den gränssnittsspänningen (förändring i ytarea) för att beräkna dilatationsmodulen.

För att hjälpa till med implementeringen av detta protokoll beskrivs en kort beskrivning av koden som styr mikrotensiometern här. Koden består av tre segment i en slinga: ett som utfärdar kommandon till mikrofluidikpumpen, ett som styr bubblans återställningsmekanism och ett som mäter bubblans radie och sparar de beräknade värdena. Pumpregulatorn har tre huvudsakliga driftlägen: tryckreglering, krökningskontroll och områdeskontroll. Vid tryckreglering matar användaren direkt in ett börvärde för det tryck som skapas av pumpen. Detta läge är viktigt eftersom det inte kräver en återkopplingsslinga och som sådan är den mest stabila av lägena. Krökningskontroll använder det tidigare uppmätta yttrycket och Laplace-ekvationen för att beräkna vilket tryck som krävs för att skapa ett gränssnitt för en given krökning. Ytområdeskontrollläget bygger på detta genom att beräkna vilken krökning som krävs för att skapa en given ytarea baserat på det sfäriska lockets geometri, vilket också kräver en exakt mätning av kapillärradien. Dessa två lägen är särskilt användbara för adsorptions- och svängningsstudier men kräver en stadig ström av konsekventa yttrycksdata. Som sådan kan inmatningen i dessa två styrenheter behöva jämnas ut från rådata för bättre funktion. När lösningen inte är tillräckligt tydlig, ofta på grund av ett mycket grumligt prov, fungerar det här läget inte ordentligt eftersom det inte är möjligt att få en bra bild av bubbelgränssnittet. Kontrollerna för svängningen ingår också i detta avsnitt av koden. Kodens mittsegment gör det möjligt att rensa bubblan från kapillären. Här ställs kapillärens inställda tryck på ett högt värde och hålls där under en viss tid så att bubblan kan dyka upp och ett nytt gränssnitt skapas. Den sista delen av koden använder programvara för synförvärv för att spåra bubblans kant och mäta dess radie. Denna radie används sedan med Laplace-ekvationen för att beräkna ytspänningen, som sedan matas till den första delen av slingan.

Denna hybrid CPM /CFM-teknik har visat sig vara mycket fördelaktig för våra studier av modell- och kliniska lungtensider vid luft-vattengränssnitt. Bubbeldimensionerna approximerar de i alveolerna i den mänskliga lungan och effekterna av gränsfallskrökning på morfologin och dynamiken hos lungtensidmonolager kan observeras 9,10,22. Hybridinstrumentet kommer också att vara viktigt för studier av andra ytaktiva material som är allestädes närvarande med applikationer som sträcker sig från petrokemiska till hushållskemikalier, från tårfilmer till antikroppsstabilisering. Den kombinerade CPM/CFM gör det möjligt för oss att undersöka dynamiska gränssnittsegenskaper på skalan av fasseparerade domäner och visualisera morfologierna på ytan när yttre förhållanden förändras. Denna metod är särskilt användbar i applikationer där dyra material kräver användning av minimala storleksprover. Den samtidiga observationen av gränsdynamiken och monolagermorfologin är nästan omöjlig med någon annan teknik, vilket gör den i stort sett tillämplig på området gränsvetenskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Alla konfokalmikroskopibilder erhölls med Nikon A1RHD Multiphoton upprätt konfokalmikroskop. Vi erkänner vägledningen och hjälpen från supportpersonalen, särskilt Guillermo Marques, vid University Imaging Center vid University of Minnesota. Detta arbete stöddes av NIH Grant HL51177. SI stöddes av ett Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Tags

Teknik utgåva 187 mikrotensiometer med kapillärtryck gränssnittsreologi lungtensid konfokalmikroskopi ytmorfologi mikrofluidik
Mikrotensiometer för konfokalmikroskopivisualisering av dynamiska gränssnitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter