Medicine

红景天的现场采集和实验室常规鉴定

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65947

Jiayi Wang*¹, Na Xie*^2,3, Mengjia Li¹, Jinsong Su⁴, Ya Hou³, Yi Zhang^1,2,3, Xiaobo Wang²

¹School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ²Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ³School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ⁴Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们从栖息地、植物形态、药用特性、微观特征和薄层色谱法中描述了红景天的鉴定。

Abstract

药材鉴定是药品安全的前提和保障。大多数科研人员必然会青睐简单、快速、有效、廉价的草药鉴定过程。 红景天 是一种生长在高海拔地区的传统藏药，主要分布于中国西藏、云南和四川地区。 红景天 具有抗炎、抗缺氧、抗氧化等多种生物活性，具有很大的发展潜力。随着市场需求的增加和资源含量的迅速减少，大量混淆的 红景天 产品一直困扰着人们。因此，该协议引入了在现场鉴定 红景天 的标准过程，并结合常规实验室测试。生境、微观特征和薄层色谱法的结合，无疑将快速、高效、经济地鉴定红景天，为藏医药的不断发展和药材的质量控制做出贡献。

Introduction

草药在中国有着悠久的历史和丰富的应用经验，是神农草药经典^1中的第一个系统记录。青蒿素应用于疟疾的发现，推动了草药的发展进入一个新的阶段¹。利用现代科学技术揭示草药的确切机理，提高了草药的利用率和需求，为其开辟了新的国际市场^2,3,4。然而，这导致了一系列负面影响。非专业人士对草药的特性认识模糊，这使得草药的使用面临巨大的安全风险⁵。

红景天是红景天属植物之一，主要分布于西藏、云南西北部和四川西部（图1）^6,7。红景天含有黑景天、酪醇、没食子酸等化合物，具有“活气促血、清脉、镇静哮^喘”等功能，用于治疗缺氧相关疾病8,9,10,11。野外调查表明，在海拔4,000-5,600 m的高山距骨带、沟壑斜坡和岩石缝隙中可以找到红景天。它的生长环境寒冷，阳光充足，辐射强烈，属于高寒草甸生态系统。红景天根据生长地形可分布在层状和点状种群中，通过异花授粉进行基因流动。

红景天属的花粉流产、非法挖掘和生态环境的退化使红景天成为濒危物种^6,12。鉴于红景天的高药用价值，预计假冒产品将流入市场。本文介绍了红景天的栖息地和一些方便的实验室鉴定方法。首先，我们观察了红景天的生长环境及其药用特性。其次，通过显微镜观察药粉的微观结构;最后一步是关键点。根据红景天在某种物质中的不同吸附或溶解特性，对红景天的代表性成分进行分离和鉴定。基于DNA的药用植物鉴定或代谢组学分析方法复杂且昂贵¹³.这些基本、方便、经济的方法可以快速识别红景天。

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Protocol

红景天 采集自中国四川省甘孜藏族自治州甘孜县卓达雪山（北纬31.44570°，东经99.96086°，海拔4892米）。这些植物由成都中医药大学民族医学院的张毅教授鉴定为真品。

1. 红景天的收集

拍摄 红景天的栖息地地图。
拍摄红景天的整个植物、叶子、花萼和根茎。
用铁锹清除红景天 1 m 范围内的杂草和碎石，以确保随后的顺利开采。
用锄头挖土，直到看到整个根际并收集主根。
注：用于药用部位的 红景天 的根和根茎应在秋季花茎枯萎时采集。

2.特征识别

用肉眼观察 红景天 的外观特征：圆柱形和短主根和根茎，棕色表面，带有粉红色图案的膜黄色表皮以及橙红色或勃艮第切片。
通过气味识别它：靠近鼻子时会散发出芬芳的气味。
按味辨：取一小块根放入口中，先啜饮后咀嚼，略带苦味，后甜。

3.药粉中淀粉颗粒的显微鉴定

用刷子去除 红景天 表面的土壤，将其放入40°C的烤箱中，每24小时翻动一次草药。
注意：药材的易碎性被认为是干燥水分的标准。
用粉剂机将干燥的药材粉化，并用药用的3号筛子过滤药粉（见 材料表）。
取一个干净的载玻片（见 材料表），用解剖针挖出粉末（见 材料表），并将其均匀地放置在载玻片的三分之一处，在2毫米以内。
使用玻璃滴管（见 材料表）向粉末中加入一滴去离子水。使用镊子（见 材料表）握住盖玻片的一端（见 材料表），快速接触液面并覆盖粉末。
注意：使用解剖针轻轻混合水和药粉，以确保样品混合均匀。载玻片、粉末和盖玻片之间不应有气泡。
打开显微镜（参见 材料表）并将步骤3.4中的载玻片放在平台上以固定它。调整光源和粗焦螺旋以查看粉末。调整细小的旁焦点螺旋，直到清楚地看到组织。切换到40倍物镜并观察淀粉颗粒。
注意：对呈现为单个或多个颗粒的谷物进行淀粉，脐带点呈人字形或裂缝状。

4.药粉中导管、软木细胞、纤维、木实质细胞、色素团的显微鉴定

取一张干净的载玻片（见 材料表），用解剖针挖出粉末（见 材料表），并将其放置在载玻片的三分之一处。
使用玻璃滴管（见 材料表）向粉末中加入一滴水合氯醛（见 材料表）。用镊子取载玻片（见 材料表），在酒精灯中加热三次，每次加热1秒。
注意：加热过程中应避免气泡。液体保持不流动，表明渗透已完成。
使用玻璃滴管加入一滴甘油（见 材料表）。用镊子握住盖玻片的一端，快速接触液位。
打开显微镜并将载玻片放在平台上以固定它。调整光源和粗焦螺旋以查看粉末。调整细小的旁焦点螺旋，直到清楚地看到组织。通过切换到 40 倍物镜观察导管、软木细胞、纤维、木实质细胞和颜料块。
注：软木细胞多边形或长多边形，螺旋状血管具有明显的螺旋结构，木质部薄壁组织含有草酸钙砂晶，红色或棕红色色素块。

5. 红景天薄层色谱（TLC）样品的制备及其对照品

将称重纸放在天平上（见 材料表）并称取 3 克 红景天粉末。
将粉末放入 100 mL 锥形瓶中（参见 材料表），并用大腹移液管加入 25 mL 甲醇（参见 材料表）。将锥形瓶放入超声波仪器中。将功率设置为 250 W，频率设置为 40 kHz，时间设置为 30 分钟（参见 材料表），然后打开仪器。
注：超声仪器的目的是确保 红景天 粉末完全溶解，而不影响后续薄层色谱实验的结果。
取出锥形瓶，用流水冲洗外瓶至室温（RT）。
用 1 mL 注射器吸出步骤 5.3 中制备的 800 μL 液体。用0.22μm微孔滤膜过滤（参见 材料表），并在色谱样品瓶中收集400μL 红景天 中游样品溶液。
称取并分别加入 2 mg 水景苷、酪醇和没食子酸（参见 材料表）到 3 个单独的 100 mL 锥形瓶中。用大肚移液管向每个锥形瓶中加入 25 mL 甲醇。
将锥形瓶放入超声波仪器中，将功率设置为250 W，频率设置为40 kHz，时间设置为30分钟，然后重复步骤5.3（见 材料表）。
用 1 mL 注射器吸出步骤 5.6 中制备的 800 μL 液体。用0.22μm微孔滤膜过滤（见 材料表），并在相应的色谱样品瓶中收集400μL中游水景苷，酪醇和没食子酸标准溶液。

6. TLC鉴定

移液器三氯甲烷（5 mL）、乙酸乙酯（4 mL）、甲醇（2 mL）和甲酸（0.5 mL）（参见 材料表）。加入双罐层析筒的一侧（见 材料表），摇匀并混合。盖住上气缸盖。
将没食子酸，水景苷，酪醇标准溶液和 红景天 溶液放在样品架上的位置A1-A4。
将 5 cm x 10 cm 硅胶片（参见 材料表）放在采样台上。启动自动取样机（见 物料表），打开气控阀。
打开visionCATS软件（参见材料表）。单击“新建”>“新建文件夹（名为红景天样本测试）”>“确定”。单击“新方法”（名称 Rhodiola crenulata 样品测试）> OK > ATS 4。
单击 “完成步骤定义”（Finish Step Definition）。单击 “跟踪分配 ”以编辑描述（没食子酸、水景苷、酪醇和 红景天 样品）。
单击 HPTLC 步骤。设置薄层参数（5 cm x 10 cm）。选择 应用类型 （波段），设置参数（表1），单击 “确定 ”按钮。
开放式 灌装/冲洗质量。选中 仅填充编程音量。将样品瓶底部液位（mm）设置为 0.5，然后单击 OK 按钮。
单击 “执行方法”。
单击 “跟踪分配 ”按钮，选中 “居中”，然后设置参数（表 2）。
单击 “继续 ”按钮进行自动采样。
关闭自动取样机和空气阀。从自动取样机上取下硅胶片。
在步骤6.1中将硅胶片放入双罐层析筒的另一侧，盖上上筒盖，预饱和20分钟。
用镊子轻轻夹住薄层板的上端，迅速将硅胶片放入显影剂中，盖上上气缸盖。
注意：当展开的前边缘距离薄层板上端 0.5-1.0 厘米时，取出硅胶片。
有机溶剂蒸发后，在室温下将显色溶液喷洒到硅胶片表面，以获得显色效果。
注：显色溶液是含有 2% FeCl₃ 和 1% K₃[Fe（CN）₆] 的水溶液。

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Representative Results

该实验方案描述了在田间识别和收集 红景天 。 红景天 倾向于生活在高山距骨带、沟壑斜坡和高海拔的岩石缝隙中。 红景天 的生境、全株、花和叶如图2所示。 红景天 具有红褐色的根茎（图3A）。药粉的代表性图像如 图3B所示。根据上述实验方案，显微结果可列举如下：1）棕黄色或无色软木细胞，外观大，多边形或长多边形，壁稍厚（图3C）;2）淀粉粒表现为单个或多个粒，脐点呈人字形或裂缝状（图3D）;3）主要是紧密排列的螺旋容器（图3E）;4）呈片状的无色和椭圆形木质部薄壁组织，含有草酸钙砂晶（图3F）;5）形状不规则的棕红色色素块（图3G）。薄层分离结果表明，红景天样品（A4）在没食子酸（A1）、水稻苷（A2）、酪醇标准溶液（A3）的色谱图对应位置出现相同颜色的斑点（图3H）。没食子酸、水景苷和酪醇是 红景天的主要和代表性成分。这些结果表明，通过方案中讨论的测试可以初步鉴定 红景天 。

图1：红景天分布图。（A） 红景天主要分布于中国、印度、尼泊尔和不丹¹⁴.（B）红景天主要分布于中国西藏、青海、四川、云南、贵州等地（软ArcGis 10.6生产）。统计数据来自植物学研究所^{的网站15,16}。请点击这里查看此图的较大版本.

图2： 红景天 植物的图片。（A） 红景天的生物群落。（B） 红景天的特写镜头。（C）红景天整株。（D） 红景天花。（E） 红景天的叶子呈锯齿状。请点击这里查看此图的较大版本.

图3： 红景天的显微特征和薄层色谱图。（A） 红景天的药用根。（B） 红景天的药用材料功效。（C）软木细胞。（四）淀粉粒。（E）螺旋容器。（F）木质部薄壁组织（草酸钙晶体）。（g）颜料。（H）薄层色谱分离水稻苷（A1）、没食子酸（A2）、酪醇（A3）和红景天（A4）。请点击这里查看此图的较大版本.

参数	选择
应用位置 Y （mm）	10
第一轨道位置（mm）	10
轨道距离（mm）	10
应用长度（mm）	5
应用宽度（mm）	0.5

表1：自动采样位置的参数设置。

样品瓶 ID	描述	体积（μL）	位置	类型
1	沙利果苷	3	答1	参考
11	没食子酸	1	答2	参考
12	酪醇	2	答3	参考
13	红景天样品	2	答4	样本

表 2：自动采样顺序的参数设置。

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Discussion

世界上有90多种红景天植物，其中60%以上的物种分布在我国，常见的有红景天、红景天、红景天和红景天¹⁷。《中国药典》（2020年）第一部分记载的红景天是一种生长在高海拔地区的传统藏药。红景天的市场需求每年都在增加，因此确保正确使用来源是确保安全使用的关键。特别是，从现场拣选到简单快速的实验室常规鉴定的标准化不容忽视。据报道，高效液相色谱、质谱和简单序列重复序列可以准确地将红景天与其他红景天物种区分开来，这既费时又复杂，而且成本高昂18,19,20。同时，我们建立了感官识别（E-nose和颜色分析）和HPLC法的多维评价方法，以区分红景天^21,22。

每种药材都有其独特的生长环境、微观结构特征和指标成分。该协议提供了一种鉴定 红景天 的综合方法，从现场鉴定到实验室显微镜检查和使用薄层色谱法进行验证。 红景天 主要生长在海拔3000米以上、低温、低氧、高紫外线辐射地区²³。 红景天 是一种多汁的草本植物，这是其直观的视觉特征。其粉末呈红褐色，有香味。根据其习性、植物形态、花和叶， 红景天 与该领域的其他红景天物种区分开来。药材显微结果显示，存在淀粉颗粒、木质薄壁细胞（包括草酸钙砂晶）、软木细胞、导管（主要是螺纹导管）和大量红色素。TLC是一种用于分离多组分样品的色谱分离技术，常用于中药材的鉴定。没食子酸、酪醇和水景苷通常被确定为 红景天²⁴ 的指示成分。薄层色谱结果表明， 红景天 溶液在对应位置（没食子酸、酪醇和水景苷）处呈现出与对照相同的色斑。它表明 红景天 含有没食子酸、酪醇和水利果苷。结合对生长环境的了解和显微结果，可以初步鉴定 红景天 。

值得注意的是，独特的生长环境决定了在海拔3000 m以下几乎不可能有野生 红景天 。此外，不建议在开花期间收获 红景天 的根和根茎。对于实验室显微镜鉴定，干燥根部和筛选粉末是成功制备显微样品的先决条件。确保载玻片、药粉和盖玻片之间没有气泡也是在显微镜下观察特征成分的关键。对于薄层色谱法，硅胶板的预饱和度、合理的显影剂、样品浓度等是成功分离供试品中不同组分的重要因素。与传统的人工采样相比，该协议的自动采样过程无疑提高了结果的准确性和实验的可重复性。香气和味觉识别的主观性太强，可能导致误判。与高效液相色谱、氢核磁共振和质谱相比，薄层色谱无法定量分析药材中化合物的含量²⁵。尽管DNA条形码在草药鉴定方面具有较高的准确性，但其高昂的价格决定了它在鉴定药材方面并不普遍²⁶。此外，从现场到实验室的鉴定和显微镜检查与本方案中提供的薄层色谱技术相结合，几乎适用于所有药用材料。这是一个廉价、简单、快速的过程，用于识别任何药材。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

本研究得到了国家自然科学基金（81973569、82274207、82104533）、成都中医药大学星林学者研究推进项目（XKTD2022013）和宁夏市重点研发计划（2023BEG02012）的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm millipore filter	Millipore	SLGP033RB
Automatic sampling machine	CAMAG	ATS 4
Chloral hydrate	Fuzhou Brunei Technology Co., Ltd	ST1002
Chromatographic sample bottles	Zhejiang ALWSCI Technology Co., Ltd	C0000008
Conical flask	Sichuan Shubo Co., Ltd	1121
Cover glass	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	10211818c
Dissecting needle	Shanghai Bingyu Fluid Technology Co., Ltd	BY-5026
Electronic balance	SHIMADZU	ATX124
Ethyl acetate	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2022120901
Formic acid	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021110801
Gallic acid	Chengdu Herbpurify Co., Ltd	M-017
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618
High speed crusher	Beijing Zhongxingweiye Instrument Co., Ltd	FW-100
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microscope	Chongqing Oprec Nistrument Co., Ltd	B203
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Pharmacopoeia sieve	Hangzhou Xingrun sieve factory	572423281330
Pipette	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	120302008
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd	H-040
Saturate tank	Yancheng Liegu Technology Co., Ltd	10*20 P-1
Silica gel plate	Yantai Jiangyou Silica Gel Development Co., Ltd	HSG20211227
Trichloromethane	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20221013-1
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
Tyrosol	Chengdu Herbpurify Co., Ltd	L-042
Ultrasound equipment	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200DTS
Volumetric pipet	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	120301006