Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

איסוף שדה וזיהוי שגרתי במעבדה של רודיולה קרנולטה

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65947
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 4, 3, 1,2,3, 2
1School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים את הזיהוי של Rhodiola Crenulata מבית גידול, מורפולוגיה של צמחים, תכונות רפואיות, תכונות מיקרוסקופיות וכרומטוגרפיה של שכבה דקה.

Abstract

זיהוי חומרים רפואיים הוא הנחת היסוד והערובה לבטיחות התרופה. רוב החוקרים המדעיים יעדיפו את תהליך הזיהוי הפשוט, המהיר, היעיל והזול של צמחי מרפא. Rhodiola crenulata היא תרופה טיבטית מסורתית הגדלה בגובה רב, מופצת בעיקר באזורי טיבט, יונאן וסצ'ואן בסין. לקרנולט רודיולה יש פעילויות ביולוגיות רבות, כמו נוגדות דלקת, נוגדות היפוקסיה ונוגדות חמצון, ויש לו פוטנציאל גדול להתפתחות. עם הביקוש הגובר בשוק וירידה מהירה בתוכן המשאבים, מספר רב של מוצרים מבולבלים של Rhodiola crenulata כבר מטריד אנשים. לכן, פרוטוקול זה מציג תהליך סטנדרטי לזיהוי רודיולה קרנולטה בשטח בשילוב עם בדיקות מעבדה שגרתיות. השילוב של בית גידול, תכונות מיקרוסקופיות וכרומטוגרפיה בשכבה דקה ללא ספק יזהה את רודיולה קרנולטה במהירות, ביעילות ומבחינה כלכלית, ויתרום להתפתחות מתמשכת של הרפואה הטיבטית ולבקרת האיכות של החומרים הרפואיים.

Introduction

לרפואת צמחים יש היסטוריה ארוכה וניסיון יישומי עשיר בסין, והיא הייתה ההקלטה השיטתית הראשונה בקלאסיקה הצמחית1 של שנונג. גילוי הארטמיסינין המיושם על מלריה קידם את התפתחות רפואת הצמחים לשלבחדש 1. השימוש בטכנולוגיה מדעית מודרנית כדי לחשוף את המנגנון המדויק של רפואת הצמחים מגדיל את שיעור הניצול והביקוש לרפואת צמחים, ופותח שוק בינלאומי חדש עבורה 2,3,4. עם זאת, זה הוביל לשורה של השפעות שליליות. ללא אנשי מקצוע יש הבנה מעורפלת של המאפיינים של רפואת צמחים, מה שהופך את השימוש ברפואת צמחים להתמודד עם סיכון בטיחותי עצום5.

Rhodiola crenulata, אחד הצמחים של מיני רודיולה, מופץ בעיקר בטיבט, בצפון מערב יונאן ובמערב סצ'ואן בסין (איור 1)6,7. Rhodiola crenulata מכיל salidroside, tyrosol, חומצה גאלית, ותרכובות אחרות לטיפול במחלות הקשורות היפוקסי באמצעות הפונקציה של "ממריץ צ 'י וקידום זרימת הדם, ניקוי הדופק ומרגיע אסטמה"8,9,10,11. חקירת שדה מראה כי ניתן למצוא רודיולה קרנולטה באזורי הטלוס האלפיני, מדרונות הערוצים ונקיקי הסלע בגובה של 4,000-5,600 מ'. סביבת הגידול שלו קרה, מלאה בשמש ובקרינה עזה, והוא שייך למערכת האקולוגית של האחו האלפיני. רודיולה קרנולטה יכולה להיות מופצת באוכלוסיות למלריות ודמויות נקודה בהתאם לשטח הגידול, וזרימת גנים יכולה להתבצע באמצעות האבקה צולבת.

הפלת האבקה של הסוג רודיולה, חפירת אי חוקיות והסביבה האקולוגית המנוונת הופכים את רודיולה קרנולטה למין בסכנת הכחדה 6,12. לאור הערך הרפואי הגבוה של רודיולה קרנולטה, מוצרים מזויפים צפויים לזרום לשוק. מאמר זה מציג את בית הגידול של Rhodiola crenulata וכמה שיטות זיהוי מעבדה נוחות. ראשית, ראינו את סביבת הגידול של Rhodiola crenulata ואת התכונות הרפואיות שלה. שנית, המיקרו-מבנה של אבקת מרפא נצפה במיקרוסקופ. השלב האחרון הוא נקודת המפתח. המרכיבים המייצגים של Rhodiola crenulata הופרדו וזוהו על פי תכונות ספיחה או פירוק שונות של רכיבים אלה בחומר מסוים. אימות מבוסס DNA או שיטות ניתוח מטבולומיות של צמחי מרפא הן מסובכות ויקרות13. שיטות בסיסיות, נוחות וחסכוניות אלה יכולות לזהות במהירות רודיולה קרנולטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Rhodiola crenulata נאסף מהר השלג Zhuoda, מחוז Ganzi, המחוז האוטונומי הטיבטי Ganzi, מחוז סצ'ואן, סין (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 מ '). הצמחים מאומתים כמקוריים על ידי פרופסור יי ז'אנג מבית הספר לרפואה אתנית, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית.

1. אוסף של Rhodiola crenulata

  1. צלמו את מפת סביבת המחיה של Rhodiola crenulata.
  2. צלמו את כל הצמח, העלים, הקליקס וקנה השורש של Rhodiola crenulata.
  3. השתמשו בשפכטל כדי לנקות את העשבים השוטים והאבנים השבורות בטווח של 1 מ' מ-Rhodiola crenulata כדי להבטיח את הכרייה החלקה שלאחר מכן.
  4. חפרו את האדמה עם מעדר עד שכל הריזוספרה נראית ואספו את שורש הברז.
    הערה: יש לאסוף את השורשים וקני השורש של Rhodiola crenulata המשמשים בחלקי מרפא בסתיו, כאשר גבעולי הפרח נובלים.

2. זיהוי אופייני

  1. שימו לב לתכונות המראה של Rhodiola crenulata בעין בלתי: שורשים גליליים וקצרים וקני שורש, משטח חום, אפידרמיס צהוב קרום עם דפוס ורוד, ופרוסות כתומות-אדומות או בורדו.
  2. זהה אותו על ידי ריח: זה נותן ריח ריחני כאשר ליד האף.
  3. זהה אותו לפי טעם: קח חתיכה קטנה של שורש לתוך הפה, תחילה ללגום ולאחר מכן ללעוס, טעם מעט מריר, ואז מתוק.

3. זיהוי מיקרוסקופי של גרגרי עמילן באבקה רפואית

  1. מוציאים את האדמה על פני השטח של Rhodiola crenulata עם מברשת, לשים אותו בתנור ב 40 °C, ולהפוך את עשבי תיבול כל 24 שעות.
    הערה: קלות השבירה של חומרים רפואיים נחשבת לתקן לייבוש לחות.
  2. אבקו את חומרי המרפא המיובשים באמצעות מכונת אבקה וסננו את האבקה הרפואית באמצעות מסננת מס' 3 (ראו טבלת חומרים).
  3. קחו שקופית נקייה (ראו טבלת חומרים), חפרו את האבקה עם מחט לניתוח (ראו טבלת חומרים) והניחו אותה באופן שווה על שליש מהשקופית בטווח של 2 מ"מ.
  4. השתמשו בטפטפת זכוכית (ראו טבלת חומרים) כדי להוסיף טיפת מים שעברו דה-יוניזציה לאבקה. השתמשו בפינצטה (ראו טבלת חומרים) כדי להחזיק קצה אחד של הכיסוי (ראו טבלת חומרים) כדי לגעת במהירות ברמת הנוזל ולכסות את האבקה.
    הערה: השתמש במחט אנטומית כדי לערבב בעדינות מים ואבקה רפואית כדי להבטיח ערבוב דגימה אחיד. לא אמורות להיות בועות אוויר בין המגלשה, האבקה וזכוכית הכיסוי.
  5. פתח את המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים) והנח את השקופית בשלב 3.4 על הפלטפורמה כדי לאבטח אותה. כוונן את מקור האור ואת ספירלת המיקוד הגסה כדי לראות את האבקה. התאם את הספירלה הפרפוקלית העדינה עד שהרקמות נראות בבירור. עברו למטרה של פי 40 והתבוננו בגרגרי העמילן.
    הערה: עמילן את הגרגרים המוצגים כגרגרים בודדים או מרובים, ונקודת הטבור מופיעה בצורת עצם הרינג או סדק.

4. זיהוי מיקרוסקופי של קטטרים, תאי שעם, סיבים, תאי פרנכימה מעץ ומסת פיגמנט באבקה רפואית

  1. קח שקופית נקייה (ראה טבלת חומרים), חפור את האבקה עם מחט כירורגית (ראה טבלת חומרים), ומקם אותה בשליש מהשקופית.
  2. השתמשו בטפטפת זכוכית (ראו טבלת חומרים) כדי להוסיף טיפת כלורל הידרט (ראו טבלת חומרים) לאבקה. קח את המגלשה עם פינצטה (ראה טבלת חומרים) וחמם אותה במנורת האלכוהול שלוש פעמים, בכל פעם למשך שנייה אחת.
    הערה: יש להימנע מבועות במהלך החימום. הנוזל נשאר לא זורם, מה שמעיד על כך שהחדירה הושלמה.
  3. השתמשו בטפטפת זכוכית כדי להוסיף טיפת גליצרין (ראו טבלת חומרים). השתמשו בפינצטה כדי להחזיק קצה אחד של הכיסוי כדי לגעת במהירות ברמת הנוזל.
  4. פתח את המיקרוסקופ והנח את המגלשה על הפלטפורמה כדי לאבטח אותה. כוונן את מקור האור ואת ספירלת המיקוד הגסה כדי לראות את האבקה. התאם את הספירלה הפרפוקלית העדינה עד שהרקמות נראות בבירור. התבוננו בצנתר, בתאי השעם, בסיבים, בתאי פרנכימה מעץ ובבלוק פיגמנט על ידי מעבר לעדשה אובייקטיבית פי 40.
    הערה: מצולע מצולע או ארוך של תאי שעם, כלי ספירלי בעל מבנה סלילי ברור, פרנכימה של קסילם המכילה גבישי חול של סידן אוקסלט, וגוש פיגמנט אדום או חום-אדום.

5. הכנת דגימות כרומטוגרפיות בשכבה דקה (TLC) של Rhodiola crenulata והפניה שלה

  1. מניחים את נייר השקילה על האיזון (ראו טבלת חומרים) ושוקלים 3 גרם אבקת רודיולה קרנולטה.
  2. קח את האבקה לתוך בקבוק חרוטי 100 מ"ל (ראה טבלה של חומרים), ולהוסיף 25 מ"ל מתנול עם פיפטה בטן גדולה (ראה טבלה של חומרים). הכניסו את הבקבוק החרוטי למכשיר האולטרסוני. כוונו את ההספק ל-250 ואט, את התדר ל-40 קילו-הרץ ואת הזמן ל-30 דקות (ראו טבלת חומרים) והפעילו את המכשיר.
    הערה: מטרת מכשיר האולטרסאונד היא להבטיח כי אבקת Rhodiola crenulata מומסת לחלוטין מבלי להשפיע על התוצאות של ניסויים כרומטוגרפיים בשכבה דקה לאחר מכן.
  3. הסר את הבקבוק החרוטי ושטוף את הבקבוק החיצוני במים זורמים לטמפרטורת החדר (RT).
  4. לשאוף 800 μL של נוזל מוכן בשלב 5.3 עם מזרק 1 מ"ל. סנן עם קרום מסנן מיקרונקבובי 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) ואסוף 400 מיקרוליטר של תמיסת דגימה באמצע הזרם של Rhodiola crenulata בבקבוק דגימה כרומטוגרפית.
  5. שקלו והוסיפו 2 מ"ג של סלידרוסיד, טירוסול וחומצה גאלית (ראו טבלת חומרים) ל-3 בקבוקים חרוטיים נפרדים של 100 מ"ל, בהתאמה. מוסיפים 25 מ"ל מתנול עם פיפטה בטן גדולה לכל בקבוק חרוט.
  6. הכניסו את הבקבוק החרוטי למכשיר האולטרסוני, כוונו את ההספק ל-250 ואט, את התדר ל-40 קילוהרץ ואת הזמן ל-30 דקות, וחזרו על שלב 5.3 (ראו טבלת חומרים).
  7. לשאוף 800 μL של נוזל מוכן בשלב 5.6 עם מזרק 1 מ"ל. סנן עם קרום מסנן מיקרונקבובי 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) ואסוף 400 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית של סלידרוסיד, טירוסול וחומצה גאלית באמצע הזרם בבקבוקי דגימה כרומטוגרפיים תואמים.

6. זיהוי TLC

  1. פיפטה טריכלורומתאן (5 מ"ל), אתיל אצטט (4 מ"ל), מתנול (2 מ"ל) וחומצה פורמית (0.5 מ"ל) (ראו טבלת חומרים). יש להוסיף לצד אחד של גליל הכרומטוגרפיה בעל המיכל הכפול (ראו טבלת חומרים), לנער ולערבב באופן שווה. מכסים את ראש הגליל העליון.
  2. הניחו את החומצה הגאלית, הסלידרוזיד, תמיסת הטירוסול הסטנדרטית ותמיסת רודיולה קרנולטה על מדף הדגימות במיקומים A1-A4.
  3. הניחו את יריעת הסיליקון בגודל 5X10 ס"מ (ראו טבלת חומרים) על שולחן הדגימה. הפעל את מכונת הדגימה האוטומטית (ראה רשימת חומרים) ופתח את שסתום בקרת האוויר.
  4. פתח את תוכנת visionCATS (ראה טבלת חומרים). לחץ על New > New Folder (בשם Rhodiola crenulata sample test) > אישור. לחץ על שיטה חדשה (שם Rhodiola crenulata sample test) > אישור > ATS 4.
  5. לחץ על הגדרת שלב סיום. לחץ על עקוב אחר הקצאה כדי לערוך את התיאור (חומצה גאלית, סלידרוסיד, טירוסול ודוגמת רודיולה קרנולטה ).
  6. לחץ על HPTLC Steps. הגדר את פרמטרי השכבה הדקה (5 ס"מ x 10 ס"מ). בחר Application Type (פס), הגדר את הפרמטרים (Table 1) ולחץ על הלחצן OK .
  7. איכות מילוי/שטיפה פתוחה. סמן את מלא רק אמצעי אחסון מתוכנת. הגדר את הרמה התחתונה של הבקבוקון (מ"מ) ל- 0.5 ולחץ על הלחצן אישור.
  8. לחץ על Execute Method.
  9. לחץ על הלחצן עקוב אחר הקצאה , סמן את מרכז והגדר את הפרמטרים (טבלה 2).
  10. לחצו על הלחצן 'המשך ' לדגימה אוטומטית.
  11. כבו את מכונת הדגימה האוטומטית ואת שסתום האוויר. הסירו את יריעת הסיליקון ממכונת הדגימה האוטומטית.
  12. הכניסו את יריעת הסיליקון לצד השני של גליל הכרומטוגרפיה של המיכל הכפול בשלב 6.1, כסו את ראש הצילינדר העליון ורוו מראש למשך 20 דקות.
  13. מהדקים בעדינות את הקצה העליון של צלחת השכבה הדקה עם טוויטר, מכניסים במהירות את יריעת הסיליקון לסוכן הפיתוח ומכסים את ראש הגליל העליון.
    הערה: הסר את יריעת הסיליקון כאשר הקצה הקדמי המתקפל נמצא במרחק של 0.5-1.0 ס"מ מהקצה העליון של לוח השכבה הדק.
  14. לאחר שהממס האורגני מתאדה, רססו את התמיסה הכרומוגנית על פני יריעת הסיליקון בטמפרטורת החדר לקבלת תוצאות כרומוגניות.
    הערה: התמיסה הכרומוגנית היא תמיסה מימית המכילה 2% FeCl3 ו-1% K3[Fe(CN)6].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול ניסויי זה מתאר זיהוי ואיסוף של רודיולה בקרנולט בשטח. קרזולט רודיולה נוטה לחיות באזורי טאלוס אלפיניים, מדרונות גאיות ונקיקי סלע בגובה רב. סביבת הגידול, הצמח השלם, הפרח והעלים של קרודיולה יכולים להיות מוצגים באיור 2. לקרנולט רודיולה יש קנה שורש חום-אדמדם (איור 3A). תמונה מייצגת של אבקת המרפא מוצגת באיור 3B. על פי פרוטוקול הניסוי לעיל, ניתן לרשום את התוצאות המיקרוסקופיות באופן הבא: 1) תאי שעם צהובים חומים או חסרי צבע, בעלי מראה גדול, מצולע או מצולע ארוך, עם דפנות מעט עבות יותר (איור 3C); 2) גרגרי עמילן המוצגים כגרגרים בודדים או מרובים, ונקודת טבור המופיעה בצורת עצם הרינג או סדק (איור 3D); 3) בעיקר כלי ספירלה שמסודרים היטב (איור 3E); 4) פרנכימה אכרומטית וסגלגלה של קסילם המופיעה ביריעות ומכילה גבישי חול של סידן אוקסלט (איור 3F); 5) גוש פיגמנט חום-אדום בעל צורה לא סדירה (איור 3G). תוצאות הפרדת השכבות הדקות הראו שדגימת Rhodiola crenulata (A4) הופיעה ככתמים באותו צבע במיקום המתאים לכרומטוגרמה של חומצה גאלית (A1), סלידרוסיד (A2), תמיסת טירוזול סטנדרטית (A3) (איור 3H). חומצה גאלית, סלידרוסיד וטירוסול הם המרכיבים העיקריים והמייצגים של קרונולט רודיולה. תוצאות אלה מראות כי זיהוי ראשוני של Rhodiola crenulata אפשרי עם הבדיקות שנדונו בפרוטוקול.

Figure 1
איור 1: מפת תפוצה של Rhodiola crenulata. (A) Rhodiola crenulata מופץ בעיקר בסין, הודו, נפאל ובהוטן14. (B) Rhodiola crenulata מופץ בעיקר בטיבט, צ'ינגהאי, סצ'ואן, יונאן וגוויג'ואו מסין (מיוצר על ידי ArcGis 10.6 רך). הנתונים הסטטיסטיים מגיעים מאתרי האינטרנט של המכון לבוטניקה 15,16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונה של צמח Rhodiola crenulata . (A) ביוטופ של Rhodiola crenulate. (B) שוט קרוב של רודיולה קרנוט. (C) צמח שלם של Rhodiola crenulate. (D) פרח של Rhodiola crenulata. (E) עלים של Rhodiola crenulate. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מאפיינים מיקרוסקופיים וכרומטוגרמה בשכבה דקה של Rhodiola crenulata. (A) שורש רפואי של Rhodiola crenulata. (B) הכוח החומרי הרפואי של Rhodiola crenulata. (C) תא שעם. (D) גרגרי עמילן. (E) כלי ספירלי. (F) Xylem parenchyma (גביש סידן אוקסלט). (G) פיגמנט. (H) הפרדת הכרומטוגרפיה של השכבה הדקה של סלידרוסיד (A1), חומצה גאלית (A2), טירוסול (A3) ורודיולה קרנולטה (A4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטרים אפשרות
מיקום יישום Y (מ"מ) 10
מיקום מסלול ראשון (מ"מ) 10
מרחק מסלול (mm) 10
אורך יישום (מ"מ) 5
רוחב יישום (מ"מ) 0.5

טבלה 1: הגדרות פרמטרים של מיקום הדגימה האוטומטי.

מזהה בקבוקון תיאור נפח (μL) מיקום סוג
1 סלידרוסייד 3 א1 הפניה
11 חומצה גאלית 1 א2 הפניה
12 טירוסול 2 א3 הפניה
13 דגימת קרנוט רודיולה 2 א4 לדוגמה

טבלה 2: הגדרות פרמטרים של סדר דגימה אוטומטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם יותר מ -90 מינים של צמחי רודיולה בעולם, ויותר מ -60% מכל המינים נמצאים בסין, נפוצים כולל Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis, ו Rhodiola algida17. Rhodiola crenulata, שתועדה בחלק הראשון של הפרמקופיאה הסינית (2020), היא תרופה טיבטית מסורתית הגדלה בגובה רב. הביקוש בשוק לרודיולה קרנולטה גדל מדי שנה, ולכן הבטחת שימוש נכון במקור היא המפתח להבטחת שימוש בטוח. בפרט, לא ניתן להתעלם מהסטנדרטיזציה מליקוט בשטח לזיהוי שגרתי פשוט ומהיר במעבדה. דווח כי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטריית מסות וחזרות רצפים פשוטות יכולות לזהות במדויק את קרוזולט רודיולה ממיני רודיולה אחרים, דבר הגוזל זמן, מורכב ויקר 18,19,20. בינתיים, ביססנו שיטת הערכה רב-ממדית לזיהוי חושי (E-nose וניתוח צבע) ושיטת HPLC להבחנה בין רודיולה crenulate21,22.

לכל חומר מרפא סביבת גידול ייחודית, מאפייני מבנה מיקרוסקופי ומרכיבי אינדקס. פרוטוקול זה מספק שיטה מקיפה לזיהוי רודיולה קרנולטה, החל מזיהוי שדה ועד למיקרוסקופ מעבדה ותיקוף באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה. Rhodiola crenulata גדל בעיקר בגבהים מעל 3000 מ ', טמפרטורה נמוכה, חמצן נמוך, ואזורי קרינה אולטרה סגולה גבוהה23. Rhodiola crenulata הוא צמח עסיסי, שהוא התכונה החזותית האינטואיטיבית שלו. האבקה שלו נראית חומה אדמדמה עם ריח ריחני. בהתבסס על הרגליה, מורפולוגיה של צמחים, פרחים ועלים, Rhodiola crenulata נבדלת ממיני רודיולה אחרים בתחום. התוצאות המיקרוסקופיות של חומרים רפואיים הראו את קיומם של גרגרי עמילן, תאי פרנכימה מעץ (כולל גבישי חול של סידן אוקסלט), תאי שעם, צינור (בעיקר צינור מושחל) וכמויות גדולות של פיגמנט אדום. TLC היא טכניקת הפרדה כרומטוגרפית להפרדת דגימות מרובות רכיבים, הנפוצה בזיהוי חומרים רפואיים סיניים. חומצה גאלית, טירוסול וסלידרוזיד מזוהים לעתים קרובות כמרכיבי האינדקס של Rhodiola crenulate24. התוצאות של כרומטוגרפיה בשכבה דקה הראו כי התמיסה של Rhodiola crenulata הראתה את אותם כתמי צבע במיקום המתאים כמו הביקורת (חומצה גאלית, טירוסול וסלידרוזיד). זה מראה כי Rhodiola crenulata מכיל חומצה גאלית, tyrosol, ו salidroside. בשילוב עם הידע של סביבת הגידול ותוצאות מיקרוסקופיות, Rhodiola crenulata ניתן לזהות באופן ראשוני.

ראוי לציין כי סביבת הגידול הייחודית קובעת כי זה כמעט בלתי אפשרי יש Rhodiola crenulata בר מתחת לגובה של 3000 מ '. בנוסף, לא מומלץ לקצור את השורשים ואת קנה השורש של Rhodiola crenulata במהלך תקופת הפריחה. לצורך זיהוי מיקרוסקופי במעבדה, ייבוש השורשים וניפוי האבקה הם תנאי מוקדם להכנה מוצלחת של דגימות מיקרוסקופיות. הקפדה על כך שאין בועת אוויר בין המגלשה, אבקת המרפא וזכוכית הכיסוי היא גם המפתח להתבוננות בהרכב האופייני מתחת למיקרוסקופ. עבור כרומטוגרפיה של שכבה דקה, הרוויה מראש של צלחת ג'ל סיליקה, סוכן פיתוח סביר וריכוז הדגימה הם גורמים חשובים להפרדה מוצלחת של רכיבים שונים בדגימת הבדיקה. בהשוואה לדגימה ידנית מסורתית, תהליך הדגימה האוטומטי של פרוטוקול זה ללא ספק מגביר את דיוק התוצאות ואת החזרתיות של הניסוי. הסובייקטיביות של זיהוי הארומה והטעם חזקה מדי ועלולה להוביל לשיפוט מוטעה. בהשוואה לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, תהודה מגנטית גרעינית H וספקטרומטריית מסות, כרומטוגרפיה בשכבה דקה אינה יכולה לנתח כמותית את תכולת התרכובות בחומרים רפואיים25. למרות שלברקוד דנ"א יש דיוק רב יותר בזיהוי צמחים, מחירו הגבוה קובע כי הוא אינו אוניברסלי בזיהוי חומרים רפואיים26. יתר על כן, הזיהוי והמיקרוסקופ מהשדה למעבדה בשילוב עם טכניקת הכרומטוגרפיה בשכבה הדקה המסופקת בפרוטוקול זה ישימים כמעט לכל החומרים הרפואיים. זהו תהליך זול, פשוט ומהיר לזיהוי כל חומר צמחי מרפא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81973569, 82274207 ו -82104533), פרויקט קידום המחקר המלומד Xinglin של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (XKTD2022013), ואת תוכנית המחקר והפיתוח המפתח של נינגשיה (2023BEG02012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm millipore filter Millipore SLGP033RB
Automatic sampling machine CAMAG ATS 4
Chloral hydrate Fuzhou Brunei Technology Co., Ltd ST1002
Chromatographic sample bottles Zhejiang ALWSCI Technology Co., Ltd C0000008
Conical flask Sichuan Shubo Co., Ltd 1121
Cover glass Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 10211818c
Dissecting needle Shanghai Bingyu Fluid Technology Co., Ltd BY-5026
Electronic balance SHIMADZU ATX124
Ethyl acetate Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd 2022120901
Formic acid Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd 2021110801
Gallic acid Chengdu Herbpurify Co., Ltd M-017
Glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010618
High speed  crusher Beijing Zhongxingweiye Instrument Co., Ltd FW-100
Methanol Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd 20230108
Microscope Chongqing Oprec Nistrument Co.,  Ltd B203
Microscope slide Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 7105P-G
Oven Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd DHG-8145
Pharmacopoeia sieve Hangzhou Xingrun sieve factory 572423281330
Pipette Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd 120302008
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd H-040
Saturate tank  Yancheng Liegu Technology Co., Ltd 10*20 P-1
Silica gel plate Yantai Jiangyou Silica Gel Development  Co., Ltd HSG20211227
Trichloromethane Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd 20221013-1
Tweezer  Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd 130302027
Tyrosol Chengdu Herbpurify Co., Ltd L-042
Ultrasound equipment Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB-8200DTS
Volumetric pipet Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd 120301006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, J., et al. Traditional herbal medicine and nanomedicine: Converging disciplines to improve therapeutic efficacy and human health. Advanced Drug Delivery Reviews. 178, 113964 (2021).
  2. Yin, R., et al. The positive role and mechanism of herbal medicine in Parkinson's Disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 9923331 (2021).
  3. Li, F. S., Weng, J. K. Demystifying traditional herbal medicine with modern approach. Nature Plants. 3, 17109 (2017).
  4. da Fonseca, L. R., et al. Herbal medicinal products from Passiflora for anxiety: An unexploited potential. The Scientific World Journal. 2020, 6598434 (2020).
  5. Aziato, L., Antwi, H. O. Facilitators and barriers of herbal medicine use in Accra, Ghana: an inductive exploratory study. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16, 142 (2016).
  6. Tao, H., et al. Rhodiola species: A comprehensive review of traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicity, and clinical study. Medicinal Research Reviews. 39 (5), 1779-1850 (2019).
  7. Wang, Y., et al. The dietary supplement Rhodiola crenulata extract alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through anti-inflammation, mediating gut barrier integrity and reshaping the gut microbiome. Food & Function. 12 (7), 3142-3158 (2021).
  8. Xie, N. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  9. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  10. Ma, D., et al. Chemical characteristics of Rhodiola Crenulata and its mechanism in acute mountain sickness using UHPLC-Q-TOF-MS/MS combined with network pharmacology analysis. Journal of Ethnopharmacology. 294, 115345 (2022).
  11. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  12. d'Avigdor, E., Wohlmuth, H., Asfaw, Z., Awas, T. The current status of knowledge of herbal medicine and medicinal plants in Fiche, Ethiopia. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine. 10, 38 (2014).
  13. Sánchez, M., González-Burgos, E., Divakar, P. K., Gómez-Serranillos, M. P. DNA-based authentication and metabolomics analysis of medicinal plants samples by DNA barcoding and ultra-high-performance liquid chromatography/triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-MS). Plants (Basel, Switzerland). 9 (11), 1601 (2020).
  14. Rhodiola renulata (Hook.fil & Thomson) H.Ohba. , Available from: https://www.gbif.org/species/4200529 (2023).
  15. Plant + data center. , Available from: https://www.iplant.cn/ (2023).
  16. Chinese virtual herbarium. , Available from: https://www.cvh.ac.cn/ (2023).
  17. Cunningham, A. B. There "ain't no mountain high enough"?: The drivers, diversity and sustainability of China's Rhodiola trade. Journal of Ethnopharmacology. 252, 112379 (2020).
  18. Wang, Q., Ruan, X., Jin, Z. H., Yan, Q. C., Tu, S. Identification of Rhodiola species by using RP-HPLC. Journal of Zhejiang University. Science. B. 6 (6), 477-482 (2005).
  19. Dong, X., Guo, Y., Xiong, C., Sun, L. Evaluation of two major Rhodiola species and the systemic changing characteristics of metabolites of Rhodiola crenulata in different altitudes by chemical methods combined with UPLC-QqQ-MS-based metabolomics. Molecules. 25 (18), 4062 (2020).
  20. Zhao, W., et al. HPLC fingerprint differentiation between natural and ex situ populations of Rhodiola sachalinensis from Changbai Mountain, China. PloS One. 9 (11), 112869 (2014).
  21. Yu, Y. Y. Quality evaluation of Tibetan medicine Rhodiolae crenulatae radix et rhizome based on sensory recognition and near infrared spectrum analysis. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. , Chinese Master's Thesis (2020).
  22. Lv, X. M. Simultaneous determination of 5 chemical components in 3 kinds of Rhodiola rosea by HPLC. China Pharmacy. 29 (18), 2515-2519 (2018).
  23. Dong, T., Sha, Y., Liu, H., Sun, L. Altitudinal variation of metabolites, mineral elements and antioxidant activities of Rhodiola crenulata (Hook.f. & Thomson) H.Ohba. Molecules. 26 (23), 7383 (2021).
  24. Ma, D., et al. Application of UHPLC fingerprints combined with chemical pattern recognition analysis in the differentiation of six Rhodiola species. Molecules. 26 (22), 6855 (2021).
  25. Li, X. H., et al. Metabolic discrimination of different Rhodiola species using 1H-NMR and GEP combinational chemometrics. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 67 (2), 81-87 (2019).
  26. Liu, Y., et al. Identification of Hippophae species (Shaji) through DNA barcodes. Chinese Medicine. 10, 28 (2015).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 200 זיהוי רודיולה קרנולטה חומרים רפואיים בטיחות תרופות פשוט מהיר יעיל זול צמחי מרפא רפואה טיבטית מסורתית גבהים טיבט יונאן אזורי סצ'ואן פעילויות ביולוגיות אנטי דלקתיות אנטי היפוקסיה תכונות נוגדות חמצון ביקוש בשוק תכולת משאבים מוצרים מבולבלים תהליך סטנדרטי זיהוי שדה בדיקות מעבדה שגרתיות בית גידול תכונות מיקרוסקופיות כרומטוגרפיה בשכבה דקה התפתחות טיבטית רפואה בקרת איכות
איסוף שדה וזיהוי שגרתי במעבדה של <em>רודיולה קרנולטה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Xie, N., Li, M., Su, J.,… More

Wang, J., Xie, N., Li, M., Su, J., Hou, Y., Zhang, Y., Wang, X. Field Collection and Laboratory Routine Identification of Rhodiola crenulata. J. Vis. Exp. (200), e65947, doi:10.3791/65947 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter