Summary
ここでは、生息地、植物形態、薬効成分、微視的特徴、および薄層クロマトグラフィーからの イワベンケイ の同定について説明します。
Abstract
医薬品の同定は、医薬品の安全性の前提であり、保証です。科学研究者の大多数は、ハーブの単純、迅速、効果的、そして安価な同定プロセスを支持するに違いありません。 イワベン ケイは、主に中国のチベット、雲南省、四川省の地域に分布する高地で栽培されている伝統的なチベット薬です。 Rhodiolaのcrenulateは 炎症抑制、抗低酸素症および酸化防止特性のような多数のbioactivityを、所有し、開発のための大きい潜在性があります。市場の需要の増加と資源含有量の急速な減少に伴い、 イワベン ケイの多数の混同された製品が人々を悩ませています。従って、この議定書はルーチンの実験室試験と結合される分野の Rodiolaのcrenulata の同一証明のための標準的なプロセスをもたらす。生息地、顕微鏡的特徴、および薄層クロマトグラフィーの組み合わせにより、 間違いなくロディオラ・クレヌラータ を迅速、効率的、経済的に同定し、チベット医学の継続的な発展と薬用材料の品質管理に貢献します。
Introduction
漢方薬は中国で長い歴史と豊富な応用経験があり、神農の漢方古典1の最初の体系的な記録でした。マラリアに応用されたアルテミシニンの発見は、漢方薬の開発を新たなステージ1に進めました。漢方薬の正確なメカニズムを明らかにするための現代の科学技術の使用は、漢方薬の利用率と需要を高め、それの新しい国際市場を開きます2,3,4。しかし、これは一連の悪影響につながっています。非専門家は漢方薬の特徴を漠然と理解しているため、漢方薬の使用は大きな安全上のリスクに直面しています5。
イワベンケイ属の植物の一つであるイワベンケイは、主にチベット、雲南省北西部、中国四川省西部に分布している(図1)6,7。Rhodiola crenulataは、「気を活性化し、血液循環を促進し、脈拍をきれいにし、喘息を落ち着かせる」機能を通じて、低酸素関連疾患の治療のためのサリドロシド、チロソール、没食子酸、およびその他の化合物で構成されています8,9,10,11。現地調査の結果、イワベンケイは標高4,000〜5,600mの高山距骨帯、峡谷斜面、岩の割れ目に見られることが分かりました。その生育環境は寒く、日光と強烈な放射線に満ちており、高山の牧草地の生態系に属しています。Rhodiola crenulataは、成長地形に応じて層状および点状の集団に分布することができ、他家受粉によって遺伝子流動を行うことができます。
イワベンケイ属の花粉流産、違法性の発掘、および退化した生態環境により、イワベンケイは絶滅危惧種となっています6,12。イワベンケイの薬効が高いことから、模倣品が市場に流入することが予想されます。この記事では、Rhodiola crenulataの生息地といくつかの便利な実験室での識別方法を紹介します。まず、イワベンケイの生育環境とその薬効を観察しました。第二に、薬用粉末の微細構造を顕微鏡で観察しました。最後のステップが重要なポイントです。Rhodiola crenulataの代表的な成分は、特定の物質におけるこれらの成分の異なる吸着または溶解特性に従って分離および同定されました。薬用植物のDNAベースの認証またはメタボロミクス分析法は複雑で高価です13。これらの基本的で便利で経済的な方法は、ロディオラ・クレヌラータを迅速に識別できます。
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Protocol
Rhodiolaのcrenulata はZhuodaの雪山、甘子県、甘子チベット族自治州、四川省、中国(N 31.44570°、E 99.96086°、4892 m)から収集されます。これらの植物は、成都中医薬大学民族医学院のYi Zhang教授によって本物であると認証されています。
1. Rhodiola crenulataのコレクション
- Rhodiola crenulataの生息地マップを撮影します。
- Rhodiola crenulataの植物全体、葉、萼、根茎を撮影します。
- スペードを使用して、 Rhodiola crenulata から1m以内の雑草や壊れた石を取り除き、その後のスムーズな採掘を確保します。
- 根圏全体が見えるまで鍬で土を掘り起こし、直根を集めます。
注:薬用部分に使用されている イワベンケイ の根と根茎は、花茎が枯れる秋に収集する必要があります。
2. 特性の同定
- 円筒形と短い主根と根茎、茶色の表面、ピンクのパターンを持つ膜状の黄色の表皮、オレンジレッドまたはバーガンディのスライスなど、 Rodiolaクレヌラータ の外観特性を肉眼で観察します。
- 匂いで識別する:鼻の近くで香ばしい匂いを放ちます。
- 味で識別する:根の小片を口に入れ、最初に一口飲んでから噛むと、少し苦い味がし、次に甘い味がします。
3. 薬用粉末中のデンプン顆粒の顕微鏡的同定
- イワベンケイの表面の土をブラシで取り除き、40°Cのオーブンに入れ、24時間ごとにハーブを回します。
注:薬用材料の破砕のしやすさは、水分を乾燥させるための基準と考えられています。 - 乾燥した薬用材料を粉末機で粉末化し、薬用3号のふるいで薬用粉末を濾過する( 材料表参照)。
- きれいなスライドを取り( 材料表を参照)、解剖針で粉末を掘り( 材料表を参照)、スライドの3分の1に2mm以内に均等に配置します。
- ガラススポイト( 材料表を参照)を使用して、粉末に脱イオン水を一滴加えます。ピンセット( 材料表を参照)を使用してカバーガラスの一端を保持し( 材料表を参照)、液面にすばやく触れて粉末を覆います。
注:解剖学的針を使用して、水と薬用粉末を穏やかに混合し、サンプルが均一に混合されるようにします。スライド、パウダー、カバーガラスの間に気泡があってはなりません。 - 顕微鏡を開き( 材料表を参照)、手順3.4のスライドをプラットフォームに置いて固定します。光源と粗い焦点のスパイラルを調整して、パウダーを確認します。組織がはっきりと見えるまで、細かい傍焦点スパイラルを調整します。40倍対物レンズに切り替えて、でんぷん顆粒を観察します。
注:でんぷん粒は単一または複数の粒として表示され、臍帯はヘリンボーンまたは亀裂の形に見えます。
4. 薬用粉末中のカテーテル、コルク細胞、繊維、木質実質細胞、色素塊の顕微鏡的同定
- きれいなスライドを取り( 材料表を参照)、解剖針で粉末を掘り( 材料表を参照)、スライドの3分の1に置きます。
- ガラススポイト( 材料表を参照)を使用して、粉末に抱水クロラール( 材料表を参照)を滴下します。ピンセットでスライドを取り( 材料表を参照)、アルコールランプで3回、毎回1秒間加熱します。
注意: 加熱中は気泡を避けてください。液体は流れていないままであり、浸透が完了していることを示しています。 - ガラススポイトを使用して、グリセリンを一滴加えます( 材料表を参照)。ピンセットを使用してカバーガラスの一方の端を持ち、液面にすばやく触れます。
- 顕微鏡を開き、スライドをプラットフォームに置いて固定します。光源と粗い焦点のスパイラルを調整して、パウダーを確認します。組織がはっきりと見えるまで、細かい傍焦点スパイラルを調整します。カテーテル、コルク細胞、繊維、木実質細胞、色素ブロックを40倍の対物レンズに切り替えて観察します。
注:コルク細胞の多角形または長い多角形、明らかならせん構造を持つらせん状の容器、シュウ酸カルシウム砂の結晶を含む木部実質、および赤または茶色がかった赤色の顔料ブロック。
5. Rodiolaのcrenulataおよびその参照の薄層クロマトグラフィー(TLC)サンプルの調製
- 計量紙を天びんに置き( 材料表を参照)、 ロディオラ・クレヌラータの粉末3gを計量します。
- 粉末を100 mLのコニカルボトル( 材料表を参照)に入れ、大きな腹部のピペットで25 mLのメタノールを加えます( 材料表を参照)。円錐形のボトルを超音波装置に入れます。電力を250 W、周波数を40 kHz、時間を30分に設定し( 材料表を参照)、機器の電源を入れます。
注:超音波装置の目的は、 Rodiolaクレヌラータ の粉末がその後の薄層クロマトグラフ実験の結果に影響を与えることなく完全に溶解することを確認することです。 - 円錐形のボトルを取り外し、外側のボトルを流水で室温(RT)ですすいでください。
- ステップ5.3で調製した液体800μLを1mLのシリンジで吸引する。0.22 μmの微多孔性フィルターメンブレン( 材料表を参照)でろ過し、クロマトグラフィーサンプルボトルに Rodiola crenulata の400 μLの中間サンプル溶液を回収します。
- 2 mgのサリドロシド、チロソール、没食子酸( 材料表を参照)をそれぞれ3本の別々の100 mLコニカルボトルに計量して加えます。25 mLのメタノールを大きな腹のピペットですべてのコニカルボトルに加えます。
- 円錐形のボトルを超音波装置に入れ、出力を250 W、周波数を40 kHz、時間を30分に設定し、手順5.3を繰り返します( 材料表を参照)。
- ステップ5.6で調製した液体800μLを1mLのシリンジで吸引する。0.22 μm 微多孔性フィルターメンブレン( 材料表を参照)でろ過し、400 μL のサリドロシド、チロソール、没食子酸標準液を対応するクロマトグラフィーサンプルボトルに回収します。
6. TLCの識別
- ピペットトリクロロメタン(5 mL)、酢酸エチル(4 mL)、メタノール(2 mL)、ギ酸(0.5 mL)( 材料表を参照)。ダブルタンククロマトグラフィーシリンダーの片側( 材料表を参照)に加え、振とうし、均一に混合します。上部シリンダーヘッドを覆います。
- 没食子酸、サリドロシド、チロソール標準液、 およびロディオラクレヌラータ 溶液をサンプルラックの位置A1〜A4に置きます。
- 5 cm x 10 cmのシリコンシート( 材料表を参照)をサンプリングテーブルに置きます。自動サンプリング機( 材料表参照)を始動し、エアコントロールバルブを開きます。
- visionCATSソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。[ 新規] > [新しいフォルダー] ( 名前は Rhodiola crenulata sample test) をクリックして [OK] >。 [New Method (name Rhodiola crenulata sample test)] > [ OK ] > ATS 4 をクリックします。
- 「 ステップ定義の終了」をクリックします。[ Track Assignment ] をクリックして、説明 (没食子酸、サリドロシド、チロソール、 および Rhodiola crenulata サンプル) を編集します。
- 「 HPTLC ステップ」をクリックします。薄層のパラメータ(5 cm x 10 cm)を設定します。 アプリケーションの種類 (バンド)を選択し、パラメータを設定し(表1)、 OK ボタンをクリックします。
- 充填/すすぎ品質を開きます。Fill only Programmed Volumeにチェックを入れます。バイアルの底面レベル(mm)を0.5に設定し、[OK]ボタンをクリックします。
- 「 メソッドの実行」をクリックします。
- [ Track Assignment ]ボタンをクリックし、[ Center]をオンにして、パラメータを設定します(表2)。
- [ 続行 ] ボタンをクリックすると、自動サンプリングが行われます。
- 自動サンプリング機とエアバルブの電源を切ります。自動サンプリング機からシリコーンシートをはがします。
- ステップ6.1でシリコーンシートをダブルタンククロマトグラフィーシリンダーの反対側に入れ、上部シリンダーヘッドを覆い、20分間予飽和させます。
- 薄層プレートの上端をピンセットで静かにクランプし、シリコンシートを現像剤にすばやく入れて、上部シリンダーヘッドを覆います。
注意: 展開する前端が薄層プレートの上端から0.5〜1.0cm離れているときに、シリコンシートを取り出します。 - 有機溶媒が蒸発した後、発色溶液を室温でシリコーンシートの表面に噴霧して発色結果を得る。
注:発色溶液は、2%FeCl3 と1%K3 [Fe(CN)6]を含む水溶液です。
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Representative Results
この実験プロトコルは、現場で のロディオラのクレヌレート の識別と収集について説明しています。 イワベンケイ は、高山の距骨帯、峡谷の斜面、および高地の岩の裂け目に住む傾向があります。 イワベン ケイの生息地、全植物、花、葉を 図2に示すことができます。 イワベン ケイは赤褐色の根茎を持っています(図3A)。薬用粉末の代表的な画像を 図3Bに示す。上記の実験プロトコルによると、顕微鏡の結果は次のようにリストできます:1)茶色がかった黄色または無色のコルク細胞、大きな外観、多角形または長い多角形、わずかに厚い壁(図3C)。2)単一または複数の粒子として現れるデンプン粒子、およびヘリンボーンまたは亀裂の形に見える臍帯の点(図3D)。3)密に配置された主に螺旋状の血管(図3E)。4)シート状に存在し、シュウ酸カルシウム砂結晶を含む無色および楕円形の木部実質(図3F)。5)不規則な形状の茶赤色顔料ブロック(図3G)。薄層分離の結果、 ロディオラ・クレヌラータ サンプル(A4)は、没食子酸(A1)、サリドロシド(A2)、チロソール標準液(A3)のクロマトグラムに対応する位置に同じ色の斑点として現れました(図3H)。没食子酸、サリドロシド、チロソールは、 ロディオラクレヌレートの主要成分であり、代表的な成分です。これらの結果は、 Rhodiola crenulata の予備的な同定がプロトコルで議論されているテストで可能であることを示しています。
図1:イワベンケイの分布図。 (A)イワベンケイは、主に中国、インド、ネパール、ブータンに分布している14.(B)Rhodiola crenulata は、主に中国のチベット、青海省、四川省、雲南省、貴州省に分布しています (ソフト ArcGis 10.6 で作成)。統計データは、Institute of Botany15,16 の Web サイトからのものです。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2: イワベン ケイの植物の写真。 (A) イワベンケイのビオトープ。(B) イワベンケイのクローズショット。(C)イワベンケイの植物全体。(D) イワベンケイの花。(E)イワベンケイの葉は 裂け目をつけます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3: Rhodiola crenulataの顕微鏡特性と薄層クロマトグラム。 (A) Rhodiola crenulataの薬用根。(B) イワベンケイの薬効成分。(C)コルクセル。(D)澱粉粒。(E)螺旋状の容器。(F)木部実質(シュウ酸カルシウム結晶)。(g)顔料。(H)サリドロシド(A1)、没食子酸(A2)、チロソール(A3)、 およびイワベン ケイ(A4)の薄層クロマトグラフィー分離。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | オプション |
| 適用位置 Y (mm) | 10 |
| 第1トラック位置(mm) | 10 |
| トラック距離(mm) | 10 |
| 適用長さ(mm) | 5 |
| 適用幅(mm) | 0.5 |
表1:自動サンプリング位置のパラメータ設定
| バイアルID | 形容 | 容量(μL) | 立場 | 種類 |
| 1 | サリドロシド | 3 | A1 (日本語) | 参考 |
| 11 | 没食子酸 | 1 | A2 (英語) | 参考 |
| 12 | チロソール | 2 | A3 (英語) | 参考 |
| 13 | イワベンケイのクレヌレート サンプル | 2 | A4の | 見本 |
表2:自動サンプリング順序のパラメータ設定。
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Discussion
世界には90種以上のイワベンケイの植物があり、すべての種の60%以上が中国で発見され、イワベンケイ、イワベンケイ、イワベンケイのアカリネンシス、イワベンケイなどの一般的なものが見られます17。中国薬局方(2020年)の最初の部分に記録されたRhodiola crenulataは、高地で栽培されたチベットの伝統薬です。Riolaのcrenulataのための市場の需要は年々増加しているので源の正しい使用を保障することは安全な使用を保障する鍵である。特に、現場でのピッキングから簡便で迅速なラボルーチンの同定までの標準化は無視できません。高速液体クロマトグラフィー、質量分析、および単純なシーケンスリピートは、時間がかかり、複雑で、高価な他のロディオラ種からロディオラのクレヌレートを正確に識別できることが報告されています18,19,20。一方、官能認識(E-noseおよび色分析)の多次元評価法とHPLC法を確立し、Rhodiolaクレヌレート21,22を区別する。
それぞれの薬用素材には、独自の生育環境、微細な構造特性、および指標成分があります。このプロトコルは薄層クロマトグラフィーを使用して分野の同一証明からの実験室の顕微鏡検査そして確認に Rhodiolaのcrenulataを、 識別するための広範囲方法を提供する。 イワベンケイ は、主に標高3000m以上、低温、低酸素、高紫外線域で生育する23。 イワベン ケイは多肉植物のハーブで、直感的な視覚的特徴があります。その粉末は赤褐色に見え、香ばしい匂いがします。その習性、植物形態、花、葉に基づいて、 Rhodiola crenulata は、フィールドの他のRhodiola種と区別されます。薬用材料の顕微鏡的結果は、デンプン顆粒、木材実質細胞(シュウ酸カルシウム砂結晶を含む)、コルク細胞、導管(主にねじ込み導管)、および大量の赤色色素の存在を示しました。TLCは、多成分サンプルを分離するためのクロマトグラフィー分離技術であり、漢方薬材料の同定に一般的に使用されます。没食子酸、チロゾール、およびサリドロシドは、 多くの場合、ロディオラクレヌレート24の指標成分として識別されます。薄層クロマトグラフィーの結果、 Rhodiola crenulata の溶液は、対照(没食子酸、チロソール、サリドロシド)と同じ位置で同じ色の斑点を示すことが示されました。これは、 Rhodiola crenulata が没食子酸、チロソール、およびサリドロシドを含んでいることを示しています。成長する環境および顕微鏡の結果の知識と結合されて、 Rhodiolaのcrenulata は予備的に識別することができる。
独特の生育環境により、標高3000m以下で野生の イワベンケイ を飼うことはほとんど不可能であることが決定していることは注目に値します。また、開花期に Rhodiola crenulata の根や根茎を収穫することはお勧めしません。実験室での顕微鏡による同定では、根を乾燥させ、粉末をふるいにかけることが、顕微鏡サンプルの調製を成功させるための前提条件です。スライド、薬用粉末、カバーガラスの間に気泡がないことを確認することも、顕微鏡で特徴的な組成を観察するための鍵です。薄層クロマトグラフィーでは、シリカゲルプレートの事前飽和、妥当な現像剤、およびサンプル濃度が、試験サンプル中のさまざまな成分を正常に分離するための重要な要素です。従来の手動サンプリングと比較して、このプロトコルの自動サンプリングプロセスにより、結果の精度と実験の再現性が確実に向上します。香りや味の識別の主観性が強すぎて、誤審につながる可能性があります。高速液体クロマトグラフィー、H核磁気共鳴法、質量分析法と比較して、薄層クロマトグラフィーは医薬品材料中の化合物の含有量を定量的に分析することはできません25。DNAバーコーディングは、薬草の識別において優れた精度を有するが、その高価格は、医薬品の同定において普遍的ではないと判断する26。さらに、このプロトコルで提供される薄層クロマトグラフィー技術と組み合わせたフィールドから実験室への識別と顕微鏡検査は、ほとんどすべての医薬品に適用できます。これは、薬草材料を識別するための安価で簡単かつ迅速なプロセスです。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(81973569、82274207、82104533)、成都中産大学の興林奨学生研究促進プロジェクト(XKTD2022013)、寧夏回族自治区重点研究開発プログラム(2023BEG02012)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm millipore filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Automatic sampling machine | CAMAG | ATS 4 | |
| Chloral hydrate | Fuzhou Brunei Technology Co., Ltd | ST1002 | |
| Chromatographic sample bottles | Zhejiang ALWSCI Technology Co., Ltd | C0000008 | |
| Conical flask | Sichuan Shubo Co., Ltd | 1121 | |
| Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 10211818c | |
| Dissecting needle | Shanghai Bingyu Fluid Technology Co., Ltd | BY-5026 | |
| Electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| Ethyl acetate | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2022120901 | |
| Formic acid | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021110801 | |
| Gallic acid | Chengdu Herbpurify Co., Ltd | M-017 | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | |
| High speed crusher | Beijing Zhongxingweiye Instrument Co., Ltd | FW-100 | |
| Methanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20230108 | |
| Microscope | Chongqing Oprec Nistrument Co., Ltd | B203 | |
| Microscope slide | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 7105P-G | |
| Oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | DHG-8145 | |
| Pharmacopoeia sieve | Hangzhou Xingrun sieve factory | 572423281330 | |
| Pipette | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 120302008 | |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd | H-040 | |
| Saturate tank | Yancheng Liegu Technology Co., Ltd | 10*20 P-1 | |
| Silica gel plate | Yantai Jiangyou Silica Gel Development Co., Ltd | HSG20211227 | |
| Trichloromethane | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20221013-1 | |
| Tweezer | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 130302027 | |
| Tyrosol | Chengdu Herbpurify Co., Ltd | L-042 | |
| Ultrasound equipment | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200DTS | |
| Volumetric pipet | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 120301006 |
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