Summary
يوفر هذا البروتوكول معلومات فنية لإعادة بناء الأوعية باستخدام تقنية الكفة في زراعة الكبد التقويمية للفئران.
Abstract
زرع الكبد التقويمي للفأر هو منهجية فعالة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء نقص تروية الكبد وإصابة التروية. ومع ذلك ، فإن التحديات التقنية تشكل عائقا أمام استخدام هذا النموذج التجريبي القيم ونقل هذه المهارات إلى الجيل التالي. الجانب الأكثر تحديا في هذا الإجراء هو إعادة بناء الأوعية الدموية ، بما في ذلك الوريد البابي (PV) ، والوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي (IHIVC) ، والوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي. يسمح استخدام الأصفاد البلاستيكية ، بدلا من الغرز ، بإعادة بناء PV و IHIVC بشكل أكثر سلاسة. يتم إعادة بناء الأوعية عن طريق ربط الكفة المصنوعة من قسطرة وريدية بطرف وعاء الكسب غير المشروع وإدخال الكفة في الوعاء المتلقي. الجانبان الأكثر أهمية هما تصور التجويف الداخلي للسفينة بشكل صحيح وتجنب استخدام القوة المفرطة. هدفنا هو تقديم نظرة عامة فنية على إعادة بناء الأوعية الدموية باستخدام تقنية الكفة في جراحة المتلقي. من المتوقع أن تساعد هذه النصائح الفنية لتقنية الكفة الجراحين المجهريين على تسهيل إعادة بناء الأوعية الدموية وتطوير أبحاثهم.
Introduction
زرع الكبد التقويمي للفأر (MOLT) هو طريقة تجريبية فعالة تم الإبلاغ عنها لأول مرة في عام 19911. لعب هذا النموذج التجريبي ، الذي يستخدم الفئران المعدلة وراثيا وكواشف الأبحاث المختلفة ، دورا محوريا في التحقيق في نقص التروية الدافئ والبارد وإصابات التروية. ومع ذلك ، فإن التعقيد التقني العالي للنموذج قد أعاق تطوير الطب الأساسي لزراعة الكبد2. يتضمن MOLT ثلاث خطوات رئيسية: (1) استرجاع الكبد من فأر المتبرع ، (2) جراحة الطاولة الخلفية ، و (3) زرع الكبد في المتلقي. من بين هذه الإجراءات المتلقية ، تشكل مفاغرة الأوعية الدموية التحدي الأكبر. في حين أن مفاغرة الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي تكتمل عادة عن طريق خياطة اليد2 ، يمكن إعادة بناء الوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي (IHIVC) والوريد البابي (PV) بشكل أكثر كفاءة باستخدام الأصفاد البلاستيكية بدلا من الغرز المخيطة يدويا.
تشير الفترة الكبدية إلى الفترة الفاصلة بين إزالة الكبد الأصلي للمتلقي وزرع الكسب غير المشروع. لضمان نتائج متسقة ، من الضروري الحد من وقت الكبد إلى أقل من 20 دقيقة. وبالتالي ، اقتصرت الدراسات التي تستخدم هذا النموذج على مؤسسات محددة3،4،5،6،7،8،9. من بين المراحل المختلفة ل MOLT ، يعد تحقيق إعادة بناء PV و IHIVC أمرا بالغ الأهمية لتقليل وقت الكبد وضمان الزرع الناجح.
يتم إجراء إعادة بناء PV و IVC بشكل عام باستخدام الأصفاد الوعائية لأن تقنية الكفة تبسط مفاغرة الأوعية الدموية مقارنة بالغرز المخيطة يدويا2،5،8. تؤثر التقنية المستخدمة في تحضير الكفة الوعائية والتعلق الآمن بالكفة بشكل كبير على تعقيد إعادة بناء الأوعية الدموية المتلقية. هدفنا هو توفير إرشادات مرئية مفصلة للعديد من النصائح الفنية المتعلقة بطريقة الكفة ، وبالتالي تقليل منحنى التعلم. ستوفر مقاطع الفيديو هذه فهما واضحا لكيفية ربط الكفة بالأوعية وإعادة بناء PV و IHIVC أثناء الجراحة المتلقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة التجارب على في جامعة كيوتو. استخدمت الدراسة الفئران C57BL / 6 ، التي يزيد عمرها عن 10 أسابيع وتزن ما بين 25 جم و 30 جم ، والتي تم الحصول عليها من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تخدير جميع بنسبة 2.5٪ إيزوفلوران (وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) ، وتم الحفاظ عليها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، وتم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا للوائح جامعة كيوتو بشأن التجارب على. الأدوات المناسبة المستخدمة للدراسة مدرجة في جدول المواد والموضحة في الشكل 1 والشكل 2.
1. اختيار
- استخدام الفئران مع وزن الجسم من 25-30 غرام.
ملاحظة: في حين أن الطعم الخيفيلكبد الفأر 2 مقبول بشكل عام عبر حاجز معقد التوافق النسيجي الرئيسي ، فقد اخترنا نموذج MOLT الجيني في هذه الدراسة للتركيز على الآلية التفصيلية لإصابة نقص التروية الباردة10. لا ينصح الفئران التي يقل وزنها عن 25 جم لأنه من المستحيل إدخال دعامة داخلية في قناة صفراوية رقيقة. وبالمثل ، لا ينصح الفئران التي تزن أكثر من 30 غرام بسبب وجود كمية كبيرة من الدهون داخل البطن حول الأوعية.
2. صنع الكفة
- تحضير 20 G و 16 G القسطرة الوريدية ل PV و IHIVC ، على التوالي.
- باستخدام مشرط ، قم بقطع القسطرة لإنشاء الكفة. يجب أن يبلغ طول الجسم الرئيسي للصفعة 2 مم ، مع مقبض تمديد 1 مم (الشكل 3 أ).
ملاحظة: إذا كان المقبض كبيرا جدا ، فقد يصبح من الصعب إدخال الكفة. - على سطح الكفة ، قم بإنشاء أخدود ضحل لتثبيت الخيط باستخدام الجزء الخلفي من شفرة المشرط.
ملاحظة: عند وضع الجزء الخلفي من شفرة المشرط على الكفة ، تأكد من أن طرف الشفرة بزاوية 60 درجة تقريبا (كما هو موضح في الشكل 3 ب). بعد عمل الأخدود الأول ، قم بتأمين شفرة المشرط وقم بتدوير الكفة. من الناحية المثالية ، يوصى باستخدام أخاديد ، لكن أخدودا واحدا يمكن أن يكفي دون مشاكل.
3. مرفق الكفة
- في وعاء بلاستيكي مستطيل الشكل ، ضع مكعبات ثلج صغيرة وضع كوبا معدنيا صغيرا (قطره 6 سم) في الأعلى. املأ الكوب بسائل الحفاظ على الأعضاء (انظر جدول المواد) وضع الكسب غير المشروع الجيني بداخله.
- لف برفق طعم الكبد التخليقي (المستخرج من فأر متبرع آخر) باستخدام قطعة قطن ، مع التأكد من أن بورتا الكبد متجها لأعلى. قم بإزالة أي دم مخزن في تجويف IVC تماما باستخدام سائل الحفاظ على الأعضاء.
- قم بتمرير PV عبر الكفة باستخدام خيط متصل ، على سبيل المثال ، بالوريد الطحال (انظر الشكل 4 أ).
- باستخدام مقبض الكفة في موضع الساعة 12 ، قم بتأمين كل من المقبض والسوار بمشبك البلدغ (انظر جدول المواد) ، مع وضعه من 2 إلى 3 مم من الحافة الكهروضوئية.
- قم بتأمين مشبك البلدغ بشكل أكبر باستخدام ملقط وعائي كبير وقالب تثبيت لإنشاء مجال المنطوق (انظر الشكل 4 ب).
- افحص التجويف الكهروضوئي بعناية عند تكبير 15 إلى 20x تقريبا. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يعزز الماء المتساقط رؤية التجويف.
- أمسك التجويف الكهروضوئي برفق وقم بإخراجه من خلال الكفة.
- بمجرد إخراجه بالكامل ، قم بتثبيته بربط مزدوج باستخدام 8-0 خيط حريري على طول أخدود الكفة (الشكل 4C ، D).
ملاحظة: تأكد من أن الرباط ليس فضفاضا. احرص أيضا على ألا تكون نقطة الرباط كبيرة جدا ، لأنها قد تتداخل مع إدخال الكفة. يمكن وضع نقطة الرباط في أي اتجاه. - قم بتوصيل الكفة ب IHIVC باستخدام إجراء مشابه لتلك المستخدمة في PV (الشكل 4E).
ملاحظة: عند تثبيت IHIVC مع الكفة ، تجنب العض في حمة الكبد. نظرا لأن الرقبة أقصر من الكهروضوئية ، حدد موضع التثبيت بعناية. - قم بإنشاء عقدة منزلقة عن طريق تمرير الخيط حول قاعدة IHIVC لربط IHIVC مؤقتا (الشكل 5). ستتم إزالة هذا الخيط بعد إعادة التروية.
4. إعادة بناء الوريد البابي
- تخدير الفأر المتلقي عن طريق إحداث التخدير باستخدام الأيزوفلوران بنسبة 2.5٪ وتقليله إلى 0.6٪ قبل استخراج الكبد الأصلي كما هو موضح في الأدبيات المنشورة2. قم بإصابة المنطقة الجراحية ثلاث مرات على الأقل بجولات متناوبة من اليودوفور و 70٪ من الإيثانول قبل فتح البطن.
- تأكد من أن الفص الكبدي في وضع صحيح وأن الكهروضوئية المقيدة خالية من الالتواء والالتواء.
- أمسك الحافة الكهروضوئية للمستلم برفق باستخدام ملقط Pean وقم بتثبيته بملزمة.
ملاحظة: في هذه المقالة ، تشير الملزمة إلى جهاز ميكانيكي يستخدم لتأمين ملقط الفول على الطاولة. لمزيد من المعلومات حول الملزمة ، انظر جدول المواد. - ضع مشبكا وعائيا على PV للمتلقي وقم بتمرير 8-0 خيط الحرير حوله.
- قم بإنشاء قسم محيطي 1/4 حوالي 0.5 مم من الحافة الكهروضوئية (الشكل 6 أ). قم بتكبير الفتحة أثناء تمرير محلول ملحي عبر التجويف باستخدام أداة متخصصة (إبرة 27 جم مع قطع الطرف وثنيه على شكل حرف L).
- استخدم ملقط مستقيم للإمساك بمقبض الكفة وإدخاله في التجويف.
- بمجرد إدخالها بالكامل ، قم بتأمين الكفة ب 8-0 خيط الحرير. ربط واحد يكفي للتثبيت.
- إزالة المشبك الوعائي وإعادة تغذية الكبد.
- حرر ملقط البازلاء بعناية وأكمل إعادة بناء الوريد البابي. يجب أن تستغرق عملية إعادة بناء الكهروضوئية بأكملها حوالي 5 دقائق.
5. إعادة بناء الوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي
- ضع فص الكبد بشكل مناسب وحرك ملقط البازلاء المتصل بظهرية IHIVC المتلقية إلى الفص السفلي الأيمن للطعم ، وقم بتثبيته بملزمة.
- تخلص من أي أنسجة كبد متبقية حول IVIHC للمتلقي عن طريق فركه برفق بقطعة قطن.
- تمرير 8-0 خيط حريري حول IVIHC الخاص بالمستلم.
- قم بإنشاء قسم محيطي 1/4 على بعد 0.5 مم تقريبا من حافة IVIHC للمستلم (الشكل 6B).
- بعد إدخال محلول ملحي طبيعي في التجويف ، أدخل الكفة في التجويف.
ملاحظة: بسبب الرقبة القصيرة ، غالبا ما يتم إدخال الكفة بشكل سطحي أكثر من الكهروضوئية. - تأمين الكفة بعناية مع 8-0 خيط الحرير ثم قم بإزالة المشبك الوعائي وملقط البازلاء.
6. رعاية ما بعد الجراحة
- استخدم وسادة التدفئة ومصباح التدفئة لتسهيل التعافي بعد العملية الجراحية.
- مراقبة ضغط الدم ومعدل ضربات القلب ومعدل التنفس ودرجة حرارة الجسم باستمرار ، وكذلك استهلاك الطعام والماء.
- حقن أدمينسيتر تحت الجلد من كاربروفين (5 ملغ/كغ، كل 6 ساعات أو حتى الحاجة) لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. اتبع الإرشادات المؤسسية المحلية.
ملاحظة: إذا تدهورت حالة الفئران ، إيقاف التجربة على الفور وتم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. - لجمع عينة الأنسجة ، أعد تخدير الفئران والقتل الرحيم بطريقة معتمدة من IACUC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تنجح إعادة البناء الكهروضوئية عندما لا يكون هناك تعرج عند فك الوريد البابي ، ويتم ترشيح الكبد بشكل موحد. يجب أن يكون وقت الكبد أقل من 20 دقيقة ، لأن الأوقات الكبدية التي تتجاوز 25 دقيقة تزيد من خطر وفاة الفئران. تعتبر إعادة بناء IHIVC ناجحة إذا لم يكن هناك قلس دم من الكسب غير المشروع.
يؤدي تخزين الكسب غير المشروع في درجات حرارة باردة لمدة 1 ساعة باستخدام محلول الحفاظ على الأعضاء إلى مستوى مصل ألانين أمينوترانسفيراز يبلغ حوالي 2000 وحدة / لتر عند 6 ساعات بعد إعادة الإرواء (الشكل 7 أ). معدل البقاء على قيد الحياة هو 100 ٪ في 7 أيام بعد الزرع (الشكل 7B). ومع ذلك ، في نموذجنا بدون مفاغرة الشريان الكبدي ، قد تستسلم الفئران المتلقية للمشاكل المتعلقة بالورم البيلوما داخل الكبد بعد حوالي 30 يوما من الزرع
الشكل 1: أدوات إعادة بناء الأوعية الدموية. يتم استخدام ملقط مستقيم أو منحني حسب الحاجة للحالة ومجال المنطوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المجهر. تم تجهيز المجهر بعدسة موضوعية بتكبير 10x وعدسة عدسة بتكبير 0.8x على الأقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحضير الكفة. (أ) الكفة لل PV و IHIVC. (ب) تمثيل تخطيطي لعملية إنشاء أخدود على الكفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مرفق الكفة. (أ) يتم تمرير الخيط المتصل بالكهروضوئية إلى الكفة. ( ب) إعداد الصك لربط الكفة. (ج) تأمين الكفة بنتيجة 8-0 روابط الحرير. (د) رسم تخطيطي للإخراج الوعائي وتثبيته في الكفة. (ه) مرفق الكفة المكتمل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الربط المؤقت لجذر IHIVC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: إعادة بناء الأوعية الدموية. يوضح هذا الرسم التوضيحي مواقع إنشاء ثقوب ل (أ) الكهروضوئية و (ب) IHIVC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نتائج ما بعد الجراحة. (أ) مستويات مصل الألانين أمينوترانسفيراز (ALT) عند 6 ساعات بعد إعادة التروية. CIT ، الوقت الإقفاري البارد. تكساس ، زرع. ص < 0.0001. (ب) بقاء المتلقي على قيد الحياة بعد ذوبان الذرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعلم إعادة بناء الأوعية الدموية هو الجانب الأكثر تحديا لتحقيق نجاح MOLT. تؤثر جودة الكفة بشكل كبير على صعوبة إعادة الإعمار ، نظرا لصغر حجم الفئران5. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لإعداد الكفة وتعلقها وإعادة بنائها.
على الرغم من عدم وجود اختلافات كبيرة عن التقارير السابقة فيما يتعلق بإعداد الكفة والاتصال 2,5 ، إلا أنه يجب مراعاة بعض النقاط الثانوية. أولا ، يجب أن يقتصر سمك مقبض الكفة على حوالي 1/6 من المحيط الكلي. إذا كان رفيعا جدا ، يمكن أن ينحني المقبض بسهولة ويصبح من الصعب الإمساك به. إذا كان سميكا جدا ، فقد يكون من الصعب التعامل معه في بطن المتلقي. من الضروري تحديد تفضيلاتك الشخصية في وقت مبكر.
ثانيا ، تعد رؤية التجويف على الطاولة الخلفية أمرا بالغ الأهمية. يتم استخدام خيط نايلون 10-0 ، متصل بالوريد الطحال للمتبرع كمعلم لتأكيد التجويف الكهروضوئي. يتم وضع خيط النايلون عند موضع الساعة 8 لمنع الالتواء المفرط. يتم إخراج جدار الوعاء عن طريق إمساكه عند الساعة 3 والساعة 9 بملقطين والضغط عليه على جدار الكفة عند الساعة 6. التثبيت مع 8-0 خيط الحرير يتطلب حركات دقيقة. يتم تحقيق التثبيت الكافي من خلال تثبيته في الأخدود. بعد التثبيت ، ارفع الكفة للتأكد من أنها لا تؤتي ثمارها.
ثالثا ، أثناء إعادة الإعمار ، من المهم عدم إنشاء ثقب كبير جدا في الوعاء المتلقي لأن الثقب يتوسع بشكل طبيعي عند إدخال الكفة. يمكن أن يؤدي عمل ثقب كبير إلى انقسام الوعاء ، وهو السبب الأكثر شيوعا للفشل. خاصة في إعادة بناء IHIVC ، يجب عمل ثقوب أصغر لأن الطول الأقصر ل IHIVC يجعل من السهل الانسحاب من الكهروضوئية. عند تمرير محلول ملحي عبر التجويف ، ادعم إدخال الكفة عن طريق تطبيق قوة تصاعدية بدلا من الأسفل.
تمت مناقشة الأسباب الشائعة للفشل والاحتياطات بالتفصيل. تشمل النقاط الأكثر أهمية ضمان رؤية واضحة لتجويف الوعاء الداخلي وتجنب القوة غير الضرورية أثناء إدخال الكفة لمنع انقسام الوعاء. يعتقد أن هذه النصائح الفنية لطريقة الكفة ترفع المهارات وتقدم البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي مؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال البحث الأساسي JST لعام 2022 (الجمعية اليابانية للزرع).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
