Summary
このプロトコルは、マウス同所性肝移植におけるカフ技術を使用した血管再建のための技術情報を提供します。
Abstract
マウス同所性肝移植は、肝虚血や再灌流障害の根底にあるメカニズムを調べるための有効な方法論です。しかし、技術的な課題は、この貴重な実験モデルを活用し、これらのスキルを次世代に継承する上での障壁となっています。この手順の最も困難な側面は、門脈 (PV)、下肝下大静脈 (IHIVC)、および下大静脈上を含む血管再建です。縫合糸ではなくプラスチック製のカフを使用することで、PVやIHIVCの再建をよりスムーズに行うことができます。静脈カテーテルで作ったカフを移植血管の先端に取り付け、カフをレシピエント血管に介在させることで血管を再構築します。最も重要な2つの側面は、血管の内腔を適切に視覚化することと、過度の力の使用を避けることです。私たちの目的は、レシピエント手術におけるカフ技術を使用した血管再建の技術的概要を提供することです。カフ技術に関するこれらの技術的ヒントは、顕微外科医が血管再建を容易にし、研究を前進させるのに役立つと期待されています。
Introduction
マウス同所性肝移植(MOLT)は、1991年に最初に報告された効果的な実験方法です1。遺伝子改変マウスや各種研究用試薬を用いたこの実験モデルは、温冷虚血や再灌流障害の研究に重要な役割を果たしてきました。しかし、このモデルの高い技術的複雑さは、肝移植のための基礎医学の開発を妨げてきました2。MOLTは、(1)ドナーマウスからの肝臓の回収、(2)バックテーブル手術、(3)レシピエントへの肝臓移植の3つの主要なステップから成ります。これらのレシピエント手順の中で、血管吻合は最大の課題をもたらします。下大静脈上吻合は通常、手縫い2で完了しますが、下肝下大静脈(IHIVC)と門脈(PV)は、手縫いの縫合の代わりにプラスチック製の袖口を使用してより効率的に再建できます。
無肝期は、レシピエントの天然肝臓の除去と移植片の移植片の移植の間の間隔を意味します。一貫した結果を得るには、無肝時間を20分未満に制限することが不可欠です。その結果、このモデルを採用した研究は、特定の機関に限定されている3,4,5,6,7,8,9。MOLTの様々な段階の中で、PVとIHIVCのスムーズな再建を実現することは、無肝時間を最小化し、移植を成功させるために重要です。
PVおよびIVC再建は、手縫い縫合糸2,5,8と比較して、カフ技術が血管吻合を簡素化するため、一般に血管カフを使用して行われます。血管カフの準備とカフの確実な取り付けに関連する技術は、レシピエントの血管再建の複雑さに大きな影響を与えます。私たちの目的は、カフ法に関連する多くの技術的なヒントを詳細に視覚的に指導し、それによって学習曲線を短縮することです。これらのビデオ クリップは、カフを血管に取り付け、レシピエント手術中に PV と IHIVC を再構築する方法を明確に理解します。
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Protocol
この実験計画書は、京都大学の動物実験委員会で承認されました。この研究では、市販の供給源から入手した、10週間齢以上、体重25gから30gのC57BL/6マウスを利用しました( 「材料の表」を参照)。すべての動物に2.5%イソフルランを麻酔し(施設で承認されたプロトコルに従って)、特定の病原体を含まない条件下で維持し、すべての実験手順は京都大学の動物実験規則に準拠して実施されました。研究に使用された適切な機器は、 材料表 にリストされ、 図1 と 図2に示されています。
1.動物の選択
- 体重25〜30 gのマウスを使用してください。
注: マウス肝臓同種移植片2 は、主要な組織適合遺伝子複合体障壁を越えて一般に受け入れられていますが、この研究では、寒冷虚血再灌流障害10 の詳細なメカニズムに焦点を当てるために、同系 MOLT モデルを選択しました。体重が25g未満のマウスは、薄い胆管にインナーステントを挿入できないため、推奨されません。同様に、体重が30 gを超えるマウスは、血管の周囲に大量の腹腔内脂肪が存在するため、推奨されません。
2.袖口作り
- PVとIHIVC用にそれぞれ20Gと16Gの静脈カテーテルを準備します。
- メスを使ってカテーテルを切ってカフを作ります。袖口の本体の長さは2 mm、延長ハンドルは1 mmである必要があります(図3A)。
注意: ハンドルが大きすぎると、袖口の挿入が困難になる場合があります。 - 袖口の表面に、メスの刃の裏側を使用して糸を固定するための浅い溝を作成します。
注意: メスの刃の裏側を袖口に当てるときは、刃の先端が約60度の角度になっていることを確認してください( 図3Bを参照)。最初の溝を作ったら、メスの刃を固定し、袖口を回転させます。理想的には2つの溝が推奨されますが、1つの溝でも問題なく十分です。
3.袖口アタッチメント
- プラスチック製の長方形の容器に、小さな角氷を置き、その上に小さな金属製のカップ(直径6cm)を置きます。カップに臓器保存液( 材料の表を参照)を入れ、その中に同系移植片を置きます。
- 綿棒を使用して同系肝移植片(別のドナーマウスから抽出)を穏やかに転がし、肝門が上を向くようにします。IVCの内腔に溜まった血液を臓器保存液で完全に除去します。
- たとえば、脾臓静脈に取り付けられた糸を使用して、PVを袖口に通します( 図4Aを参照)。
- カフハンドルを12時の位置にして、ハンドルとカフの両方をブルドッグclで固定しますamp ( 材料の表を参照)、PVの端から2〜3mmの位置に配置します。
- 大きな血管鉗子と固定型を使用してブルドッグクランプをさらに固定し、術野を確立します( 図4Bを参照)。
- PVルーメンを約15〜20倍の倍率で注意深く検査します。必要に応じて、水を滴下すると、内腔の視認性を高めることができます。
- PVルーメンをそっとつかみ、カフを通して外在化します。
- 完全に外部化されたら、8-0 を使用して二重結紮で固定します。袖口の溝に沿った絹糸(図4C、D)。
注:結紮糸が緩んでいないことを確認してください。また、結紮点が大きすぎるとカフ挿入の邪魔になることもあるので注意が必要です。結紮点は任意の方向に配置できます。 - PVに使用したのと同様の手順を使用して、カフをIHIVCに取り付けます(図4E)。
注意: IHIVCをカフで固定するときは、肝実質に噛まないようにしてください。PVよりネックが短いので、クランプ位置を慎重に決めてください。 - IHIVCの基部に糸を通し、IHIVCを一時的に合字させることで、スリップノットを作成します(図5)。この糸は再灌流後に除去されます。
4. 門脈再建
- イソフルランを2.5%で麻酔を誘発し、それを0.6%に減らしてから、公開された文献2に記載されているように、天然の肝臓を抽出します。開腹術の前に、ヨードフォアと70%エタノールを交互に繰り返して手術部位を少なくとも3回消毒します。
- 肝葉が適切に配置され、カフ付きPVにねじれやねじれがないことを確認してください。
- ピーン鉗子を使用して受信者のPVエッジをそっとつかみ、万力で固定します。
注:この記事では、万力とは、ペアン鉗子をテーブルに固定するために使用される機械装置を指します。万力の詳細については、 材料の表を参照してください。 - レシピエントのPVに血管クランプを適用し、8-0を渡しますその周りの絹糸。
- PVエッジから約1mmの円周セクションを0.5mm作成します(図6A)。専用の器具(先端を切り取り、L字型に曲げた27Gの針)を使用して、生理食塩水を内腔に通しながら穴を拡大します。
- まっすぐな鉗子を使用してカフハンドルをつかみ、内腔に挿入します。
- 完全に挿入したら、カフを8-0で固定します。絹糸。固定には1回の結紮で十分です。
- 血管クランプを取り外し、肝臓を再灌流します。.
- ピーン鉗子を慎重に離し、門脈再建を完了します。PVの再構築プロセス全体には約5分かかります。
5. 下大静脈下再建
- 肝葉を適切に配置し、レシピエントIHIVC背側に取り付けられたピーン鉗子を移植片の右下葉に動かし、万力で固定します。
- レシピエントのIVIHCの周囲に残っている肝臓組織を、綿棒で優しくこすって取り除きます。
- 8-0で合格受信者のIVIHCの周りの絹糸。
- レシピエントのIVIHCエッジから約1mmに4/0.5円周セクションを作成します(図6B)。
- 通常の生理食塩水を内腔に導入した後、カフを内腔に挿入します。
注:首が短いため、袖口はPVよりも浅く挿入されることがよくあります。 - 8-0で袖口を慎重に固定します絹糸を通し、血管クランプとピーン鉗子を取り外します。
6.術後ケア
- 加熱パッドと加温ランプを利用して、術後の回復を促進します。
- 血圧、心拍数、呼吸数、体温、および食物と水の消費量を継続的に監視します。
- 術後の痛みを軽減するためのカルプロフェンの皮下注射(5 mg / kg、6時間ごとまたは必要になるまで)を投与します。地域の機関のガイドラインに従ってください。
注:マウスの状態が悪化した場合、実験は直ちに中止され、マウスは二酸化炭素の吸入によって安楽死させられました。 - 組織サンプルを採取するには、マウスを再麻酔し、IACUC承認の方法で安楽死させます。
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Representative Results
PV再建は、門脈のクランプを外したときに曲がりくねった状態がなく、肝臓が均一に灌流されている場合に成功します。無肝時間が25分を超えるとマウスの死亡リスクが高まるため、無肝時間は20分未満にする必要があります。IHIVCの再建は、移植片からの血液逆流がない場合、成功したと見なされます。
臓器保存溶液を使用して移植片を低温で1時間保存すると、再灌流後6時間で血清アラニンアミノトランスフェラーゼレベルが約2,000 U / Lになります(図7A)。移植後7日での生存率は100%です(図7B)。ただし、肝動脈吻合のないモデルでは、レシピエントマウスは移植後約30日で肝内結葉腫関連の問題に屈する可能性があります
図1:血管再建用器具。 直線または湾曲した鉗子は、状況や術野に応じて必要に応じて使用されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:顕微鏡。 顕微鏡には、倍率10倍の対物レンズと、倍率0.8倍以上の接眼レンズが装備されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:カフの準備(A)PVとIHIVCのカフ。(B)袖口に溝を作る工程の概略図。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:カフの取り付け (A) PVに取り付けられた糸をカフに通す。(B)カフ取り付け用の機器のセットアップ。(C)8-0でカフを固定する絹の結紮。(D)血管の外部化とカフへの固定の概略図。(E)完成した袖口取り付け。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5:IHIVCルートの一時的な結紮 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6:血管再建。 この図は、(A) PV と (B) IHIVC の穴を作成する位置を示しています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図7:術後の結果 (A)再灌流後6時間でのアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血清レベル。CIT、寒冷虚血時間;Tx、移植。p < 0.0001 です。(B) MOLT後の受領者の生存 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
血管再建を学ぶことは、MOLTを成功させるための最も困難な側面です。カフの品質は、マウスのサイズが小さいことを考えると、再建の難しさに大きく影響します5。この記事では、カフの準備、取り付け、および再建の詳細なプロトコルを提供します。
カフの準備と接続に関する以前のレポートと大きな違いはありませんが、いくつかのマイナーな点を考慮する必要があります2,5。まず、袖口のハンドルの厚さは、全周の約1/6に制限する必要があります。薄すぎると、ハンドルが曲がりやすく、つかみにくくなります。厚すぎると、レシピエントの腹部での取り扱いが難しい場合があります。早い段階で自分の好みを特定することが不可欠です。
第二に、バックテーブルの内腔の視認性が重要です。10-0ナイロン糸が使用され、PVルーメンを確認するためのランドマークとしてドナーの脾臓静脈に取り付けられています。ナイロン糸を8時位置に配置し、過度のねじれを防ぎます。血管壁は、3時と9時位置を2本の鉗子で掴み、6時位置のカフス壁に押し付けることで外在化。8-0で固定絹糸は慎重な動きが必要です。溝に固定することで十分な固定が達成されます。取り付け後、カフを持ち上げて外れないことを確認します。
第三に、再建中は、カフを挿入すると穴が自然に大きくなるため、レシピエント血管に大きな穴を開けすぎないことが重要です。大きな穴を開けると、故障の最も一般的な原因である血管の裂け目につながる可能性があります。特にIHIVCの復元では、PVよりもIHIVCの方が長さが短いため、穴を小さくする必要があります。生理食塩水を内腔に通すときは、下向きではなく上向きの力を加えてカフの挿入をサポートします。
失敗の一般的な原因と注意事項について詳しく説明しました。最も重要なポイントは、血管内腔の明確な視覚化を確保し、血管の裂け目を防ぐためにカフ挿入中に不要な力を避けることです。カフ法に関するこれらの技術的なヒントは、スキルを高め、研究を前進させると考えられています。
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Disclosures
開示すべき利益相反のある著者はいません。
Acknowledgments
本研究は、2022年度JST基礎研究(日本移植学会)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
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