Summary
Este protocolo fornece informações técnicas para a reconstrução de vasos usando a técnica do manguito no transplante hepático ortotópico de camundongos.
Abstract
O transplante hepático ortotópico de camundongos é uma metodologia eficaz para investigar os mecanismos subjacentes da isquemia hepática e lesão de reperfusão. No entanto, os desafios técnicos representam uma barreira para a utilização desse valioso modelo experimental e a transmissão dessas habilidades para a próxima geração. O aspecto mais desafiador desse procedimento é a reconstrução vascular, incluindo a veia porta (VP), a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC) e a veia cava inferior supra-hepática. O uso de manguitos de plástico, em vez de suturas, permite uma reconstrução mais suave da VP e da IHIVC. Os vasos são reconstruídos anexando um manguito feito de um cateter intravenoso à ponta do vaso do enxerto e interpondo o manguito no vaso receptor. Os dois aspectos mais cruciais são visualizar adequadamente o lúmen interno do vaso e evitar o uso de força excessiva. Nosso objetivo é fornecer uma visão geral técnica das reconstruções vasculares usando a técnica do manguito na cirurgia do receptor. Espera-se que essas dicas técnicas para a técnica do manguito ajudem os microcirurgiões a facilitar a reconstrução vascular e avançar em suas pesquisas.
Introduction
O transplante hepático ortotópico de camundongo (MOLT) é um método experimental eficaz relatado pela primeira vez em 19911. Este modelo experimental, que utiliza camundongos geneticamente modificados e vários reagentes de pesquisa, desempenhou um papel fundamental na investigação de lesões de isquemia e reperfusão quentes e frias. No entanto, a alta complexidade técnica do modelo tem dificultado o desenvolvimento da medicina básica para transplante hepático2. O MOLT envolve três etapas principais: (1) recuperação do fígado do camundongo doador, (2) cirurgia na mesa dorsal e (3) implantação do fígado no receptor. Dentre esses procedimentos receptores, a anastomose vascular representa o maior desafio. Enquanto a anastomose da veia cava inferior supra-hepática é tipicamente completada por costura à mão2, a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC) e a veia porta (PV) podem ser reconstruídas de forma mais eficiente usando manguitos de plástico no lugar de suturas costuradas à mão.
O período anepático significa o intervalo entre a remoção do fígado nativo do receptor e o implante do enxerto. Para garantir resultados consistentes, é imperativo limitar o tempo anepático a menos de 20 min. Consequentemente, os estudos que empregam esse modelo têm sido confinados a instituições específicas 3,4,5,6,7,8,9. Entre os vários estágios do MOLT, a reconstrução suave de PV e IHIVC é crucial para minimizar o tempo anepático e garantir o sucesso do transplante.
A reconstrução da VP e da VCI é geralmente realizada com manguitos vasculares, uma vez que a técnica do balonete simplifica a anastomose vascular em comparação com as suturas costuradas à mão 2,5,8. A técnica envolvida na preparação do manguito vascular e na fixação segura do manguito afeta significativamente a complexidade da reconstrução vascular do receptor. Nosso objetivo é fornecer orientação visual detalhada para inúmeras dicas técnicas relacionadas ao método do manguito, reduzindo assim a curva de aprendizado. Esses videoclipes fornecerão uma compreensão clara de como prender o manguito aos vasos e reconstruir o PV e o IHIVC durante a cirurgia do receptor.
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Protocol
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Kyoto. O estudo utilizou camundongos C57BL/6, com idade superior a 10 semanas e peso entre 25 g e 30 g, obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os animais foram anestesiados com isoflurano a 2,5% (seguindo protocolos aprovados institucionalmente), mantidos em condições específicas livres de patógenos, e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em conformidade com o Regulamento de Experimentação Animal da Universidade de Kyoto. Os instrumentos apropriados utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais e representados na Figura 1 e na Figura 2.
1. Seleção de animais
- Use ratos com um peso corporal de 25-30 g.
NOTA: Embora os aloenxertos de fígado de camundongo2 sejam geralmente aceitos através da barreira do complexo principal de histocompatibilidade, optamos pelo modelo MOLT singênico neste estudo para focar no mecanismo detalhado da lesão de reperfusão de isquemia fria10. Camundongos com peso inferior a 25 g não são recomendados porque é impossível inserir um stent interno em um ducto biliar fino. Da mesma forma, camundongos com peso superior a 30 g não são recomendados devido à presença de uma grande quantidade de gordura intra-abdominal ao redor dos vasos.
2. Fabricação de manguitos
- Prepare cateteres intravenosos de 20 G e 16 G para PV e IHIVC, respectivamente.
- Usando um bisturi, corte o cateter para criar o manguito. O corpo principal do manguito deve medir 2 mm de comprimento, com uma alça de extensão de 1 mm (Figura 3A).
NOTA: Se a alça for muito grande, pode ser um desafio inserir o manguito. - Na superfície do manguito, crie uma ranhura rasa para fixação da linha usando a parte de trás da lâmina do bisturi.
NOTA: Ao aplicar a parte de trás da lâmina do bisturi no manguito, certifique-se de que a ponta da lâmina esteja em um ângulo de aproximadamente 60 graus (conforme mostrado na Figura 3B). Depois de fazer a primeira ranhura, prenda a lâmina do bisturi e gire o manguito. Idealmente, duas ranhuras são recomendadas, mas uma única ranhura pode ser suficiente sem problemas.
3. Fixação do manguito
- Em um recipiente de plástico retangular, coloque pequenos cubos de gelo e posicione um pequeno copo de metal (6 cm de diâmetro) por cima. Encha o copo com fluido de preservação de órgãos (consulte a Tabela de Materiais) e coloque o enxerto singênico dentro.
- Role suavemente o enxerto de fígado singênico (extraído de outro camundongo doador) usando um cotonete, garantindo que a porta hepática esteja voltada para cima. Remova completamente qualquer sangue armazenado no lúmen da VCI com fluido de preservação de órgãos.
- Passe o PV pelo manguito usando um fio preso, por exemplo, à veia esplênica (ver Figura 4A).
- Com a alça do manguito na posição de 12 horas, prenda a alça e o manguito com um bulldog clamp (consulte a Tabela de Materiais), posicionando-o a 2 a 3 mm da borda PV.
- Prenda ainda mais a pinça bulldog usando uma pinça vascular grande e um molde de fixação para estabelecer o campo operatório (ver Figura 4B).
- Inspecione cuidadosamente o lúmen PV com ampliação de aproximadamente 15 a 20x. Se necessário, o gotejamento de água pode aumentar a visibilidade do lúmen.
- Segure suavemente o lúmen PV e exteriorize-o através do manguito.
- Uma vez totalmente exteriorizado, prenda-o com uma ligação dupla usando 8-0 fio de seda ao longo da ranhura do manguito (Figura 4C,D).
NOTA: Certifique-se de que a ligadura não esteja solta. Além disso, tome cuidado para que o ponto de ligadura não seja muito grande, pois pode interferir na inserção do manguito. O ponto de ligadura pode ser posicionado em qualquer direção. - Fixe o manguito ao IHIVC usando um procedimento semelhante ao usado para o VP (Figura 4E).
NOTA: Ao pinçar o IHIVC com o manguito, evite morder o parênquima hepático. Como o pescoço é mais curto que o PV, determine cuidadosamente a posição de fixação. - Crie um nó corrediço passando a linha ao redor da base do IHIVC para ligar temporariamente o IHIVC (Figura 5). Este fio será removido após a reperfusão.
4. Reconstrução da veia porta
- Anestesiar o camundongo receptor induzindo anestesia com isoflurano a 2,5% e reduzi-lo para 0,6% antes de extrair o fígado nativo, conforme descrito na literatura publicada2. Dinsinfectar a área cirúrgica pelo menos três vezes com rodadas alternadas de iodóforo e etanol a 70% antes da laparotomia.
- Certifique-se de que o lobo hepático esteja posicionado corretamente e que o PV balonetado esteja livre de dobras e torções.
- Segure suavemente a borda PV do receptor usando uma pinça Pean e prenda-a com um torno.
NOTA: Neste artigo, um torno refere-se a um aparelho mecânico usado para prender a pinça de Pean na mesa. Para obter mais informações sobre o torno, consulte Tabela de materiais. - Aplique uma pinça vascular no PV do receptor e passe um 8-0 fio de seda em torno dele.
- Crie uma seção circunferencial de 1/4 a aproximadamente 0,5 mm da borda PV (Figura 6A). Amplie o orifício enquanto passa a solução salina pelo lúmen usando um instrumento especializado (uma agulha de 27 G com a ponta cortada e dobrada em forma de L).
- Use uma pinça reta para segurar a alça do manguito e insira-a no lúmen.
- Uma vez totalmente inserido, prenda o manguito com um 8-0 fio de seda. Uma única ligadura é suficiente para a fixação.
- Remova o grampo vascular e reperfunda o fígado.
- Solte cuidadosamente a pinça de Pean e conclua a reconstrução da veia porta. Todo o processo de reconstrução do PV deve levar aproximadamente 5 min.
5. Reconstrução da veia cava inferior infra-hepática
- Posicione o lobo do fígado adequadamente e mova a pinça de Pean presa ao receptor IHIVC dorsal para o lobo inferior direito do enxerto, prendendo-o com um torno.
- Elimine qualquer tecido hepático remanescente ao redor do IVIHC do receptor esfregando suavemente com um cotonete.
- Passe um 8-0 fio de seda ao redor do IVIHC do destinatário.
- Crie uma seção circunferencial de 1/4 a aproximadamente 0.5 mm da borda IVIHC do receptor (Figura 6B).
- Depois de introduzir solução salina normal no lúmen, insira o manguito no lúmen.
NOTA: Devido ao pescoço curto, o manguito é frequentemente inserido de forma mais superficial do que no PV. - Prenda cuidadosamente o manguito com um 8-0 fio de seda e, em seguida, remova a braçadeira vascular e a pinça Pean.
6. Cuidados pós-operatórios
- Utilize uma almofada de aquecimento e uma lâmpada de aquecimento para facilitar a recuperação pós-operatória.
- Monitore continuamente a pressão arterial, frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura corporal, bem como o consumo de alimentos e água.
- Administre injeção subcutânea de carprofeno (5 mg / kg, a cada 6 h ou até que seja necessário) para aliviar a dor pós-operatória. Siga as diretrizes institucionais locais.
NOTA: Se a condição dos camundongos se deteriorar, o experimento será interrompido imediatamente e os camundongos serão sacrificados por inalação de dióxido de carbono. - Para coletar a amostra de tecido, reanestesiar os camundongos e sacrificá-los por um método aprovado pela IACUC.
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Representative Results
A reconstrução da VP é bem-sucedida quando, ao despinçar a veia porta, não há tortuosidade e o fígado é perfundido uniformemente. O tempo anepático deve ser inferior a 20 min, pois tempos anepáticos superiores a 25 min aumentam o risco de mortalidade em camundongos. A reconstrução da IHIVC é considerada bem-sucedida se não houver regurgitação sanguínea do enxerto.
O armazenamento do enxerto em temperaturas frias por 1 h com solução de preservação de órgãos resulta em um nível sérico de alanina aminotransferase de aproximadamente 2.000 U/L 6 h após a reperfusão (Figura 7A). A taxa de sobrevida é de 100% em 7 dias após o transplante (Figura 7B). No entanto, em nosso modelo sem anastomose da artéria hepática, os camundongos receptores podem sucumbir a problemas relacionados ao biloma intra-hepático aproximadamente 30 dias após o transplante
Figura 1: Instrumentos para reconstrução vascular. Pinças retas ou curvas são usadas conforme necessário para a situação e o campo operatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O microscópio. O microscópio está equipado com uma lente objetiva com ampliação de 10x e uma lente ocular com ampliação de pelo menos 0,8x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Preparação do manguito. (A) O manguito para o PV e IHIVC. (B) Uma representação esquemática do processo de criação de uma ranhura no manguito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fixação do manguito. (A) A rosca presa ao PV é passada para o manguito. (B) Configuração do instrumento para fixação do manguito. (C) Protegendo o manguito com 8-0 ligaduras de seda. (D) Ilustração esquemática da exteriorização vascular e fixação ao manguito. (E) Fixação completa do manguito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ligação temporária da raiz IHIVC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Reconstrução vascular. Esta ilustração mostra os locais para criar furos para (A) PV e (B) IHIVC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Resultados pós-operatórios. (A) Níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT) 6 h após a reperfusão. CIT, tempo isquêmico frio; Tx, transplante. p < 0,0001. (B) Sobrevivência do receptor após MOLT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aprender a reconstrução vascular é o aspecto mais desafiador para alcançar o MOLT bem-sucedido. A qualidade do manguito influencia significativamente na dificuldade de reconstrução, dado o pequeno tamanho dos camundongos5. Este artigo fornece um protocolo detalhado para preparação, fixação e reconstrução do manguito.
Embora não haja grandes diferenças em relação aos relatos anteriores em relação à preparação e conexão do manguito 2,5, alguns pontos menores devem ser considerados. Primeiro, a espessura da alça do manguito deve ser limitada a aproximadamente 1/6 da circunferência total. Se for muito fino, a alça pode dobrar facilmente e se tornar difícil de segurar. Se for muito grosso, pode ser difícil manusear no abdômen do receptor. Identificar sua preferência pessoal desde o início é essencial.
Em segundo lugar, a visibilidade do lúmen na mesa de trás é crucial. Um fio de náilon 10-0 é usado, preso à veia esplênica do doador como um ponto de referência para confirmar o lúmen do VP. O fio de nylon é colocado às 8 horas para evitar torção excessiva. A parede do vaso é exteriorizada segurando-a às 3 horas e 9 horas com duas pinças e pressionando-a contra a parede do manguito às 6 horas. Fixação com 8-0 O fio de seda requer movimentos cuidadosos. A fixação adequada é obtida prendendo-o na ranhura. Após a fixação, levante a braçadeira para confirmar que ela não sai.
Terceiro, durante a reconstrução, é importante não criar um orifício muito grande no vaso receptor, porque o orifício aumenta naturalmente à medida que o manguito é inserido. Fazer um buraco grande pode levar à divisão do vaso, a causa mais comum de falha. Particularmente na reconstrução do IHIVC, furos menores devem ser feitos, pois o comprimento mais curto do IHIVC facilita a retirada do que um PV. Ao passar solução salina pelo lúmen, apoie a inserção do manguito aplicando força para cima em vez de para baixo.
Causas comuns de falha e precauções foram discutidas em detalhes. Os pontos mais cruciais incluem garantir uma visualização clara do lúmen do vaso interno e evitar força desnecessária durante a inserção do manguito para evitar a divisão do vaso. Acredita-se que essas dicas técnicas para o método do manguito elevem as habilidades e avancem na pesquisa.
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Disclosures
Nenhum autor tem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela pesquisa básica JST 2022 (Sociedade Japonesa de Transplante).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
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