Summary
Denne protokol giver teknisk information til rekonstruktion af kar ved hjælp af manchetteknikken i ortotopisk levertransplantation hos mus.
Abstract
Ortopisk levertransplantation med mus er en effektiv metode til undersøgelse af de underliggende mekanismer for leveriskæmi og reperfusionsskade. De tekniske udfordringer udgør dog en barriere for at udnytte denne værdifulde eksperimentelle model og videregive disse færdigheder til næste generation. Det mest udfordrende aspekt af denne procedure er vaskulær rekonstruktion, herunder portalvenen (PV), infrahepatisk ringere vena cava (IHIVC) og suprahepatisk ringere vena cava. Brugen af plastikmanchetter, snarere end suturer, giver mulighed for glattere PV og IHIVC rekonstruktion. Beholderne rekonstrueres ved at fastgøre en manchet fremstillet af et intravenøst kateter til spidsen af transplantatbeholderen og indsætte manchetten i modtagerbeholderen. De to mest afgørende aspekter er korrekt visualisering af fartøjets indre lumen og undgå brug af overdreven kraft. Vores mål er at give et teknisk overblik over vaskulære rekonstruktioner ved hjælp af manchetteknikken i modtagerkirurgi. Disse tekniske tips til manchetteknikken forventes at hjælpe mikrokirurger med at lette vaskulær rekonstruktion og fremme deres forskning.
Introduction
Ortopisk levertransplantation med mus (MOLT) er en effektiv eksperimentel metode, der først blev rapporteret i 19911. Denne eksperimentelle model, der udnytter genetisk modificerede mus og forskellige forskningsreagenser, har spillet en afgørende rolle i undersøgelsen af varm og kold iskæmi og reperfusionsskader. Modellens høje tekniske kompleksitet har imidlertid hindret udviklingen af basismedicin til levertransplantation2. MOLT involverer tre hovedtrin: (1) hentning af leveren fra donormusen, (2) bagbordskirurgi og (3) implantation af leveren i modtageren. Blandt disse modtagerprocedurer udgør vaskulær anastomose den største udfordring. Mens den suprahepatiske ringere vena cava-anastomose typisk afsluttes med håndsyning2, kan den infrahepatiske ringere vena cava (IHIVC) og portalvene (PV) rekonstrueres mere effektivt ved hjælp af plastikmanchetter i stedet for håndsyede suturer.
Den anhepatiske periode betyder intervallet mellem fjernelsen af modtagerens oprindelige lever og transplantatimplantationen. For at sikre ensartede resultater er det bydende nødvendigt at begrænse den anhepatiske tid til mindre end 20 min. Derfor har undersøgelser, der anvender denne model, været begrænset til specifikke institutioner 3,4,5,6,7,8,9. Blandt de forskellige stadier af MOLT er opnåelse af jævn PV- og IHIVC-rekonstruktion afgørende for at minimere anhepatisk tid og sikre vellykket transplantation.
PV- og IVC-rekonstruktion udføres generelt ved hjælp af vaskulære manchetter, da manchetteknikken forenkler vaskulær anastomose sammenlignet med håndsyede suturer 2,5,8. Teknikken involveret i vaskulær manchetforberedelse og sikker fastgørelse af manchetten påvirker signifikant kompleksiteten af modtagervaskulær rekonstruktion. Vores mål er at give detaljeret visuel vejledning til adskillige tekniske tips relateret til manchetmetoden og derved reducere indlæringskurven. Disse videoklip vil give en klar forståelse af, hvordan manchetten fastgøres til karrene og rekonstruerer PV og IHIVC under modtageroperation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgsprotokollen blev godkendt af Animal Experimentation Committee ved Kyoto University. Undersøgelsen anvendte C57BL/6-mus, der var over 10 uger gamle og vejede mellem 25 g og 30 g, opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Alle dyr blev bedøvet med 2,5% isofluran (efter institutionelt godkendte protokoller), opretholdt under specifikke patogenfrie forhold, og alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med Kyoto Universitets regler om dyreforsøg. De relevante instrumenter, der anvendes til undersøgelsen, er anført i materialetabellen og afbildet i figur 1 og figur 2.
1. Valg af dyr
- Brug mus med en kropsvægt på 25-30 g.
BEMÆRK: Mens museleverallotransplantater2 generelt accepteres på tværs af større histokompatibilitetskompleksbarriere, valgte vi den syngeneiske MOLT-model i denne undersøgelse for at fokusere på den detaljerede mekanisme for kold iskæmi-reperfusionsskade10. Mus, der vejer mindre end 25 g, anbefales ikke, fordi det er umuligt at indsætte en indre stent i en tynd galdekanal. Tilsvarende anbefales mus, der vejer mere end 30 g, ikke på grund af tilstedeværelsen af en stor mængde intraabdominal fedt omkring karrene.
2. Manchetfremstilling
- Forbered 20 G og 16 G intravenøse katetre til henholdsvis PV og IHIVC.
- Brug en skalpel til at skære kateteret for at skabe manchetten. Manchettens hoveddel skal måle 2 mm i længden med et forlængerhåndtag på 1 mm (figur 3A).
BEMÆRK: Hvis håndtaget er for stort, kan det blive udfordrende at indsætte manchetten. - På manchettens overflade skal du oprette en lav rille til gevindfiksering ved hjælp af bagsiden af skalpelbladet.
BEMÆRK: Når du sætter bagsiden af skalpelbladet på manchetten, skal du sikre dig, at spidsen af bladet er i en vinkel på ca. 60 grader (som vist i figur 3B). Når du har lavet den første rille, skal du fastgøre skalpelbladet og dreje manchetten. Ideelt set anbefales to riller, men en enkelt rille kan være tilstrækkelig uden problemer.
3. Manchetfastgørelse
- I en rektangulær plastikbeholder skal du placere små isterninger og placere en lille metalkop (6 cm i diameter) ovenpå. Fyld koppen med organkonserveringsvæske (se tabel over materialer) og læg det syngeneiske transplantat indeni.
- Rul forsigtigt det syngeneiske levertransplantat (ekstraheret fra en anden donormus) ved hjælp af en vatpind, og sørg for, at porta hepatis vender opad. Fjern grundigt blod, der er opbevaret i IVC's lumen med organkonserveringsvæske.
- Træk PV gennem manchetten ved hjælp af en tråd, der er fastgjort til for eksempel miltven (se figur 4A).
- Med manchethåndtaget i positionen kl. 12 skal du fastgøre både håndtaget og manchetten med en bulldogklemme (se materialetabellen) og placere den 2 til 3 mm fra PV-kanten.
- Fastgør bulldogklemmen yderligere ved hjælp af store vaskulære tang og en fikseringsform for at etablere det operative felt (se figur 4B).
- Undersøg omhyggeligt PV-lumen ved ca. 15 til 20x forstørrelse. Om nødvendigt kan dryppende vand forbedre synligheden af lumen.
- Tag forsigtigt fat i PV-lumen og eksternaliser det gennem manchetten.
- Når den er fuldt eksternaliseret, skal du sikre den med en dobbelt ligering ved hjælp af 8-0 silketråd langs manchettens rille (figur 4C, D).
BEMÆRK: Sørg for, at ligaturen ikke er løs. Pas også på, at ligaturpunktet ikke er for stort, da det kan forstyrre manchetindsættelsen. Ligaturpunktet kan placeres i enhver retning. - Fastgør manchetten til IHIVC ved hjælp af en procedure svarende til den, der anvendes til PV (figur 4E).
BEMÆRK: Når du klemmer IHIVC med manchetten, skal du undgå at bide i leverparenchymen. Da nakken er kortere end PV, skal du omhyggeligt bestemme klempositionen. - Opret en slipknude ved at føre tråden rundt om bunden af IHIVC for midlertidigt at ligere IHIVC (figur 5). Denne tråd fjernes efter reperfusion.
4. Rekonstruktion af portalvene
- Bedøv modtagermusen ved at inducere anæstesi med isofluran ved 2,5% og reducer den til 0,6%, før den indfødte lever ekstraheres som beskrevet i offentliggjort litteratur2. Dinsinfect det kirurgiske område mindst tre gange med vekslende runder af iodophor og 70% ethanol før laparotomi.
- Sørg for, at leverloben er korrekt placeret, og at PV med manchetter er fri for knæk og vridning.
- Tag forsigtigt fat i modtagerens PV-kant ved hjælp af ærtetang, og fastgør den med en skruestik.
BEMÆRK: I denne artikel henviser en skruestik til et mekanisk apparat, der bruges til at fastgøre ærtetang på bordet. For mere information om skruestik, se Materialetabel. - Påfør en vaskulær klemme på modtagerens PV og send en 8-0 silketråd omkring det.
- Opret en 1/4 omkredssektion ca. 0,5 mm fra PV-kanten (figur 6A). Forstør hullet, mens saltopløsningen føres gennem lumen ved hjælp af et specialiseret instrument (en 27 G nål med spidsen afskåret og bøjet i en L-form).
- Brug lige tang til at gribe manchethåndtaget og indsætte det i lumen.
- Når den er sat helt ind, skal du sikre manchetten med en 8-0 silketråd. En enkelt ligering er tilstrækkelig til fiksering.
- Fjern den vaskulære klemme og reperfus leveren.
- Slip forsigtigt ærtetangen og fuldfør portalvenerekonstruktionen. Hele PV-rekonstruktionsprocessen skal tage ca. 5 min.
5. Infrahepatisk ringere vena cava-rekonstruktion
- Placer leverlappen korrekt, og flyt ærtetangen, der er fastgjort til modtagerens IHIVC-dorsal, til transplantatets højre nedre lap, og fastgør den med en skruestik.
- Fjern eventuelt resterende levervæv omkring modtagerens IVIHC ved forsigtigt at gnide med en vatpind.
- Bestå en 8-0 silketråd omkring modtagerens IVIHC.
- Opret en 1/4 omkredssektion ca. 0,5 mm fra modtagerens IVIHC-kant (figur 6B).
- Efter introduktion af normal saltopløsning i lumen, skal manchetten indsættes i lumen.
BEMÆRK: På grund af den korte hals indsættes manchetten ofte mere lavt end i PV. - Fastgør forsigtigt manchetten med en 8-0 silketråd og fjern derefter vaskulær klemme og ærtang.
6. Postoperativ pleje
- Brug en varmepude og varmelampe for at lette postoperativ genopretning.
- Overvåg kontinuerligt blodtryk, puls, respirationsfrekvens, kropstemperatur samt mad- og vandforbrug.
- Adminsiter subkutan injektion af carprofen (5 mg/kg, hver 6. time eller indtil nødvendigt) for at lindre postoperative smerter. Følg lokale institutionelle retningslinjer.
BEMÆRK: Hvis musens tilstand forværres, stoppes eksperimentet straks, og mus blev aflivet ved indånding af kuldioxid. - For at indsamle vævsprøven skal du bedøve musene igen og aflive dem ved en IACUC-godkendt metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PV-rekonstruktion er vellykket, når der ikke er nogen tortuositet ved løsspænding af portalvenen, og leveren er ensartet perfuseret. Anhepatisk tid bør være under 20 min, da anhepatiske tider på over 25 minutter øger risikoen for musedødelighed. IHIVC-rekonstruktion anses for vellykket, hvis der ikke er blodregurgitation fra transplantatet.
Opbevaring af transplantatet ved kolde temperaturer i 1 time ved hjælp af organkonserveringsopløsning resulterer i et serumalaninaminotransferaseniveau på ca. 2.000 E/l 6 timer efter reperfusion (figur 7A). Overlevelsesraten er 100 % 7 dage efter transplantationen (figur 7B). I vores model uden leverarterieanastomose kan modtagermus dog bukke under for intrahepatisk biloma-relaterede problemer ca. 30 dage efter transplantation
Figur 1: Instrumenter til vaskulær rekonstruktion. Lige eller buede tang anvendes efter behov for situationen og det operative felt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikroskopet. Mikroskopet er udstyret med en objektiv linse med 10x forstørrelse og en okularlinse med mindst 0,8x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Klargøring af manchetten. (A) Manchetten til PV og IHIVC. (B) En skematisk gengivelse af processen med at skabe en rille på manchetten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Manchetfastgørelse. (A) Tråden, der er fastgjort til PV, føres ind i manchetten. (B) Instrumentopsætning til fastgørelse af manchet. (C) Sikring af manchetten med 8-0 silke ligationer. (D) Skematisk illustration af vaskulær eksternalisering og fiksering til manchetten. (E) Udfyldt manchetfastgørelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Midlertidig ligering af IHIVC-roden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Vaskulær rekonstruktion. Denne illustration viser placeringerne for oprettelse af huller til (A) PV og (B) IHIVC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Postoperative resultater. (A) Serumniveauer af alaninaminotransferase (ALAT) 6 timer efter reperfusion. CIT, kold iskæmisk tid; Tx, transplantation. p < 0,0001. (B) Modtagerens overlevelse efter MOLT. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At lære vaskulær rekonstruktion er det mest udfordrende aspekt ved at opnå vellykket MOLT. Manchettens kvalitet påvirker rekonstruktionens sværhedsgrad betydeligt i betragtning af musens lille størrelse5. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til manchetforberedelse, fastgørelse og rekonstruktion.
Selvom der ikke er nogen større forskelle fra tidligere rapporter vedrørende manchetforberedelse og tilslutning 2,5, bør nogle mindre punkter overvejes. For det første skal manchethåndtagets tykkelse begrænses til ca. 1/6 af den samlede omkreds. Hvis det er for tyndt, kan håndtaget let bøjes og blive svært at gribe. Hvis det er for tykt, kan det være udfordrende at håndtere i modtagerens underliv. Det er vigtigt at identificere dine personlige præferencer tidligt.
For det andet er synligheden af lumen ved bagbordet afgørende. En 10-0 nylontråd anvendes, fastgjort til donorens miltvene som et vartegn for at bekræfte PV-lumen. Nylontråden placeres klokken 8 for at forhindre overdreven vridning. Karvæggen eksternaliseres ved at gribe fat i den klokken 3 og 9 med to tang og trykke den mod manchetvæggen klokken 6. Fiksering med 8-0 Silketråd kræver omhyggelige bevægelser. Tilstrækkelig fiksering opnås ved at fastgøre den i rillen. Efter fastgørelse skal du løfte manchetten for at bekræfte, at den ikke kommer af.
For det tredje er det under rekonstruktion vigtigt ikke at skabe et for stort hul i modtagerbeholderen, fordi hullet naturligt forstørres, når manchetten indsættes. At lave et stort hul kan føre til fartøjsopdeling, den mest almindelige årsag til fiasko. Især i IHIVC-rekonstruktion bør der laves mindre huller, da den kortere længde af IHIVC gør det lettere at trække ud end en PV. Når du fører saltopløsning gennem lumen, skal du støtte manchetindsættelsen ved at anvende opadgående kraft snarere end nedad.
Almindelige årsager til svigt og forholdsregler er blevet diskuteret detaljeret. De mest afgørende punkter inkluderer at sikre klar visualisering af det indre fartøjs lumen og undgå unødvendig kraft under manchetindsættelse for at forhindre fartøjsopdeling. Disse tekniske tips til manchetmetoden menes at hæve færdigheder og fremme forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen forfattere har nogen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af 2022 JST grundforskning (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
