Summary
Denne protokollen gir teknisk informasjon for rekonstruksjon av fartøy ved hjelp av mansjettteknikken ved ortotopisk levertransplantasjon fra mus.
Abstract
Ortotopisk levertransplantasjon fra mus er en effektiv metode for å undersøke de underliggende mekanismene for leveriskemi og reperfusjonsskade. De tekniske utfordringene utgjør imidlertid en barriere for å utnytte denne verdifulle eksperimentelle modellen og videreføre disse ferdighetene til neste generasjon. Det mest utfordrende aspektet ved denne prosedyren er vaskulær rekonstruksjon, inkludert portvenen (PV), infrahepatisk vena cava (IHIVC) og suprahepatisk vena cava inferior. Bruken av plastmansjetter, i stedet for suturer, muliggjør jevnere PV- og IHIVC-rekonstruksjon. Fartøyene rekonstrueres ved å feste en mansjett laget av et intravenøst kateter til spissen av transplantatkaret og plassere mansjetten inn i mottakerbeholderen. De to mest avgjørende aspektene er riktig visualisering av fartøyets indre lumen og unngå bruk av overdreven kraft. Vårt mål er å gi en teknisk oversikt over vaskulære rekonstruksjoner ved hjelp av mansjettteknikken i mottakerkirurgi. Disse tekniske tipsene for mansjettteknikken forventes å hjelpe mikrokirurger med å lette vaskulær rekonstruksjon og fremme forskningen.
Introduction
Ortotopisk levertransplantasjon fra mus (MOLT) er en effektiv eksperimentell metode som først ble rapportert i 19911. Denne eksperimentelle modellen, som benytter genetisk modifiserte mus og ulike forskningsreagenser, har spilt en sentral rolle i å undersøke varm og kald iskemi og reperfusjonsskader. Modellens høye tekniske kompleksitet har imidlertid hindret utviklingen av basalmedisin for levertransplantasjon2. MOLT innebærer tre hovedtrinn: (1) henting av leveren fra donormusen, (2) ryggbordkirurgi og (3) implantasjon av leveren i mottakeren. Blant disse mottakerprosedyrene utgjør vaskulær anastomose den største utfordringen. Mens den suprahepatiske vena cava-anastomosen vanligvis fullføres ved håndsøm2, kan den infrahepatiske vena cava (IHIVC) og portalvenen (PV) rekonstrueres mer effektivt ved hjelp av plastmansjetter i stedet for håndsydde suturer.
Den hepatiske perioden betyr intervallet mellom fjerning av mottakerens opprinnelige lever og transplantatimplantasjonen. For å sikre konsistente resultater er det viktig å begrense levertiden til mindre enn 20 minutter. Følgelig har studier som bruker denne modellen vært begrenset til spesifikke institusjoner 3,4,5,6,7,8,9. Blant de ulike stadiene av MOLT er det avgjørende å oppnå jevn PV- og IHIVC-rekonstruksjon for å minimere levertiden og sikre vellykket transplantasjon.
PV- og IVC-rekonstruksjon utføres vanligvis ved bruk av vaskulære mansjetter siden mansjettteknikken forenkler vaskulær anastomose sammenlignet med håndsydde suturer 2,5,8. Teknikken som er involvert i vaskulær mansjettpreparasjon og sikker festing av mansjetten påvirker signifikant kompleksiteten til mottakerens vaskulære rekonstruksjon. Vårt mål er å gi detaljert visuell veiledning for en rekke tekniske tips relatert til mansjettmetoden, og dermed redusere læringskurven. Disse videoklippene vil gi en klar forståelse av hvordan man fester mansjetten til karene og rekonstruerer PV og IHIVC under mottakerkirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Experimentation Committee ved Kyoto University. Studien benyttet C57BL/6 mus, eldre enn 10 uker og veier mellom 25 g og 30 g, hentet fra en kommersiell kilde (se materialfortegnelse). Alle dyr ble bedøvet med 2,5% isofluran (etter institusjonelt godkjente protokoller), opprettholdt under spesifikke patogenfrie forhold, og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med Kyoto-universitetets forskrifter om dyreforsøk. De aktuelle instrumentene som ble brukt i studien er listet opp i materialfortegnelsen og vist i figur 1 og figur 2.
1. Valg av dyr
- Bruk mus med en kroppsvekt på 25-30 g.
MERK: Mens mus lever allotransplantater2 er generelt akseptert på tvers av store histokompatibilitetskompleksbarrierer, valgte vi den syngene MOLT-modellen i denne studien for å fokusere på den detaljerte mekanismen for kald iskemi reperfusjonsskade10. Mus som veier mindre enn 25 g anbefales ikke fordi det er umulig å sette inn en indre stent i en tynn gallekanal. På samme måte anbefales ikke mus som veier over 30 g på grunn av tilstedeværelsen av en stor mengde intraabdominal fett rundt karene.
2. Mansjett gjør
- Forbered 20 G og 16 G intravenøse katetre for henholdsvis PV og IHIVC.
- Bruk en skalpell, kutt kateteret for å lage mansjetten. Mansjettens hoveddel skal måle 2 mm i lengden, med et forlengelseshåndtak på 1 mm (figur 3A).
MERK: Hvis håndtaket er for stort, kan det bli utfordrende å sette inn mansjetten. - På mansjettens overflate lager du et grunt spor for trådfiksering ved hjelp av baksiden av skalpellbladet.
MERK: Når du påfører baksiden av skalpellbladet på mansjetten, må du sørge for at spissen av bladet er i en vinkel på ca. 60 grader (som vist i figur 3B). Etter å ha gjort det første sporet, fest skalpellbladet og roter mansjetten. Ideelt sett anbefales to spor, men et enkelt spor kan være tilstrekkelig uten problemer.
3. Mansjettfeste
- I en rektangulær plastbeholder plasserer du små isbiter og plasserer en liten metallkopp (6 cm i diameter) på toppen. Fyll koppen med organkonserveringsvæske (se materialfortegnelse) og plasser det syngene transplantatet inni.
- Rull forsiktig det syngene levertransplantatet (ekstrahert fra en annen donormus) ved hjelp av en bomullspinne, slik at porta hepatis vender oppover. Fjern grundig blod som er lagret i IVCs lumen med organbevarende væske.
- Tre PV gjennom mansjetten ved hjelp av en tråd festet for eksempel til miltvenen (se figur 4A).
- Med mansjetthåndtaket i 12-posisjon, fest både håndtaket og mansjetten med en bulldogklemme (se materialfortegnelse), og plasser den 2 til 3 mm fra PV-kanten.
- Fest bulldogklemmen ytterligere med stor vaskulær tang og en fikseringsform for å etablere operasjonsfeltet (se figur 4B).
- Inspiser nøye PV-lumen ved omtrent 15 til 20x forstørrelse. Om nødvendig kan dryppende vann forbedre synligheten av lumen.
- Ta forsiktig tak i PV-lumen og eksternaliser den gjennom mansjetten.
- Når den er fullstendig eksternalisert, fest den med en dobbel ligering ved å bruke 8-0 silketråd langs mansjettens spor (figur 4C,D).
MERK: Kontroller at ligaturen ikke er løs. Pass også på at ligaturpunktet ikke er for stort, da det kan forstyrre mansjettinnsetting. Ligaturpunktet kan plasseres i alle retninger. - Fest mansjetten til IHIVC ved hjelp av en prosedyre som ligner den som brukes for PV (figur 4E).
NOTAT: Når du klemmer IHIVC med mansjetten, unngå å bite i leverparenchymen. Siden nakken er kortere enn PV, må du nøye bestemme klemposisjonen. - Lag en slipknot ved å føre tråden rundt bunnen av IHIVC for midlertidig å ligere IHIVC (figur 5). Denne tråden vil bli fjernet etter reperfusjon.
4. Rekonstruksjon av portalvene
- Bedøve mottakermusen ved å indusere anestesi med isofluran hos 2,5 % og redusere den til 0,6 % før ekstrahering av den opprinnelige leveren som beskrevet i publisert litteratur2. Dinsinfiser operasjonsområdet minst tre ganger med vekslende runder med jodofor og 70% etanol før laparotomi.
- Forsikre deg om at leverlappen er riktig plassert og at den mansjetterte PV er fri for kinking og vridning.
- Ta forsiktig tak i mottakerens PV-kant ved hjelp av Pean tang og fest den med en skrustikke.
MERK: I denne artikkelen refererer en vise til et mekanisk apparat som brukes til å feste Pean tang på bordet. Hvis du vil ha mer informasjon om vise, kan du se Materialfortegnelse. - Påfør en vaskulær klemme på mottakerens PV og pass en 8-0 silketråd rundt den.
- Lag en 1/4 omkretsseksjon ca. 0,5 mm fra PV-kanten (figur 6A). Forstørr hullet mens du fører saltoppløsning gjennom lumen ved hjelp av et spesialisert instrument (en 27 G nål med spissen avskåret og bøyd i en L-form).
- Bruk rett tang til å gripe mansjetthåndtaket og sett det inn i lumen.
- Når den er satt helt inn, fest mansjetten med en 8-0 silke tråd. En enkelt ligering er tilstrekkelig for fiksering.
- Fjern vaskulær klemme og reperfuse leveren.
- Slipp forsiktig Pean tangen og fullfør rekonstruksjonen av portalvenen. Hele PV-rekonstruksjonsprosessen bør ta ca. 5 min.
5. Infrahepatisk dårligere vena cava rekonstruksjon
- Plasser leverlappen på riktig måte og flytt petangen festet til mottakerens IHIVC-dorsal til transplantatets høyre underlapp, fest den med en skrustikke.
- Eliminer eventuelt gjenværende levervev rundt mottakerens IVIHC ved å gni forsiktig med en bomullspinne.
- Pass en 8-0 silketråd rundt mottakerens IVIHC.
- Opprett et 1/4 cirkumferensielt snitt ved ca. 0,5 mm fra mottakerens IVIHC-kant (figur 6B).
- Etter å ha introdusert normal saltoppløsning i lumen, sett mansjetten inn i lumen.
MERK: På grunn av den korte halsen settes mansjetten ofte inn grunnere enn i PV. - Fest mansjetten forsiktig med en 8-0 silketråd og fjern deretter vaskulær klemme og Pean tang.
6. Postoperativ behandling
- Bruk en varmepute og varmelampe for å lette postoperativ gjenoppretting.
- Overvåk kontinuerlig blodtrykk, hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens, kroppstemperatur, samt mat- og vannforbruk.
- Adminsiter subkutan injeksjon av karprofen (5 mg/kg, hver 6. time eller inntil nødvendig) for å lindre postoperativ smerte. Følg lokale institusjonelle retningslinjer.
MERK: Hvis tilstanden til mus forverres, vil forsøket bli stoppet umiddelbart og mus ble avlivet ved innånding av karbondioksid. - For å samle vevsprøven, bedøve musene på nytt og avlive dem ved en IACUC-godkjent metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PV-rekonstruksjon er vellykket når det ikke er tortuositet ved å klemme portalvenen, og leveren er jevnt perfusert. Anhepatisk tid bør være under 20 minutter, da anhepatiske tider over 25 minutter øker risikoen for musedødelighet. IHIVC-rekonstruksjon anses som vellykket hvis det ikke er blodregurgitasjon fra transplantatet.
Oppbevaring av transplantatet ved kalde temperaturer i 1 time ved bruk av organkonserveringsløsning resulterer i et serum alaninaminotransferasenivå på ca. 2000 E/l ved 6 timer etter reperfusjon (figur 7A). Overlevelsen er 100 % 7 dager etter transplantasjon (figur 7B). I vår modell uten leverarterieanastomose kan imidlertid mottakermus bukke under for intrahepatisk bilomrelatert problemstilling ca. 30 dager etter transplantasjonen
Figur 1 Instrumenter for vaskulær rekonstruksjon. Rett eller buet tang brukes etter behov for situasjonen og det operative feltet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikroskopet. Mikroskopet er utstyrt med en objektivlinse med 10x forstørrelse og en okularlinse med minst 0,8x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Klargjøring av mansjetten. (A) Mansjetten for PV og IHIVC. (B) En skjematisk fremstilling av prosessen med å lage et spor på mansjetten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mansjettfeste. (A) Tråden festet til PV føres inn i mansjetten. (B) Instrumentoppsett for mansjettfeste. (C) Sikring av mansjetten med 8-0 silke ligations. (D) Skjematisk illustrasjon av vaskulær eksternalisering og fiksering til mansjetten. (E) Fullført mansjettfeste. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Midlertidig ligering av IHIVC-roten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Vaskulær rekonstruksjon. Denne illustrasjonen viser stedene for å lage hull for (A) PV og (B) IHIVC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Postoperative resultater. (A) Serumnivåer av alaninaminotransferase (ALAT) ved 6 timer etter reperfusjon. CIT, kald iskemisk tid; Tx, transplantasjon. p < 0,0001. (B) Overlevelse av mottakeren etter MOLT. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å lære vaskulær rekonstruksjon er det mest utfordrende aspektet ved å oppnå vellykket MOLT. Mansjettens kvalitet påvirker rekonstruksjonens vanskeligheter betydelig, gitt den lille størrelsen på mus5. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for mansjettklargjøring, vedlegg og rekonstruksjon.
Selv om det ikke er noen store forskjeller fra tidligere rapporter om mansjettklargjøring og tilkobling 2,5, bør noen mindre punkter vurderes. For det første bør mansjetthåndtakets tykkelse begrenses til ca. 1/6 av den totale omkretsen. Hvis det er for tynt, kan håndtaket lett bøyes og bli vanskelig å gripe. Hvis den er for tykk, kan den være utfordrende å håndtere i mottakerens mage. Det er viktig å identifisere dine personlige preferanser tidlig.
For det andre er synligheten av lumen på bakbordet avgjørende. En 10-0 nylontråd brukes, festet til donorens miltvein som et landemerke for å bekrefte PV-lumen. Nylontråden er plassert klokken 8 for å forhindre overdreven vridning. Fartøyveggen eksternaliseres ved å gripe den klokken 3 og 9 med to tang og presse den mot mansjettveggen klokken 6. Fiksering med 8-0 Silketråd krever forsiktige bevegelser. Tilstrekkelig fiksering oppnås ved å feste den i sporet. Etter festing, løft mansjetten for å bekrefte at den ikke løsner.
For det tredje, under rekonstruksjon er det viktig å ikke lage for stort hull i mottakerbeholderen fordi hullet naturlig forstørres når mansjetten settes inn. Å lage et stort hull kan føre til at fartøyet splittes, den vanligste årsaken til svikt. Spesielt i IHIVC-rekonstruksjon bør mindre hull lages siden den kortere lengden på IHIVC gjør det lettere å trekke ut enn en PV. Når du fører saltoppløsning gjennom lumen, støtter mansjettinnsetting ved å påføre oppadgående kraft i stedet for nedover.
Vanlige årsaker til svikt og forholdsregler har blitt diskutert i detalj. De mest avgjørende punktene inkluderer å sikre tydelig visualisering av det indre fartøyets lumen og unngå unødvendig kraft under mansjettinnsetting for å forhindre at fartøyet splittes. Disse tekniske tipsene for mansjettmetoden antas å heve ferdigheter og fremme forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen forfattere har noen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av 2022 JST grunnforskning (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
