Summary
Este protocolo proporciona información técnica para la reconstrucción de vasos mediante la técnica del manguito en el trasplante hepático ortotópico de ratón.
Abstract
El trasplante ortotópico de hígado en ratón es una metodología eficaz para investigar los mecanismos subyacentes de la isquemia hepática y la lesión por reperfusión. Sin embargo, los desafíos técnicos plantean una barrera para utilizar este valioso modelo experimental y transmitir estas habilidades a la próxima generación. El aspecto más desafiante de este procedimiento es la reconstrucción vascular, que incluye la vena porta (VP), la vena cava inferior infrahepática (IHIVC) y la vena cava inferior suprahepática. El uso de manguitos de plástico, en lugar de suturas, permite una reconstrucción más suave de la PV y la IHIVC. Los vasos se reconstruyen conectando un manguito hecho con un catéter intravenoso a la punta del vaso del injerto e interponiendo el manguito en el vaso receptor. Los dos aspectos más cruciales son visualizar correctamente el lumen interno del vaso y evitar el uso de fuerza excesiva. Nuestro objetivo es proporcionar una visión técnica de las reconstrucciones vasculares mediante la técnica del manguito en la cirugía del receptor. Se espera que estos consejos técnicos para la técnica del manguito ayuden a los microcirujanos a facilitar la reconstrucción vascular y avanzar en sus investigaciones.
Introduction
El trasplante ortotópico de hígado en ratón (MOLT) es un método experimental eficaz descrito por primera vez en 19911. Este modelo experimental, que utiliza ratones modificados genéticamente y varios reactivos de investigación, ha desempeñado un papel fundamental en la investigación de la isquemia fría y caliente y las lesiones por reperfusión. Sin embargo, la alta complejidad técnica del modelo ha dificultado el desarrollo de medicamentos básicos para el trasplante hepático2. La MOLT implica tres pasos principales: (1) recuperación del hígado del ratón donante, (2) cirugía de la mesa posterior y (3) implantación del hígado en el receptor. Entre estos procedimientos receptores, la anastomosis vascular presenta el mayor desafío. Mientras que la anastomosis suprahepática de la vena cava inferior generalmente se completa con sutura a mano2, la vena cava inferior infrahepática (IHIVC) y la vena porta (VP) se pueden reconstruir de manera más eficiente utilizando manguitos de plástico en lugar de suturas cosidas a mano.
El período anhepático significa el intervalo entre la extracción del hígado nativo del receptor y la implantación del injerto. Para garantizar resultados consistentes, es imperativo limitar el tiempo anhepático a menos de 20 minutos. En consecuencia, los estudios que emplean este modelo se han limitado a instituciones específicas 3,4,5,6,7,8,9. Entre las diversas etapas de la MOLT, lograr una reconstrucción fluida de la PV y la IHIVC es crucial para minimizar el tiempo de anhepática y garantizar el éxito del trasplante.
La reconstrucción de la VP y de la VCI se realiza generalmente con manguitos vasculares, ya que la técnica del manguito simplifica la anastomosis vascular en comparación con las suturas cosidas a mano 2,5,8. La técnica involucrada en la preparación del manguito vascular y la fijación segura del manguito tiene un impacto significativo en la complejidad de la reconstrucción vascular del receptor. Nuestro objetivo es proporcionar una guía visual detallada para numerosos consejos técnicos relacionados con el método del manguito, reduciendo así la curva de aprendizaje. Estos clips de video proporcionarán una comprensión clara de cómo conectar el manguito a los vasos y reconstruir la VP y la IHIVC durante la cirugía del receptor.
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Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Kioto. En el estudio se utilizaron ratones C57BL/6, con más de 10 semanas de edad y un peso de entre 25 g y 30 g, obtenidos de una fuente comercial (véase la Tabla de Materiales). Todos los animales fueron anestesiados con isoflurano al 2,5% (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente), mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos, y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las Regulaciones de Experimentación Animal de la Universidad de Kyoto. Los instrumentos apropiados utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales y se representan en la Figura 1 y la Figura 2.
1. Selección de animales
- Utilice ratones con un peso corporal de 25-30 g.
NOTA: Si bien los aloinjertos de hígado de ratón2 son generalmente aceptados a través de la barrera del complejo de histocompatibilidad principal, optamos por el modelo MOLT singénico en este estudio para centrarnos en el mecanismo detallado de la lesión por isquemia fría y reperfusión10. Los ratones que pesan menos de 25 g no se recomiendan porque es imposible insertar un stent interno en un conducto biliar delgado. Del mismo modo, no se recomiendan ratones que pesen más de 30 g debido a la presencia de una gran cantidad de grasa intraabdominal alrededor de los vasos.
2. Fabricación de brazaletes
- Preparar catéteres intravenosos de 20 G y 16 G para la VP y la IHIVC, respectivamente.
- Con un bisturí, corte el catéter para crear el manguito. El cuerpo principal del brazalete debe medir 2 mm de longitud, con un mango de extensión de 1 mm (Figura 3A).
NOTA: Si el mango es demasiado grande, puede resultar difícil insertar el brazalete. - En la superficie del brazalete, crea una ranura poco profunda para la fijación de la rosca con la parte posterior de la hoja del bisturí.
NOTA: Cuando aplique la parte posterior de la hoja del bisturí al manguito, asegúrese de que la punta de la hoja esté en un ángulo de aproximadamente 60 grados (como se muestra en la Figura 3B). Después de hacer la primera ranura, asegure la hoja del bisturí y gire el manguito. Idealmente, se recomiendan dos ranuras, pero una sola ranura puede ser suficiente sin problemas.
3. Fijación del brazalete
- En un recipiente de plástico de forma rectangular, coloque pequeños cubitos de hielo y coloque un pequeño vaso de metal (6 cm de diámetro) encima. Llene la copa con líquido de preservación de órganos (consulte la Tabla de materiales) y coloque el injerto singénico dentro.
- Enrolle suavemente el injerto hepático singénico (extraído de otro ratón donante) con un hisopo de algodón, asegurándose de que la porta hepatis mire hacia arriba. Extraer completamente la sangre almacenada en la luz de la VCI con líquido de preservación de órganos.
- Pase el PV a través del manguito usando una rosca unida, por ejemplo, a la vena esplénica (ver Figura 4A).
- Con el mango del manguito en la posición de las 12 en punto, asegure tanto el mango como el manguito con una abrazadera de bulldog (consulte la Tabla de materiales), colocándolo de 2 a 3 mm del borde PV.
- Asegure aún más la pinza de bulldog con pinzas vasculares grandes y un molde de fijación para establecer el campo operatorio (consulte la figura 4B).
- Inspeccione cuidadosamente el lúmene PV con un aumento de aproximadamente 15 a 20x. Si es necesario, el goteo de agua puede mejorar la visibilidad del lumen.
- Sujete suavemente el lumen PV y exteriorícelo a través del brazalete.
- Una vez que esté completamente externalizado, asegúralo con una ligadura doble usando 8-0 hilo de seda a lo largo de la ranura del brazalete (Figura 4C, D).
NOTA: Asegúrese de que la abrazadera no esté floja. Además, tenga cuidado de que la punta de la ligadura no sea demasiado grande, ya que puede interferir con la inserción del manguito. El punto de ligadura se puede colocar en cualquier dirección. - Coloque el manguito en el IHIVC utilizando un procedimiento similar al utilizado para la VP (Figura 4E).
NOTA: Al sujetar el IHIVC con el manguito, evite morder el parénquima hepático. Dado que el cuello es más corto que el PV, determine cuidadosamente la posición de sujeción. - Cree un nudo corredizo pasando la rosca alrededor de la base del IHIVC para ligarlo temporalmente (Figura 5). Este hilo se retirará después de la reperfusión.
4. Reconstrucción de la vena porta
- Anestesiar al ratón receptor mediante la inducción de anestesia con isoflurano al 2,5% y reducirlo al 0,6% antes de extraer el hígado nativo como se describe en la literatura publicada2. Desinfecte el área quirúrgica al menos tres veces con rondas alternas de yodoforo y etanol al 70% antes de la laparotomía.
- Asegúrese de que el lóbulo hepático esté colocado correctamente y de que el PV con manguito esté libre de torceduras y torsiones.
- Sujete suavemente el borde PV del receptor con pinzas de Pean y asegúrelo con un tornillo de banco.
NOTA: En este artículo, un tornillo de banco se refiere a un aparato mecánico utilizado para asegurar pinzas de Pean en la mesa. Para obtener más información sobre el tornillo de banco, consulte Tabla de materiales. - Aplique una pinza vascular en la VP del receptor y pase un 8-0 hilo de seda a su alrededor.
- Cree una sección circunferencial de 1/4 aproximadamente 0,5 mm desde el borde PV (Figura 6A). Amplíe el orificio mientras pasa la solución salina a través del lumen con un instrumento especializado (una aguja de 27 G con la punta cortada y doblada en forma de L).
- Use pinzas rectas para agarrar el mango del manguito e insertarlo en el lumen.
- Una vez que esté completamente insertado, asegure el brazalete con un 8-0 hilo de seda. Una sola ligadura es suficiente para la fijación.
- Retire la pinza vascular y reperfunda el hígado.
- Libere con cuidado las pinzas de Pean y complete la reconstrucción de la vena porta. Todo el proceso de reconstrucción fotovoltaica debería durar aproximadamente 5 minutos.
5. Reconstrucción de la vena cava inferior infrahepática
- Coloque el lóbulo hepático de manera adecuada y mueva las pinzas de Pean unidas a la dorsal del IHIVC del receptor al lóbulo inferior derecho del injerto, asegurándolo con un tornillo de banco.
- Elimine cualquier resto de tejido hepático alrededor de la IVIHC del receptor frotando suavemente con un hisopo de algodón.
- Pasa un 8-0 hilo de seda alrededor de la IVIHC del receptor.
- Cree una sección circunferencial de 1/4 a aproximadamente 0,5 mm del borde de la IVIHC del receptor (Figura 6B).
- Después de introducir una solución salina normal en el lumen, inserte el manguito en el lumen.
NOTA: Debido al cuello corto, el brazalete a menudo se inserta de manera más superficial que en el PV. - Asegure cuidadosamente el brazalete con un 8-0 hilo de seda y luego retire la pinza vascular y las pinzas de Pean.
6. Cuidados postoperatorios
- Utilice una almohadilla térmica y una lámpara de calentamiento para facilitar la recuperación postoperatoria.
- Controle continuamente la presión arterial, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria, la temperatura corporal, así como el consumo de alimentos y agua.
- Adminsiter inyección subcutánea de carprofeno (5 mg/kg, cada 6 h o hasta que sea necesario) para aliviar el dolor postoperatorio. Siga los lineamientos institucionales locales.
NOTA: Si la condición de los ratones se deteriora, el experimento se detendrá inmediatamente y los ratones fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono. - Para recolectar la muestra de tejido, vuelva a anestesiar a los ratones y eutanasiarlos mediante un método aprobado por la IACUC.
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Representative Results
La reconstrucción con VP es exitosa cuando, al desenganchar la vena porta, no hay tortuosidad y el hígado se perfunde uniformemente. El tiempo anhepático debe ser inferior a 20 min, ya que los tiempos anhepáticos superiores a 25 min aumentan el riesgo de mortalidad del ratón. La reconstrucción con IHIVC se considera exitosa si no hay regurgitación sanguínea del injerto.
El almacenamiento del injerto a temperaturas frías durante 1 h utilizando una solución de preservación de órganos da como resultado un nivel sérico de alanina aminotransferasa de aproximadamente 2.000 U/L a las 6 h después de la reperfusión (Figura 7A). La tasa de supervivencia es del 100% a los 7 días después del trasplante (Figura 7B). Sin embargo, en nuestro modelo sin anastomosis de la arteria hepática, los ratones receptores pueden sucumbir a problemas relacionados con el biloma intrahepático aproximadamente 30 días después del trasplante
Figura 1: Instrumental para la reconstrucción vascular. Se utilizan pinzas rectas o curvas según sea necesario para la situación y el campo operatorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El microscopio. El microscopio está equipado con una lente objetivo con un aumento de 10x y una lente ocular con un aumento de al menos 0,8x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación del manguito. (A) El brazalete para el PV y el IHIVC. (B) Una representación esquemática del proceso de creación de una ranura en el manguito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fijación del manguito. (A) La rosca unida al PV se pasa al manguito. (B) Configuración del instrumento para la fijación del manguito. (C) Asegurar el brazalete con 8-0 ligaduras de seda. (D) Ilustración esquemática de la externalización vascular y fijación al manguito. (E) Fijación del manguito completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ligadura temporal de la raíz IHIVC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Reconstrucción vascular. Esta ilustración muestra las ubicaciones para crear agujeros para (A) PV y (B) IHIVC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Resultados postoperatorios. (A) Niveles séricos de alanina aminotransferasa (ALT) a las 6 h después de la reperfusión. CIT: tiempo isquémico frío; Tx: trasplante. p < 0,0001. (B) Supervivencia del receptor después de la MOLT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El aprendizaje de la reconstrucción vascular es el aspecto más desafiante para lograr un MOLT exitoso. La calidad del manguito influye significativamente en la dificultad de la reconstrucción, dado el pequeño tamaño de los ratones5. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación, fijación y reconstrucción del manguito.
Si bien no hay diferencias importantes con respecto a los informes anteriores con respecto a la preparación y conexión del manguito 2,5, se deben considerar algunos puntos menores. En primer lugar, el grosor del mango del manguito debe limitarse a aproximadamente 1/6 de la circunferencia total. Si es demasiado delgado, el mango puede doblarse fácilmente y volverse difícil de agarrar. Si es demasiado grueso, puede ser difícil de manejar en el abdomen del receptor. Identificar sus preferencias personales desde el principio es esencial.
En segundo lugar, la visibilidad del lumen en la mesa trasera es crucial. Se utiliza un hilo de nailon 10-0, unido a la vena esplénica del donante como punto de referencia para confirmar el lumen PV. El hilo de nailon se coloca a las 8 en punto para evitar una torsión excesiva. La pared del vaso se exterioriza agarrándola a las 3 h y a las 9 h con dos pinzas y presionándola contra la pared del manguito a las 6 h. Fijación con 8-0 El hilo de seda requiere movimientos cuidadosos. La fijación adecuada se logra asegurándolo en la ranura. Después de la colocación, levante el brazalete para confirmar que no se desprende.
En tercer lugar, durante la reconstrucción, es importante no crear un orificio demasiado grande en el vaso receptor, ya que el orificio se agranda naturalmente a medida que se inserta el manguito. Hacer un agujero grande puede provocar la división del vaso, la causa más común de falla. Particularmente en la reconstrucción de IHIVC, se deben hacer orificios más pequeños, ya que la longitud más corta de IHIVC hace que sea más fácil de extraer que un PV. Al pasar la solución salina a través del lumen, apoye la inserción del manguito aplicando fuerza hacia arriba en lugar de hacia abajo.
Las causas comunes de falla y las precauciones se han discutido en detalle. Los puntos más cruciales incluyen garantizar una visualización clara de la luz del vaso interno y evitar fuerza innecesaria durante la inserción del manguito para evitar la división del vaso. Se cree que estos consejos técnicos para el método del manguito elevan las habilidades y avanzan en la investigación.
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Disclosures
Ningún autor tiene conflictos de interés que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue respaldado por la investigación básica JST 2022 (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
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