Summary
Этот протокол предоставляет техническую информацию о реконструкции сосудов с использованием метода манжеты при ортотопической трансплантации печени мышей.
Abstract
Ортотопическая трансплантация печени мышей является эффективной методологией исследования основных механизмов ишемии печени и реперфузионного повреждения. Однако технические проблемы создают препятствие для использования этой ценной экспериментальной модели и передачи этих навыков следующему поколению. Наиболее сложным аспектом этой процедуры является реконструкция сосудов, включая воротную вену (ЛВ), подпеченочную нижнюю полую вену (IHIVC) и надпеченочную нижнюю полую вену. Использование пластиковых манжет, а не швов, позволяет проводить более гладкую реконструкцию PV и IHIVC. Сосуды реконструируются путем прикрепления манжеты, изготовленной из внутривенного катетера, к кончику сосуда трансплантата и введения манжеты в сосуд-реципиент. Два наиболее важных аспекта - это правильная визуализация внутреннего просвета сосуда и избегание чрезмерного применения силы. Наша цель - предоставить технический обзор сосудистых реконструкций с использованием техники манжеты в хирургии реципиента. Ожидается, что эти технические советы по технике манжеты помогут микрохирургам облегчить реконструкцию сосудов и продвинуть свои исследования.
Introduction
Ортотопическая трансплантация печени мышей (МОЛТ) является эффективным экспериментальным методом, впервые описанным в 1991году. Эта экспериментальная модель, в которой используются генетически модифицированные мыши и различные исследовательские реагенты, сыграла ключевую роль в исследовании теплой и холодной ишемии и реперфузионных повреждений. Однако высокая техническая сложность модели препятствовала развитию фундаментальной медицины для трансплантации печени2. MOLT включает в себя три основных этапа: (1) извлечение печени у мыши-донора, (2) операция на спинном столе и (3) имплантация печени реципиенту. Среди этих реципиентных процедур сосудистый анастомоз представляет собой наибольшую проблему. В то время как надпеченочный анастомоз нижней полой вены обычно завершается ручным швом2, подпеченочная нижняя полая вена (IHIVC) и воротная вена (PV) могут быть реконструированы более эффективно с использованием пластиковых манжет вместо швов ручной работы.
Ангепатический период означает интервал между удалением нативной печени реципиента и имплантацией трансплантата. Чтобы обеспечить стабильные результаты, необходимо ограничить время заболевания печени до менее чем 20 минут. Следовательно, исследования, использующие эту модель, были ограничены конкретными учреждениями 3,4,5,6,7,8,9. Среди различных этапов MOLT достижение гладкой реконструкции PV и IHIVC имеет решающее значение для минимизации времени печени и обеспечения успешной трансплантации.
Реконструкция ПВ и НПВ обычно проводится с использованием сосудистых манжет, поскольку техника манжеты упрощает сосудистый анастомоз по сравнению с ручным швом 2,5,8. Техника, используемая для подготовки сосудистой манжеты и надежного крепления манжеты, значительно влияет на сложность сосудистой реконструкции реципиента. Наша цель состоит в том, чтобы предоставить подробное визуальное руководство по многочисленным техническим советам, связанным с методом манжеты, тем самым сократив кривую обучения. Эти видеоклипы дадут четкое понимание того, как прикрепить манжету к сосудам и реконструировать ПВ и IHIVC во время операции реципиента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по экспериментам на животных в Киотском университете. В исследовании использовались мыши C57BL/6 в возрасте более 10 недель и массой от 25 г до 30 г, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Все животные были обезболены 2,5% изофлураном (в соответствии с институционально утвержденными протоколами), содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Правилами экспериментов на животных Киотского университета. Соответствующие инструменты, использованные для исследования, перечислены в таблице материалов и изображены на рисунках 1 и 2.
1. Отбор животных
- Используют мышей с массой тела 25-30 г.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как аллотрансплантаты печени мышей2 обычно признаются через главный барьер комплекса гистосовместимости, мы выбрали сингенную модель MOLT в этом исследовании, чтобы сосредоточиться на детальном механизме реперфузионного повреждения при холодовой ишемии10. Мышам весом менее 25 г не рекомендуется, потому что невозможно вставить внутренний стент в тонкий желчный проток. Точно так же не рекомендуются мыши весом более 30 г из-за наличия большого количества внутрибрюшного жира вокруг сосудов.
2. Изготовление манжет
- Подготовьте внутривенные катетеры 20 G и 16 G для ВП и IHIVC соответственно.
- С помощью скальпеля разрежьте катетер, чтобы создать манжету. Основная часть манжеты должна иметь длину 2 мм, а удлинительная рукоятка - 1 мм (рис. 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ручка слишком большая, может возникнуть проблема с вставлением манжеты. - На поверхности манжеты создайте неглубокую канавку для фиксации нити тыльной стороной лезвия скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: При прикладывании задней части лезвия скальпеля к манжете убедитесь, что кончик лезвия находится под углом примерно 60 градусов (как показано на рисунке 3B). После проделывания первой канавки закрепите лезвие скальпеля и поверните манжету. В идеале рекомендуется использовать две канавки, но одной канавки может быть достаточно без проблем.
3. Крепление манжеты
- В пластиковый контейнер прямоугольной формы поместите небольшие кубики льда и поставьте сверху небольшой металлический стаканчик (6 см в диаметре). Наполните чашку органосохраняющей жидкостью (см. Таблицу материалов) и поместите внутрь сингенный трансплантат.
- Аккуратно сверните сингенный трансплантат печени (извлеченный от другой донорской мыши) ватным тампоном, следя за тем, чтобы ворота печени были обращены вверх. Тщательно удалите кровь, хранящуюся в просвете НПВ, с органосохраняющей жидкостью.
- Проденьте PV через манжету с помощью нити, прикрепленной, например, к селезеночной вене (см. рисунок 4A).
- Когда ручка манжеты находится в положении «12 часов», зафиксируйте ручку и манжету бульдожьим зажимом (см. таблицу материалов), расположив их на расстоянии 2–3 мм от края фотоэлектрического стекла.
- Закрепите бульдожий зажим с помощью больших сосудистых щипцов и фиксирующей формы, чтобы установить операционное поле (см. рисунок 4B).
- Внимательно осмотрите фотоэлектрический просвет при увеличении примерно от 15 до 20x. При необходимости капающая вода может улучшить видимость просвета.
- Аккуратно возьмитесь за просвет PV и выведите его наружу через манжету.
- После полного выхода наружу закрепите его двойной лигировкой с помощью 8-0 шелковая нить вдоль канавки манжеты (рис. 4C,D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лигатура не ослаблена. Также следите за тем, чтобы точка лигатуры не была слишком большой, так как она может помешать введению манжеты. Точка лигатуры может располагаться в любом направлении. - Прикрепите манжету к IHIVC, используя процедуру, аналогичную той, которая используется для PV (рисунок 4E).
ПРИМЕЧАНИЕ: При зажиме IHIVC манжетой избегайте прикусывания паренхимы печени. Поскольку шейка короче PV, тщательно определите положение зажима. - Создайте узел, пропустив нить вокруг основания IHIVC, чтобы временно лигировать IHIVC (рис. 5). Эта нить будет удалена после реперфузии.
4. Реконструкция воротной вены
- Обезболить мышь-реципиента, индуцировав анестезию изофлураном в дозе 2,5% и уменьшив ее до 0,6% перед извлечением нативной печени, как описано в опубликованной литературе2. Перед лапаротомией не менее трех раз инфицируйте операционную область чередующимися курсами йодофора и 70% этанола.
- Убедитесь, что доля печени расположена правильно, а PV с манжетой не имеет перегибов и скручиваний.
- Аккуратно возьмитесь за край PV реципиента с помощью щипцов Pean и закрепите его тисками.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье тиски относятся к механическому устройству, используемому для крепления щипцов Pean на столе. Для получения дополнительной информации о тисках см. Таблица материалов. - Наложите сосудистый зажим на PV получателя и пройдите 8-0 шелковой нитью вокруг него.
- Создайте участок окружности 1/4 примерно в 0,5 мм от кромки фотогальванической панели (Рисунок 6A). Увеличьте отверстие, пропуская физиологический раствор через просвет с помощью специального инструмента (игла 27 G с отрезанным кончиком, изогнутым в L-образную форму).
- Прямыми щипцами захватите ручку манжеты и вставьте ее в просвет.
- После полной установки закрепите манжету с помощью 8-0 шелковая нить. Для фиксации достаточно одной перевязки.
- Снимите сосудистый зажим и реперфузируйте печень.
- Осторожно освободите щипцы Pean и завершите реконструкцию воротной вены. Весь процесс реконструкции фотоэлектрической станции должен занять около 5 минут.
5. Реконструкция нижней половой вены
- Расположите долю печени соответствующим образом и переместите щипцы Pean, прикрепленные к IHIVC реципиента дорсально, к правой нижней доле трансплантата, закрепив ее тисками.
- Удалите оставшуюся ткань печени вокруг ВМГК реципиента, аккуратно потерев ватным тампоном.
- Пас 8-0 шелковая нить вокруг IVIHC получателя.
- Создайте окружной срез 1/4 примерно в 0,5 мм от края IVIHC реципиента (рис. 6B).
- После введения в просвет обычного физиологического раствора вставить манжету в просвет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за короткой шейки манжета часто вставляется более поверхностно, чем в PV. - Тщательно закрепите манжету с помощью 8-0 шелковой нитью, а затем снимите сосудистый зажим и щипцы Pean.
6. Послеоперационный уход
- Используйте грелку и согревающую лампу, чтобы облегчить послеоперационное восстановление.
- Постоянно контролируйте артериальное давление, частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, температуру тела, а также потребление пищи и воды.
- Подкожная инъекция карпрофена (5 мг/кг, каждые 6 ч или до необходимости) для облегчения послеоперационной боли. Следуйте местным институциональным рекомендациям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если состояние мышей ухудшается, эксперимент будет немедленно остановлен, а мыши будут усыплены путем вдыхания углекислого газа. - Чтобы собрать образец ткани, повторно обезболите мышей и усыпьте их методом, одобренным IACUC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Реконструкция ЛВ успешна, когда при разжатии воротной вены нет извитости, а печень равномерно перфузируется. Внутрипеченочное время должно быть менее 20 минут, так как печеночное время, превышающее 25 минут, увеличивает риск смертности мышей. Реконструкция IHIVC считается успешной, если нет регургитации крови из трансплантата.
Хранение трансплантата при низких температурах в течение 1 ч с использованием органосохраняющего раствора приводит к тому, что уровень аланинаминотрансферазы в сыворотке крови составляет около 2000 Ед/л через 6 ч после реперфузии (рис. 7A). Выживаемость составляет 100% через 7 дней после трансплантации (рисунок 7B). Однако в нашей модели без анастомоза печеночной артерии мыши-реципиенты могут стать жертвами внутрипеченочных проблем, связанных с биломой, примерно через 30 дней после трансплантации
Рисунок 1: Инструменты для реконструкции сосудов. Прямые или изогнутые щипцы используются по мере необходимости для ситуации и операционного поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроскоп. Микроскоп оснащен линзой объектива с 10-кратным увеличением и линзой окуляра с увеличением не менее 0,8-кратного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подготовка манжеты. (A) Манжета для PV и IHIVC. (B) Схематическое изображение процесса создания канавки на манжете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Крепление манжеты. (A) Резьба, прикрепленная к PV, вводится в манжету. (B) Настройка прибора для крепления манжеты. (C) Закрепление манжеты с помощью 8-0 шелковые перевязки. (D) Схематическое изображение экстернализации сосудов и фиксации к манжете. (E) Завершенное крепление манжеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Временная перевязка корня IHIVC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Сосудистая реконструкция. На этом рисунке показаны места для создания отверстий для (A) PV и (B) IHIVC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Послеоперационные результаты. (A) Сывороточные уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) через 6 ч после реперфузии. CIT, холодовое ишемическое время; Tx, трансплантация. p < 0,0001. (B) Выживание реципиента после MOLT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение сосудистой реконструкции является наиболее сложным аспектом достижения успешного MOLT. Качество манжеты существенно влияет на сложность реконструкции, учитывая небольшой размер мышей5. В этой статье представлен подробный протокол подготовки, прикрепления и реконструкции манжеты.
Хотя нет существенных отличий от предыдущих отчетов в отношении подготовки манжеты и соединения 2,5, следует учитывать некоторые незначительные моменты. Во-первых, толщина ручки манжеты должна быть ограничена примерно 1/6 от общей окружности. Если она слишком тонкая, ручка может легко согнуться и стать трудной для захвата. Если он слишком толстый, его может быть трудно обработать в животе реципиента. Важно определить свои личные предпочтения на раннем этапе.
Во-вторых, видимость просвета на заднем столе имеет решающее значение. Используется нейлоновая нить 10-0, прикрепленная к селезеночной вене донора в качестве ориентира для подтверждения просвета PV. Нейлоновая нить размещена в положении «8 часов», чтобы предотвратить чрезмерное скручивание. Стенку сосуда выносят наружу, захватывая ее в положениях «3 часа» и «9 часов» двумя щипцами и прижимая к стенке манжеты в положении «6 часов». Фиксация с 8-0 Шелковая нить требует осторожных движений. Адекватная фиксация достигается за счет закрепления его в пазу. После установки поднимите манжету, чтобы убедиться, что она не снимается.
В-третьих, во время реконструкции важно не создавать слишком большое отверстие в сосуде-реципиенте, потому что отверстие естественным образом увеличивается по мере введения манжеты. Проделывание большого отверстия может привести к расщеплению сосуда, что является наиболее распространенной причиной отказа. В частности, при реконструкции IHIVC следует делать отверстия меньшего размера, поскольку меньшая длина IHIVC облегчает его извлечение, чем PV. При прохождении физиологического раствора через просвет поддерживайте введение манжеты, прикладывая усилие вверх, а не вниз.
Распространенные причины неудач и меры предосторожности были подробно рассмотрены. Наиболее важными моментами являются обеспечение четкой визуализации внутреннего просвета сосуда и предотвращение ненужного усилия при введении манжеты для предотвращения расщепления сосуда. Считается, что эти технические советы по методу манжеты повышают навыки и продвигают исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного автора нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана фундаментальным исследованием JST 2022 года (Японское общество трансплантологии).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
