Summary
Ce protocole fournit des informations techniques pour la reconstruction vasculaire à l’aide de la technique du brassard dans la transplantation hépatique orthotopique de souris.
Abstract
La transplantation hépatique orthotopique de souris est une méthodologie efficace pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’ischémie hépatique et des lésions de reperfusion. Cependant, les défis techniques constituent un obstacle à l’utilisation de ce précieux modèle expérimental et à la transmission de ces compétences à la prochaine génération. L’aspect le plus difficile de cette procédure est la reconstruction vasculaire, y compris la veine porte (PV), la veine cave inférieure infrahépatique (IHIVC) et la veine cave inférieure suprahépatique. L’utilisation de brassards en plastique, plutôt que de sutures, permet une reconstruction PV et IHIVC plus fluide. Les vaisseaux sont reconstruits en fixant un brassard fabriqué à partir d’un cathéter intraveineux à l’extrémité du vaisseau greffé et en interposant le brassard dans le vaisseau receveur. Les deux aspects les plus cruciaux sont de visualiser correctement la lumière interne du vaisseau et d’éviter l’utilisation d’une force excessive. Notre objectif est de fournir un aperçu technique des reconstructions vasculaires à l’aide de la technique du brassard en chirurgie du receveur. Ces conseils techniques pour la technique du brassard devraient aider les microchirurgiens à faciliter la reconstruction vasculaire et à faire avancer leurs recherches.
Introduction
La transplantation hépatique orthotopique de souris (MOLT) est une méthode expérimentale efficace signalée pour la première fois en 19911. Ce modèle expérimental, qui utilise des souris génétiquement modifiées et divers réactifs de recherche, a joué un rôle central dans l’étude de l’ischémie chaude et froide et des lésions de reperfusion. Cependant, la grande complexité technique du modèle a entravé le développement d’une médecine de base pour la transplantation hépatique2. La MOLT comporte trois étapes principales : (1) le prélèvement du foie de la souris donneuse, (2) la chirurgie de la table arrière et (3) l’implantation du foie chez le receveur. Parmi ces procédures de receveur, l’anastomose vasculaire pose le plus grand défi. Alors que l’anastomose de la veine cave inférieure suprahépatique est généralement complétée par une couture à la main2, la veine cave inférieure infrahépatique (IHIVC) et la veine porte (PV) peuvent être reconstruites plus efficacement à l’aide de brassards en plastique au lieu de sutures cousues à la main.
La période anhépatique signifie l’intervalle entre l’ablation du foie natif du receveur et l’implantation du greffon. Pour garantir des résultats cohérents, il est impératif de limiter le temps anhépatique à moins de 20 min. Par conséquent, les études utilisant ce modèle ont été limitées à des institutions spécifiques 3,4,5,6,7,8,9. Parmi les différentes étapes de la MOLT, la réalisation d’une reconstruction PV et IHIVC en douceur est cruciale pour minimiser le temps anhépatique et assurer la réussite de la transplantation.
La reconstruction PV et IVC est généralement réalisée à l’aide de brassards vasculaires puisque la technique du brassard simplifie l’anastomose vasculaire par rapport aux sutures cousues à la main 2,5,8. La technique impliquée dans la préparation du brassard vasculaire et la fixation sécurisée du brassard a un impact significatif sur la complexité de la reconstruction vasculaire du receveur. Notre objectif est de fournir un guidage visuel détaillé pour de nombreux conseils techniques liés à la méthode du brassard, réduisant ainsi la courbe d’apprentissage. Ces clips vidéo permettront de bien comprendre comment fixer le brassard aux vaisseaux et reconstruire le PV et l’IHIVC pendant la chirurgie du receveur.
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Protocol
Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d’expérimentation animale de l’Université de Kyoto. L’étude a utilisé des souris C57BL/6, âgées de plus de 10 semaines et pesant entre 25 g et 30 g, obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Tous les animaux ont été anesthésiés avec de l’isoflurane à 2,5 % (selon les protocoles approuvés par l’établissement), maintenus dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, et toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la réglementation sur l’expérimentation animale de l’Université de Kyoto. Les instruments appropriés utilisés pour l’étude sont énumérés dans la Table des matériaux et illustrés à la figure 1 et à la figure 2.
1. Sélection des animaux
- Utilisez des souris d’un poids corporel de 25 à 30 g.
REMARQUE : Bien que les allogreffes de foie de souris2 soient généralement acceptées à travers la barrière complexe d’histocompatibilité majeure, nous avons opté pour le modèle syngénique MOLT dans cette étude pour nous concentrer sur le mécanisme détaillé de la lésion de reperfusion de l’ischémie froide10. Les souris pesant moins de 25 g ne sont pas recommandées car il est impossible d’insérer une endoprothèse interne dans un canal biliaire mince. De même, les souris pesant plus de 30 g ne sont pas recommandées en raison de la présence d’une grande quantité de graisse intra-abdominale autour des vaisseaux.
2. Fabrication de manchettes
- Préparez des cathéters intraveineux de 20 G et 16 G pour le PV et l’IHIVC, respectivement.
- À l’aide d’un scalpel, coupez le cathéter pour créer le brassard. Le corps principal du brassard doit mesurer 2 mm de longueur, avec une poignée d’extension de 1 mm (Figure 3A).
REMARQUE : Si la poignée est trop grande, il peut devenir difficile d’insérer le brassard. - Sur la surface du brassard, créez une rainure peu profonde pour la fixation du fil à l’aide du dos de la lame du scalpel.
REMARQUE : Lorsque vous appliquez l’arrière de la lame du scalpel sur le brassard, assurez-vous que la pointe de la lame est à un angle d’environ 60 degrés (comme illustré sur la figure 3B). Après avoir fait la première rainure, fixez la lame du scalpel et tournez le brassard. Idéalement, deux rainures sont recommandées, mais une seule rainure peut suffire sans problème.
3. Fixation du brassard
- Dans un récipient en plastique de forme rectangulaire, placez des petits glaçons et placez un petit gobelet en métal (6 cm de diamètre) sur le dessus. Remplissez la tasse de liquide de préservation d’organe (voir le tableau des matériaux) et placez le greffon syngénique à l’intérieur.
- Roulez doucement le greffon hépatique syngénique (extrait d’une autre souris donneuse) à l’aide d’un coton-tige, en veillant à ce que la porte hépatique soit tournée vers le haut. Retirez soigneusement tout sang stocké dans la lumière de la VCI avec un liquide de préservation d’organe.
- Enfilez le PV dans le brassard à l’aide d’un fil attaché, par exemple, à la veine splénique (voir Figure 4A).
- Avec la poignée du brassard à la position 12 heures, fixez la poignée et le brassard avec une pince bulldog (voir le tableau des matériaux), en le positionnant à 2 à 3 mm du bord PV.
- Fixez davantage la pince du bouledogue à l’aide d’une grande pince vasculaire et d’un moule de fixation pour établir le champ opératoire (voir Figure 4B).
- Inspectez soigneusement le lumen PV à un grossissement d’environ 15 à 20x. Si nécessaire, l’eau qui s’écoule peut améliorer la visibilité de la lumière.
- Saisissez doucement la lumière PV et extériorisez-la à travers le brassard.
- Une fois complètement extériorisé, fixez-le avec une double ligature à l’aide de 8-0 fil de soie le long de la rainure de la manchette (Figure 4C,D).
REMARQUE : Assurez-vous que la ligature n’est pas lâche. Veillez également à ce que le point de ligature ne soit pas trop grand, car il pourrait interférer avec l’insertion du brassard. Le point de ligature peut être positionné dans n’importe quelle direction. - Fixez le brassard à l’IHIVC en utilisant une procédure similaire à celle utilisée pour le PV (Figure 4E).
REMARQUE : Lorsque vous clampez l’IHIVC avec le ballonnet, évitez de mordre dans le parenchyme hépatique. Comme le col est plus court que le PV, déterminez soigneusement la position de serrage. - Créez un noeud coulant en passant le fil autour de la base de l’IHIVC pour ligaturer temporairement l’IHIVC (Figure 5). Ce fil sera retiré après la reperfusion.
4. Reconstruction de la veine porte
- Anesthésier la souris receveuse en induisant une anesthésie avec de l’isoflurane à 2,5 % et la réduire à 0,6 % avant d’extraire le foie natif comme décrit dans la littérature publiée2. Désinfecter la zone chirurgicale au moins trois fois en alternant des cycles d’iodophore et d’éthanol à 70 % avant la laparotomie.
- Assurez-vous que le lobe hépatique est correctement positionné et que le ballonnet est exempt de pliage et de torsion.
- Saisissez doucement le bord PV du récipient à l’aide d’une pince à grains et fixez-le avec un étau.
REMARQUE : Dans cet article, un étau fait référence à un appareil mécanique utilisé pour fixer les pinces de Péan sur la table. Pour plus d’informations sur l’étau, voir Tableau des matériaux. - Appliquez une pince vasculaire sur le PV du receveur et passez un 8-0 Du fil de soie autour de lui.
- Créez une section 1/4 de circonférence à environ 0,5 mm du bord PV (Figure 6A). Agrandissez le trou tout en faisant passer une solution saline à travers la lumière à l’aide d’un instrument spécialisé (une aiguille de 27 G dont la pointe est coupée et pliée en forme de L).
- Utilisez une pince droite pour saisir la poignée du brassard et insérez-la dans la lumière.
- Une fois complètement inséré, fixez le brassard avec un 8-0 fil de soie. Une seule ligature suffit pour la fixation.
- Retirez la pince vasculaire et reperfuser le foie.
- Relâchez délicatement la pince de Péan et terminez la reconstruction de la veine porte. L’ensemble du processus de reconstruction photovoltaïque devrait prendre environ 5 min.
5. Reconstruction de la veine cave inférieure infrahépatique
- Positionnez le lobe du foie de manière appropriée et déplacez la pince de Péan attachée à l’IHIVC dorsal du receveur vers le lobe inférieur droit du greffon, en la fixant avec un étau.
- Éliminez tout tissu hépatique restant autour de l’IVIHC du receveur en frottant doucement avec un coton-tige.
- Passer un 8-0 fil de soie autour de l’IVIHC du receveur.
- Créez une section circonférentielle de 1/4 à environ 0,5 mm du bord IVIHC du receveur (figure 6B).
- Après avoir introduit une solution saline normale dans la lumière, insérez le brassard dans la lumière.
REMARQUE : En raison du col court, le brassard est souvent inséré plus peu profondément que dans le PV. - Fixez soigneusement le brassard avec un 8-0 fil de soie, puis retirez la pince vasculaire et la pince de Péan.
6. Soins postopératoires
- Utilisez un coussin chauffant et une lampe chauffante pour faciliter la récupération postopératoire.
- Surveillez en permanence la pression artérielle, la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire, la température corporelle, ainsi que la consommation de nourriture et d’eau.
- Adminsiter injection sous-cutanée de carprofène (5 mg/kg, toutes les 6 h ou jusqu’à ce que nécessaire) pour soulager la douleur postopératoire. Suivre les directives institutionnelles locales.
REMARQUE : Si l’état des souris se détériore, l’expérience sera immédiatement arrêtée et les souris seront euthanasiées par inhalation de dioxyde de carbone. - Pour prélever l’échantillon de tissu, anesthésez à nouveau les souris et euthanasiez-les selon une méthode approuvée par l’IACUC.
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Representative Results
La reconstruction PV est réussie lorsque, lors du déclampage de la veine porte, il n’y a pas de tortuosité et que le foie est uniformément perfusé. Le temps anhépatique doit être inférieur à 20 min, car le temps anhépatique supérieur à 25 min augmente le risque de mortalité chez la souris. La reconstruction de l’IHIVC est considérée comme réussie s’il n’y a pas de régurgitation sanguine du greffon.
Le stockage du greffon à des températures froides pendant 1 h à l’aide d’une solution de préservation d’organe permet d’obtenir un taux sérique d’alanine aminotransférase d’environ 2 000 U/L 6 h après la reperfusion (figure 7A). Le taux de survie est de 100 % 7 jours après la transplantation (Figure 7B). Cependant, dans notre modèle sans anastomose de l’artère hépatique, les souris receveuses peuvent succomber à des problèmes liés au biloma intrahépatique environ 30 jours après la transplantation
Figure 1 : Instruments de reconstruction vasculaire. Des pinces droites ou courbes sont utilisées selon les besoins de la situation et du champ opératoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le microscope. Le microscope est équipé d’une lentille d’objectif avec un grossissement de 10x et d’une lentille oculaire avec un grossissement d’au moins 0,8x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation du brassard. (A) Le brassard pour le PV et l’IHIVC. (B) Une représentation schématique du processus de création d’une rainure sur le brassard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Fixation du brassard. (A) Le fil attaché au PV est passé dans le brassard. (B) Configuration de l’instrument pour la fixation du brassard. (C) Fixation du brassard avec 8-0 ligatures de soie. (D) Illustration schématique de l’externalisation vasculaire et de la fixation au brassard. (E) Fixation du brassard terminée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Ligature temporaire de la racine de l’IHIVC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Reconstruction vasculaire. Cette illustration montre les emplacements de création de trous pour (A) PV et (B) IHIVC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Résultats postopératoires. (A) Taux sériques d’alanine aminotransférase (ALT) 6 h après la reperfusion. CIT, temps ischémique froid ; Tx, transplantation. p < 0,0001. (B) La survie du receveur après la MOLT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’apprentissage de la reconstruction vasculaire est l’aspect le plus difficile de la réussite de la MOLT. La qualité du brassard influence considérablement la difficulté de la reconstruction, compte tenu de la petite taille de la souris5. Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation, la fixation et la reconstruction du brassard.
Bien qu’il n’y ait pas de différences majeures par rapport aux rapports précédents concernant la préparation et la connexion du brassard 2,5, certains points mineurs doivent être pris en compte. Tout d’abord, l’épaisseur de la poignée du brassard doit être limitée à environ 1/6 de la circonférence totale. S’il est trop fin, le manche peut facilement se plier et devenir difficile à saisir. S’il est trop épais, il peut être difficile à manipuler dans l’abdomen du receveur. Il est essentiel d’identifier vos préférences personnelles dès le début.
Deuxièmement, la visibilité de la lumière sur la table arrière est cruciale. Un fil de nylon 10-0 est utilisé, attaché à la veine splénique du donneur comme point de repère pour confirmer la lumière PV. Le fil de nylon est placé à 8 heures pour éviter une torsion excessive. La paroi du récipient est extériorisée en la saisissant à 3 heures et à 9 heures à l’aide de deux pinces et en la pressant contre la paroi du brassard à 6 heures. Fixation avec 8-0 Le fil de soie nécessite des mouvements prudents. Une fixation adéquate est obtenue en le fixant dans la rainure. Après l’avoir attaché, soulevez le brassard pour confirmer qu’il ne se détache pas.
Troisièmement, lors de la reconstruction, il est important de ne pas créer un trou trop grand dans le vaisseau receveur, car le trou s’agrandit naturellement au fur et à mesure que le brassard est inséré. Faire un grand trou peut entraîner la fissuration du vaisseau, la cause la plus fréquente de défaillance. En particulier dans la reconstruction d’un système IHIVC, des trous plus petits doivent être faits, car la longueur plus courte de l’IHIVC le rend plus facile à retirer qu’un PV. Lorsque vous faites passer une solution saline à travers la lumière, soutenez l’insertion du brassard en appliquant une force vers le haut plutôt que vers le bas.
Les causes courantes de défaillance et les précautions ont été discutées en détail. Les points les plus cruciaux consistent à assurer une visualisation claire de la lumière du vaisseau interne et à éviter les forces inutiles lors de l’insertion du brassard pour éviter la séparation des vaisseaux. On pense que ces conseils techniques pour la méthode du brassard permettent d’améliorer les compétences et de faire progresser la recherche.
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Disclosures
Aucun auteur n’a de conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la recherche fondamentale 2022 JST (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
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