Summary
Dit protocol biedt technische informatie voor vatreconstructie met behulp van de manchettechniek bij orthotope levertransplantatie bij muizen.
Abstract
Orthotope levertransplantatie bij muizen is een effectieve methodologie voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen van leverischemie en reperfusieschade. De technische uitdagingen vormen echter een barrière om dit waardevolle experimentele model te gebruiken en deze vaardigheden door te geven aan de volgende generatie. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is vasculaire reconstructie, inclusief de poortader (PV), infrahepatische inferieure vena cava (IHIVC) en suprahepatische inferieure vena cava. Het gebruik van plastic manchetten in plaats van hechtingen zorgt voor een soepelere PV- en IHIVC-reconstructie. Bloedvaten worden gereconstrueerd door een manchet gemaakt van een intraveneuze katheter aan de punt van het transplantaatvat te bevestigen en de manchet in het ontvangende vat te plaatsen. De twee meest cruciale aspecten zijn het goed visualiseren van het binnenste lumen van het vat en het vermijden van het gebruik van overmatige kracht. Ons doel is om een technisch overzicht te geven van vasculaire reconstructies met behulp van de manchettechniek bij ontvangerchirurgie. Deze technische tips voor de manchettechniek zullen naar verwachting microchirurgen helpen bij het vergemakkelijken van vasculaire reconstructie en het bevorderen van hun onderzoek.
Introduction
Orthotope levertransplantatie bij muizen (MOLT) is een effectieve experimentele methode die voor het eerst werd gerapporteerd in 19911. Dit experimentele model, dat gebruik maakt van genetisch gemodificeerde muizen en verschillende onderzoeksreagentia, heeft een cruciale rol gespeeld bij het onderzoeken van warme en koude ischemie en reperfusieletsels. De hoge technische complexiteit van het model heeft echter de ontwikkeling van een basisgeneesmiddel voor levertransplantatie belemmerd2. MOLT omvat drie grote stappen: (1) het ophalen van de lever van de donormuis, (2) een operatie aan de rugtafel en (3) implantatie van de lever in de ontvanger. Van deze ontvangerprocedures vormt vasculaire anastomose de grootste uitdaging. Terwijl de suprahepatische inferieure vena cava-anastomose meestal wordt voltooid door met de hand te naaien2, kunnen de infrahepatische inferieure vena cava (IHIVC) en poortader (PV) efficiënter worden gereconstrueerd met behulp van plastic manchetten in plaats van met de hand genaaide hechtingen.
De anhepatische periode betekent het interval tussen het verwijderen van de oorspronkelijke lever van de ontvanger en de implantatie van het transplantaat. Om consistente resultaten te garanderen, is het absoluut noodzakelijk om de anhepatische tijd te beperken tot minder dan 20 minuten. Bijgevolg zijn studies die dit model gebruiken beperkt tot specifieke instellingen 3,4,5,6,7,8,9. Van de verschillende stadia van MOLT is het bereiken van een soepele PV- en IHIVC-reconstructie cruciaal voor het minimaliseren van de anhepatische tijd en het garanderen van een succesvolle transplantatie.
PV- en IVC-reconstructie wordt over het algemeen uitgevoerd met behulp van vasculaire manchetten, aangezien de manchettechniek vasculaire anastomose vereenvoudigt in vergelijking met met de hand genaaide hechtingen 2,5,8. De techniek die betrokken is bij de voorbereiding van de vasculaire manchet en de veilige bevestiging van de manchet heeft een aanzienlijke invloed op de complexiteit van de vasculaire reconstructie van de ontvanger. Ons doel is om gedetailleerde visuele begeleiding te bieden voor tal van technische tips met betrekking tot de manchetmethode, waardoor de leercurve wordt verkort. Deze videoclips geven een duidelijk inzicht in hoe de manchet aan de bloedvaten moet worden bevestigd en hoe de PV en IHIVC moeten worden gereconstrueerd tijdens een operatie aan de ontvanger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Comité voor Dierproeven van de Universiteit van Kyoto. Voor het onderzoek werd gebruik gemaakt van C57BL/6-muizen, ouder dan 10 weken en met een gewicht tussen 25 g en 30 g, verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel). Alle dieren werden verdoofd met 2,5% isofluraan (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen), gehouden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften voor dierproeven van de Universiteit van Kyoto. De geschikte instrumenten die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel en zijn weergegeven in figuur 1 en figuur 2.
1. Selectie van dieren
- Gebruik muizen met een lichaamsgewicht van 25-30 g.
OPMERKING: Hoewel levertransplantaten2 van muizen over het algemeen worden geaccepteerd in de belangrijkste histocompatibiliteitscomplexbarrière, hebben we in deze studie gekozen voor het syngene MOLT-model om ons te concentreren op het gedetailleerde mechanisme van koude ischemie-reperfusieschade10. Muizen met een gewicht van minder dan 25 g worden niet aanbevolen omdat het onmogelijk is om een binnenste stent in een dunne galbuis in te brengen. Evenzo worden muizen met een gewicht van meer dan 30 g niet aanbevolen vanwege de aanwezigheid van een grote hoeveelheid intra-abdominaal vet rond de bloedvaten.
2. Manchet maken
- Bereid intraveneuze katheters van 20 G en 16 G voor op respectievelijk de PV en IHIVC.
- Snijd met een scalpel de katheter door om de manchet te maken. Het hoofdgedeelte van de manchet moet 2 mm lang zijn, met een verlenghandvat van 1 mm (Figuur 3A).
NOTITIE: Als het handvat te groot is, kan het een uitdaging worden om de manchet in te brengen. - Maak op het oppervlak van de manchet een ondiepe groef voor draadfixatie met behulp van de achterkant van het scalpelmesje.
NOTITIE: Wanneer u de achterkant van het scalpelmesje op de manchet aanbrengt, zorg er dan voor dat de punt van het mesje in een hoek van ongeveer 60 graden staat (zoals weergegeven in afbeelding 3B). Nadat u de eerste groef hebt gemaakt, zet u het scalpelmesje vast en draait u de manchet. Idealiter worden twee groeven aanbevolen, maar een enkele groef kan zonder problemen volstaan.
3. Manchet bevestiging
- Plaats kleine ijsblokjes in een plastic rechthoekige bak en plaats er een kleine metalen beker (6 cm in diameter) op. Vul de beker met vloeistof voor het behoud van organen (zie Materiaaltabel) en plaats het syngene transplantaat erin.
- Rol het syngene levertransplantaat (geëxtraheerd uit een andere donormuis) voorzichtig op met een wattenstaafje en zorg ervoor dat de porta hepatis naar boven wijst. Verwijder al het bloed dat in het lumen van de IVC is opgeslagen grondig met vloeistof voor het behoud van organen.
- Rijg de PV door de manchet met behulp van een draad die bijvoorbeeld aan de miltina is bevestigd (zie afbeelding 4A).
- Met de manchethandgreep op de 12-uurspositie, zet u zowel de handgreep als de manchet vast met een bulldog-klem (zie Materiaaltabel) en plaatst u deze op 2 tot 3 mm van de PV-rand.
- Zet de bulldogklem verder vast met behulp van een grote vasculaire pincet en een fixatiemal om het operatieveld vast te stellen (zie afbeelding 4B).
- Inspecteer het PV-lumen zorgvuldig bij een vergroting van ongeveer 15 tot 20x. Indien nodig kan druppelend water de zichtbaarheid van het lumen verbeteren.
- Pak het PV-lumen voorzichtig vast en externaliseer het door de manchet.
- Eenmaal volledig geëxternaliseerd, zet u het vast met een dubbele ligatie met behulp van 8-0 zijden draad langs de groef van de manchet (Figuur 4C,D).
NOTITIE: Zorg ervoor dat de ligatuur niet los zit. Zorg er ook voor dat het ligatuurpunt niet te groot is, omdat dit het inbrengen van de manchet kan hinderen. Het ligatuurpunt kan in elke richting worden gepositioneerd. - Bevestig de manchet aan de IHIVC met behulp van een procedure die vergelijkbaar is met die van de PV (Figuur 4E).
NOTITIE: Wanneer u de IHIVC met de manchet vastklemt, vermijd dan om in het leverparenchym te bijten. Aangezien de hals korter is dan de PV, moet u zorgvuldig de klempositie bepalen. - Maak een slipknoop door de draad rond de basis van de IHIVC te halen om de IHIVC tijdelijk vast te zetten (Figuur 5). Deze draad wordt na reperfusie verwijderd.
4. Reconstructie van de poortader
- Verdoof de ontvangende muis door anesthesie te induceren met isofluraan op 2,5% en verminder dit tot 0,6% voordat de oorspronkelijke lever wordt geëxtraheerd, zoals beschreven in gepubliceerde literatuur2. Infecteer het operatiegebied ten minste drie keer met afwisselende rondes jodofoor en 70% ethanol vóór laparotomie.
- Zorg ervoor dat de leverkwab goed is gepositioneerd en dat de PV met manchet vrij is van knikken en torsie.
- Pak de PV-rand van de ontvanger voorzichtig vast met een Pean-pincet en zet deze vast met een bankschroef.
OPMERKING: In dit artikel verwijst een bankschroef naar een mechanisch apparaat dat wordt gebruikt om een Pean-pincet op tafel te bevestigen. Voor meer informatie over bankschroef, zie Tabel met materialen. - Breng een vasculaire klem aan op de PV van de ontvanger en geef een 8-0 door zijden draad eromheen.
- Maak een 1/4 omtrekdoorsnede op ongeveer 0,5 mm van de PV-rand (Figuur 6A). Vergroot het gat terwijl u de zoutoplossing door het lumen haalt met behulp van een speciaal instrument (een naald van 27 G waarvan de punt is afgesneden en in een L-vorm is gebogen).
- Gebruik een rechte tang om het handvat van de manchet vast te pakken en in het lumen te steken.
- Eenmaal volledig ingebracht, zet u de manchet vast met een 8-0 zijden draad. Een enkele ligatie is voldoende voor fixatie.
- Verwijder de vaatklem en reperfuse de lever.
- Laat de Pean-pincet voorzichtig los en voltooi de reconstructie van de poortader. Het hele reconstructieproces van PV duurt ongeveer 5 minuten.
5. Reconstructie van infrahepatische vena cava
- Plaats de leverkwab op de juiste manier en verplaats de Pean-pincet die dorsaal aan de IHIVC-tang van de ontvanger is bevestigd naar de rechter onderkwab van het transplantaat en zet deze vast met een bankschroef.
- Verwijder eventueel achtergebleven leverweefsel rond de IVIHC van de ontvanger door zachtjes te wrijven met een wattenstaafje.
- Geef een 8-0 zijden draad rond de IVIHC van de ontvanger.
- Maak een 1/4 omtrekdoorsnede op ongeveer 0,5 mm van de IVIHC-rand van de ontvanger (Figuur 6B).
- Nadat u een normale zoutoplossing in het lumen hebt ingebracht, steekt u de manchet in het lumen.
LET OP: Door de korte hals wordt de manchet vaak ondieper ingebracht dan bij de PV. - Zet de manchet voorzichtig vast met een 8-0 zijden draad en verwijder vervolgens de vasculaire klem en Pean-pincet.
6. Postoperatieve zorg
- Gebruik een verwarmingskussen en een verwarmingslamp om het postoperatieve herstel te vergemakkelijken.
- Bewaak continu de bloeddruk, hartslag, ademhalingsfrequentie, lichaamstemperatuur, evenals voedsel- en waterconsumptie.
- Adminsiter subcutane injectie van carprofen (5 mg/kg, elke 6 uur of tot nodig) om postoperatieve pijn te verlichten. Volg de lokale richtlijnen van de instelling.
OPMERKING: Als de toestand van muizen verslechtert, wordt het experiment onmiddellijk stopgezet en worden muizen geëuthanaseerd door inademing van kooldioxide. - Om het weefselmonster te verzamelen, verdooft u de muizen opnieuw en euthanaseert u ze volgens een door de IACUC goedgekeurde methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PV-reconstructie is succesvol wanneer er bij het losmaken van de poortader geen kronkeling is en de lever gelijkmatig is doorbloed. De anhepatische tijd moet minder dan 20 minuten zijn, omdat anhepatische tijden van meer dan 25 minuten het risico op muizensterfte verhogen. IHIVC-reconstructie wordt als succesvol beschouwd als er geen bloedoprispingen uit het transplantaat zijn.
Het transplantaat gedurende 1 uur bij koude temperaturen bewaren met behulp van een oplossing voor orgaanconservering resulteert in een serumalanineaminotransferasespiegel van ongeveer 2.000 E/L 6 uur na reperfusie (figuur 7A). Het overlevingspercentage is 100% 7 dagen na transplantatie (Figuur 7B). In ons model zonder anastomose van de leverslagader kunnen ontvangende muizen echter ongeveer 30 dagen na de transplantatie bezwijken aan intrahepatische biloma-gerelateerde problemen
Figuur 1: Instrumenten voor vasculaire reconstructie. Rechte of gebogen pincetten worden gebruikt zoals nodig voor de situatie en het operatieveld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De microscoop. De microscoop is uitgerust met een objectieflens met een vergroting van 10x en een oculairlens met een vergroting van minimaal 0,8x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbereiding van de manchet. (A) De manchet voor de PV en IHIVC. (B) Een schematische weergave van het proces van het maken van een groef op de manchet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 4: Manchetbevestiging. (A) De draad die aan de PV is bevestigd, wordt in de manchet geleid. (B) Instrumentinstelling voor manchetbevestiging. (C) De manchet vastzetten met 8-0 zijden ligaties. (D) Schematische weergave van vasculaire externalisatie en fixatie op de manchet. (E) Voltooide manchetbevestiging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Tijdelijke ligatie van de IHIVC-wortel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Vasculaire reconstructie. Deze afbeelding toont de locaties voor het maken van gaten voor (A) PV en (B) IHIVC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Postoperatieve resultaten. (A) Serumspiegels van alanineaminotransferase (ALAT) 6 uur na reperfusie. CIT, koude ischemische tijd; Tx, transplantatie. p < 0,0001. (B) Overleving van de ontvanger na MOLT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het leren van vasculaire reconstructie is het meest uitdagende aspect van het bereiken van een succesvolle MOLT. De kwaliteit van de manchet heeft een aanzienlijke invloed op de moeilijkheidsgraad van de reconstructie, gezien het kleine formaat van muizen5. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding, bevestiging en reconstructie van de manchet.
Hoewel er geen grote verschillen zijn met eerdere rapporten met betrekking tot de voorbereiding en aansluiting van de manchet 2,5, moeten enkele kleine punten in overweging worden genomen. Ten eerste moet de dikte van de manchet worden beperkt tot ongeveer 1/6 van de totale omtrek. Als het te dun is, kan het handvat gemakkelijk buigen en moeilijk vast te pakken worden. Als het te dik is, kan het een uitdaging zijn om het in de buik van de ontvanger te hanteren. Het is essentieel om uw persoonlijke voorkeur in een vroeg stadium vast te stellen.
Ten tweede is de zichtbaarheid van het lumen aan de achterkant van de tafel cruciaal. Er wordt een 10-0 nylondraad gebruikt, die als oriëntatiepunt aan de miltina van de donor is bevestigd om het PV-lumen te bevestigen. De nylondraad wordt op 8 uur geplaatst om overmatig draaien te voorkomen. De vaatwand wordt naar buiten gebracht door deze op 3 uur en 9 uur met twee tangen vast te pakken en op 6 uur tegen de manchetwand te drukken. Fixatie met 8-0 Zijdedraad vereist voorzichtige bewegingen. Adequate fixatie wordt bereikt door het in de groef te bevestigen. Til na bevestiging de manchet op om te bevestigen dat deze niet loskomt.
Ten derde is het belangrijk om tijdens de reconstructie geen te groot gat in het ontvangende vat te maken, omdat het gat op natuurlijke wijze groter wordt als de manchet wordt ingebracht. Het maken van een groot gat kan leiden tot het splijten van het vat, de meest voorkomende oorzaak van falen. Vooral bij IHIVC-reconstructie moeten kleinere gaten worden gemaakt, omdat de kortere lengte van IHIVC het gemakkelijker maakt om eruit te trekken dan een PV. Wanneer u een zoutoplossing door het lumen passeert, ondersteunt u het inbrengen van de manchet door opwaartse kracht uit te oefenen in plaats van naar beneden.
Veelvoorkomende oorzaken van falen en voorzorgsmaatregelen zijn in detail besproken. De meest cruciale punten zijn onder meer het waarborgen van een duidelijke visualisatie van het lumen van het binnenste vat en het vermijden van onnodige kracht tijdens het inbrengen van de manchet om splijten van het vat te voorkomen. Deze technische tips voor de manchetmethode worden verondersteld vaardigheden te verbeteren en onderzoek te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen enkele auteur heeft belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door JST fundamenteel onderzoek uit 2022 (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
