Summary
Kolonisering af plantevækstfremmende rhizobakterier (PGPR) i rhizosfæren er afgørende for dens vækstfremmende virkning. Det er nødvendigt at standardisere metoden til påvisning af bakteriel rhizosfærekolonisering. Her beskriver vi en reproducerbar metode til kvantificering af bakteriekolonisering på rodoverfladen.
Abstract
Måling af bakteriekolonisering på Arabidopsis thaliana rod er et af de hyppigste forsøg i plante-mikrobe interaktionsundersøgelser. En standardiseret metode til måling af bakteriekolonisering i rhizosfæren er nødvendig for at forbedre reproducerbarheden. Vi dyrkede først steril A. thaliana under hydroponiske forhold og podede derefter bakteriecellerne i rhizosfæren ved en endelig koncentration på OD600 på 0,01. 2 dage efter podning blev rodvævet høstet og vasket tre gange i sterilt vand for at fjerne de ukoloniserede bakterieceller. Rødderne blev derefter vejet, og bakteriecellerne koloniseret på roden blev opsamlet af hvirvel. Cellesuspensionen blev fortyndet i en gradient med en fosfatbufret saltvandsbuffer (PBS) efterfulgt af plettering på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Pladerne blev inkuberet ved 37 °C i 10 timer, og derefter blev de enkelte kolonier på LB-plader talt og normaliseret for at indikere bakteriecellerne koloniseret på rødder. Denne metode anvendes til at detektere bakteriekolonisering i rhizosfæren under monointeraktionsbetingelser med god reproducerbarhed.
Introduction
Der er kvantitative og kvalitative metoder til påvisning af rhizosfærekolonisering af en enkelt bakteriestamme. Til den kvalitative metode bør der anvendes en stamme, der konstitutivt udtrykker fluorescens, og fluorescensfordelingen og -intensiteten bør undersøges ved fluorescensmikroskopi eller laserkonfokale instrumenter 1,2. Disse strategier kan godt afspejle bakteriel kolonisering in situ3, men de er ikke så nøjagtige som traditionelle pladetællingsmetoder til kvantificering. På grund af begrænsningen ved kun at vise delvise rodzoner under mikroskopet kan det undertiden påvirkes af subjektiv bias.
Her beskriver vi en kvantitativ metode, som omfatter indsamling af de koloniserede bakterieceller og tælling af de bakterielle CFU'er på en plade. Denne metode er baseret på fortynding og plettering, hvorved de koloniserede stammer, der blev fjernet fra planterødder, kan tælles, og det samlede koloniserede bakterieantal på roden kan beregnes 4,5.
For det første blev A. thaliana dyrket under hydroponiske forhold, og derefter blev bakterieceller inokuleret i rhizosfæren i en endelig koncentration på 0, 01 OD600. De inficerede rodvæv blev høstet 2 dage efter podning og vasket i sterilt vand for at fjerne de ukoloniserede bakterieceller. Endvidere blev bakterieceller koloniseret på roden opsamlet, fortyndet i fosfatbufret saltvand (PBS) buffer og belagt på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Efter inkubation ved 37 °C i 10 timer blev enkelte kolonier på LB-plader talt og normaliseret for at bestemme bakteriecellerne koloniseret på rødder.
Denne metode er meget anvendelig, har god repeterbarhed og er mere egnet til nøjagtig bestemmelse af rhizosfærens bakterielle kolonisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steril hydroponisk dyrkning af A. thaliana
- Forbered A. thaliana frøplanter.
- Forbered kultur A. thaliana frøplanter medium, som består af 1/2 MS medium (Murashige og Skoog) med 2% (vægt / vol) saccharose og 0,9% (vægt / vol) agar.
- Hæld det tilberedte steriliseringsmedium i sterile firkantede petriskåle (13 cm x 13 cm) inden størkning. Undgå lufttørring for at opretholde fugtigheden.
- Nedsænk A. thaliana frø i et 2 ml mikrocentrifugerør fyldt med 1 ml sterilt vand ved 4 ° C i over 12 timer, og steriliser derefter frøene med 1 ml 2% (vol / vol) NaClO i 2 minutter.
- Vask frøene grundigt med sterilt vand seks gange for at fjerne NaClO-opløsningen. Så frøene på petriskåle med MS agarmedium med en steril 1 ml spids.
- Forsegl petriskålene med åndbart medicinsk tape og læg dem lodret i en let inkubator for at vokse i 1 uge. Indstil lysinkubatorens dag/nat-forhold til 16 timer/8 timer, hold temperaturen på 23 °C og luftfugtigheden på 40%-60%.
- Transplantation A. thaliana.
- Skær 5 mm huller på 40 μm cellefarvning i porestørrelse og steriliser dem.
- Transplanter tre 7 dage gamle A. thaliana planter gennem hullerne i en cellesil og læg dem i en 6-brønds plade indeholdende 3 ml steril væske 1/2 MS medium med 0,5% saccharose.
- Placer 6-brøndpladerne i en let inkubator (figur 1A) og inkuber i 10 dage.
2. Bakteriedyrkning og podning
- Forbered bakteriel suspension til podning.
- For Bacillus velezensis podes bakterieceller i sterilt LB-medium og inkuberes ved 37 °C med omrystning ved 170 rpm, indtil det når OD600 på 0,8-1,2.
- Bakteriecellerne opsamles ved centrifugering ved 6000 x g i 2 minutter og resuspenderes cellerne i PBS-buffer (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Gentag centrifugerings- og resuspenderingstrinnene 3 gange for at fjerne LB-substratet og bakteriemetabolitterne.
- Suspender bakteriecellerne i et frisk 1/2 MS-medium ved en slutkoncentration påOD 600 0,01. Inokulere bakteriesuspensionerne til de 6-brøndplader, der vokser A. thaliana-frøplanter , læg 6-brøndpladerne i lysinkubatoren og dyrk dem i 2 dage.
3. Måling af bakterier koloniseret på rødder
- Høst rodvævet og plade de koloniserede celler.
BEMÆRK: Alle trin skal udføres under gnotobiotisk tilstand- Vej de 2 ml rør, og registrer vægten som W0.
- Høst de co-dyrkede A. thaliana rodvæv og vask dem i sterilt vand 3 gange. Placer roden på filterpapir for at fjerne overskydende vand.
- Sæt roden i det vejede mikrocentrifugerør, vej rødderne sammen med røret, og registrer det som W1.
- Tilsæt 1 ml PBS til hvert rør og hvirvel rørene i 8 minutter ved maksimal hastighed.
- Fortynd suspensionerne med de opsamlede rodkoloniserede bakterieceller til 1 x 10-1-1 x 10-4 (ifølge bakteriekoloniseringsevnen). De fortyndede bakteriesuspensioner fordeles på plader indeholdende LB-agarsubstrat og inkuberes ved 37 °C i 10 timer.
- Tæl kolonierne og normaliser dataene.
- Tæl bakteriekolonierne på LB-plader.
- Beregn CFU'erne i henhold til den tilsvarende fortynding, og normaliser dataene med rodfriskvægt (W1-W 0). De endelige resultater angiver antallet af bakterieceller koloniseret pr. gram rod 2 dage efter podning (figur 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at teste nøjagtigheden af bakteriernes koloniseringsevne påvist ved denne metode i A. thaliana rhizosfæren, podede vi Bacillus velezensis SQR9 WT og en afledt mutant Δ8mcp i A. thaliana rhizosfæren separat. Δ8mcp er en mutant, der mangler alle kemoreceptorkodende gener, og den har en signifikant nedsat kolonisering6. Vi målte deres kolonisering 2 dage efter podning ved hjælp af den nuværende rodkoloniseringsanalyse. Resultaterne viste en signifikant rodkoloniseringsreduktion af Δ8mcp, hvilket indikerer, at denne tilstand og metode effektivt måler bakteriekoloniseringen (figur 1C).
Figur 1: Dyrkning af A. thaliana og rodkoloniseringen af Bacillus velezensis SQR9 og Δ8mcp. (A) Set ovenfra af 7 dage gammel A. thaliana, der vokser i 6-brøndsplader med cellefarvning i hydroponisk tilstand. (B) Set fra siden af 7 dage gammel A. thaliana, der vokser i plader med 6 brønde, der hver indeholder 3 frøplanter. (C) Kolonisering af B. velezensis vildtype SQR9 og Δ8mcp målt ved hjælp af det præsenterede assay. Seks replikater blev inkluderet, og dataene præsenteres som gennemsnitlige ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå god reproducerbarhed er der fire kritiske trin til koloniseringsdetekteringsprocessen for denne protokol. For det første er det nødvendigt at sikre, at antallet af podede bakterieceller er nøjagtigt det samme i hvert forsøg. For det andet er det også nødvendigt at kontrollere den ukoloniserede bakterierensningsintensitet med sterilt vand. For det tredje skal hver prøvefortyndingsproces hvirvelbehandles, før den udføres, for at lade prøven være i en fuldstændig blandingstilstand for at undgå absorptionsfejl på grund af egenskaberne ved bakterier, der er lette at synke i mikrocentrifugerøret. Derfor anbefaler vi at bruge et hvirvelinstrument til at blande bakteriesuspensionen før hver absorption. For det fjerde bør asepsis sikres strengt under alle operationer ved anvendelse af denne metode for at undgå enhver mulighed for kontaminering.
Denne metode bruges til at bestemme bakterierne koloniseret på rodoverfladen. Bortset fra rodoverfladebakterier koloniserer endofytiske bakterier og svampe også plantens rhizosfære7. Endofytiske bakteriers koloniseringsevne kan stadig påvises ved hjælp af protokollen beskrevet i dette papir, men rodvævet skal males for at frigive endofytiske bakterier. Imidlertid er de endofytiske svampe forskellige fra bakterier. De fleste af de almindelige metoder bruger transmissionselektronmikroskopi (TEM) til at observere væksten af hyfer, som er en kvalitativ detektionsmetode svarende til fluorescerende mærkningsbakterier til visualisering8.
Når man sammenligner koloniseringen af forskellige stammer, bør de ikke podes i en 6-brønds plade for at undgå påvirkning af de bakterielle flygtige forbindelser9 og planteflygtige forbindelser10,11. Vi valgte 2-dages post-podning til påvisning af rod, fordi koloniseringen af SQR9 nåede maksimum mellem 2 og 4 dage; Tiden til påvisning af bakteriekoloniseringen kan justeres i henhold til stammerne.
Sammenlignet med andre beskrevne metoder er denne metode nøjagtig og nem at betjene. For eksempel har metoden beskrevet af Noam et al. den faste dyrkede arabidopsis podet med bakterier straks, når den transplanteres til hydroponisk tilstand12,13. Her foreslår vi, at bakterierne skal podes til rhizosfæren efter flere dages transplantation for at undgå påvirkning af plantetilpasning til det ændrede vækstmiljø. Metoden beskrevet i denne undersøgelse er også god for planter at frigive rodekssudat, hvilket påvirker kolonisering.
For at lade planteskuddene vokse separat i luften og helt væk fra væskenedsænkningen, lavede vi nogle mindre ændringer og behandling på cellefarvningen for at gøre dem tilgængelige for denne hydroponiske metode. Desuden er denne metode mere egnet til nøjagtig bakteriekoloniseringsbestemmelse i små mængder, men ikke for store mængder rodekssudater indsamlet i hydrokultur14. Det er vigtigt at bemærke, at denne metode er modificeret baseret på tidligere offentliggjorte undersøgelser 12,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (32370135), innovationsprogrammet fra det kinesiske akademi for landbrugsvidenskab (CAAS-CSAL-202302), videnskabs- og teknologiprojektet fra Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
