水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

Summary

根圏における植物成長促進根圏細菌(PGPR)のコロニー形成は、その成長促進効果に不可欠です。細菌の根圏コロニー形成の検出方法を標準化する必要があります。ここでは、根の表面での細菌のコロニー形成を定量化するための再現性のある方法について説明します。

Abstract

シロイヌナズナの根の細菌のコロニー形成を測定することは、植物と微生物の相互作用研究において最も頻繁な実験の1つです。根圏における細菌のコロニー形成を測定するための標準化された方法は、再現性を向上させるために必要です。まず、無菌のA.thalianaを水耕栽培状態で培養し、根圏の細菌細胞を最終濃度OD60000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000接種後2日目に、根組織を採取し、滅菌水で3回洗浄して、コロニーを形成していない細菌細胞を除去しました。次に、根の重量を量り、根にコロニーを形成した細菌細胞を渦によって収集しました。細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液でグラジエントで希釈した後、Luria-Bertani(LB)寒天培地にプレーティングしました。プレートを37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントし、根にコロニーを形成した細菌細胞を示すために正規化しました。この方法は、単相互作用条件で根圏内の細菌のコロニー形成を良好な再現性で検出するために使用されます。

Introduction

単一の細菌株による根圏のコロニー形成を検出するための定量的および定性的な方法があります。定性的方法には、蛍光を構成的に発現する株を使用し、蛍光分布と強度を蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点装置^1,2で調べる必要があります。これらの戦略は、in situ³ で細菌のコロニー形成をよく反映できますが、定量化における従来のプレート計数方法ほど正確ではありません。また、顕微鏡下では部分的な根域しか表示できないという制限があるため、主観的な偏見の影響を受けることがあります。

ここでは、コロニーを形成した細菌細胞を収集し、プレート上の細菌CFUをカウントすることを含む定量的方法について説明します。この方法は、植物の根から取り除かれたコロニー化された株を数えることができ、根上のコロニー化された細菌の総数を計算することができる希釈とプレーティングに基づいています^4,5。

まず、 A. thaliana を水耕栽培条件で培養し、次いで細菌細胞を根圏に最終濃度0.01OD₆₀₀で接種した。感染した根組織は、接種後2日で採取され、滅菌水で洗浄されて、コロニー化されていない細菌細胞を除去した。さらに、根にコロニーを形成した細菌細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で希釈し、Luria-Bertani(LB)寒天培地に播種しました。37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントして標準化し、根にコロニーを形成した細菌細胞を決定しました。

この方法は、適用性が高く、再現性が高く、根圏細菌のコロニー形成を正確に測定するのに適しています。

Protocol

1.無菌水耕栽培A.thaliana栽培

1. A. thalianaの苗を準備します。
   1. 2%(wt/vol)のスクロースと0.9%(wt/vol)の寒天を含む1/2MS培地(MurashigeおよびSkoog)からなる培養 A.thaliana 苗培地を調製します。
   2. 調製した滅菌培地を滅菌正方形のペトリ皿(13 cm x 13 cm)に注ぎ、固化させます。湿度を保つために風乾は避けてください。
   3. A. thalianaの種子を、1 mLの滅菌水で満たした2 mLの微量遠心チューブに4°Cで12時間以上浸漬し、次いで種子を1 mLの2%(vol/vol)NaClOで2分間滅菌します。
   4. 種子を滅菌水で6回完全に洗浄し、NaClO溶液を除去します。滅菌チップ1mLのMS寒天培地でペトリ皿に種をまきます。
   5. 通気性のある医療用テープでシャーレを密封し、軽いインキュベーターに垂直に置いて1週間成長させます。ライトインキュベーターの昼夜比を16時間/ 8時間に設定し、温度を23°C、湿度を40%〜60%に保ちます。
2. A.thalianaを移植します。
   1. 孔径40 μmの細胞染色剤に5 mmの穴を開け、滅菌します。
   2. 生後7日齢の A. thaliana 植物3本を細胞ストレーナーの穴に移植し、0.5%スクロースを含む3mLの滅菌液体1/2MS培地を含む6ウェルプレートに入れます。
   3. 6ウェルプレートを軽いインキュベーター(図1A)に入れ、10日間インキュベートします。

2.細菌の培養と接種

1. 接種用の細菌懸濁液を準備します。
   1. Bacillus velezensisの場合、細菌細胞を滅菌LB培地に接種し、OD₆₀₀が0.8〜1.2になるまで170rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
   2. 6000 x g で2分間遠心分離して細菌細胞を回収し、PBSバッファー(2 mM KH₂PO₄、8 mM Na₂HPO₄、136 mM NaCl、2.6 mM KCl)に再懸濁します。遠心分離と再懸濁のステップを3回繰り返して、LB培地と細菌代謝物を除去します。
   3. 細菌細胞を新鮮な1/2 MS培地に最終濃度OD₆₀₀ 0.01で懸濁します。 A. thaliana の苗を育てる6ウェルプレートにバクテリア懸濁液を接種し、6ウェルプレートをライトインキュベーターに入れ、2日間培養します。

3. 根に定着した細菌の測定

1. 根組織を採取し、コロニーを形成した細胞をプレートします。
   注:すべてのステップは、ノトバイオティクス条件下で実行する必要があります
   1. 2 mLチューブの重量を量り、重量をW₀として記録します。
   2. 共培養した A.thaliana 根組織を収穫し、滅菌水で3回洗浄します。根を濾紙の上に置き、余分な水分を取り除きます。
   3. 計量した微量遠心チューブに根を入れ、チューブと一緒に根を計量し、_W1として記録します。
   4. 各チューブに1mLのPBSを加え、チューブを最大速度で8分間ボルテックスします。
   5. 回収した根コロニー形成細菌細胞で懸濁液を1 x ^10-1-1 x ^10-4に希釈します(細菌のコロニー形成能力に応じて)。希釈した細菌懸濁液をLB寒天培地を含むプレートに広げ、37°Cで10時間インキュベートします。
2. コロニーをカウントし、データを正規化します。
   1. LBプレート上の細菌コロニーを数えます。
   2. 対応する希釈率に従ってCFUを計算し、ルートフレッシュ重量(W_{1-W 0})でデータを正規化します。最終結果は、接種後2日目の根のグラム当たりのコロニー形成された細菌細胞の数を示しています(図1B)。

Representative Results

この方法で検出される細菌の定着能の精度を調べるために、Bacillus velezensis SQR9 WTと誘導型変異体Δ8mcpを別々にA. thaliana根圏に接種した。Δ8mcpは、化学受容器をコードする遺伝子をすべて欠いた変異体であり、コロニー形成が著しく減少しています⁶。我々は、本根コロニー形成アッセイにより、接種後2日目のコロニー形成を測定した。その結果、根のコロニー形成がΔ8mcpの有意な減少を示し、この条件と方法が細菌のコロニー形成を効果的に測定することを示しています(図1C)。

図1: A. thaliana の成長と Bacillus velezensis SQR9および Δ8mcpの根のコロニー形成。 (A)水耕栽培状態の細胞染色剤を使用して6ウェルプレートで成長する生後7日齢の A.thalianaの上面図。(B)生後7日齢の A.thalianaの側面図は、各ウェルに3本の苗を含む6ウェルプレートで成長しています。(C)B . velezensis 野生型SQR9および Δ8mcp のコロニー形成は、提示されたアッセイを使用して測定されました。6回の繰り返しが含まれ、データはSEM±平均として示 されています。

Discussion

良好な再現性を達成するために、このプロトコルのコロニー形成検出プロセスには4つの重要なステップがあります。まず、各実験で接種した細菌細胞の数がまったく同じになるようにする必要があります。第二に、コロニー化されていない細菌の洗浄強度を滅菌水で制御することも必要です。第三に、マイクロ遠心チューブに沈みやすいバクテリアの特性による吸収誤差を避けるために、サンプルを完全に混合状態にするために、すべてのサンプル希釈プロセスを実行する前にボルテックスする必要があります。したがって、各吸収の前に、ボルテックス機器を使用して細菌懸濁液を混合することをお勧めします。第四に、汚染の可能性を回避するために、この方法を使用するすべての操作中に無菌を厳密に保証する必要があります。

この方法は、根の表面にコロニーを形成した細菌を測定するために使用されます。根表面細菌を除いて、内生細菌、および真菌も植物の根圏にコロニーを形成します⁷。エンドファイティック細菌のコロニー形成能力は、この論文に記載されているプロトコルを使用して検出できますが、エンドファイティックバクテリアを放出するには、根組織を粉砕する必要があります。ただし、内生菌は細菌とは異なります。主流の方法のほとんどは、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して菌糸の成長を観察しますが、これは可視化のための蛍光標識細菌と同様の定性的な検出方法です⁸。

異なる株のコロニー形成を比較する場合、細菌の揮発性化合物⁹と植物の揮発性化合物^10,11の影響を避けるために、1つの6ウェルプレートに接種すべきではない。根の検出には接種後2日を選択したが、これはSQR9のコロニー形成が2日から4日の間に最大に達したからである。細菌のコロニー形成を検出する時間は、菌株に応じて調整できます。

他の記載された方法と比較して、この方法は正確で操作が簡単です。例えば、Noamらによって記載された方法は、固体成長シロイヌナズナを水耕栽培状態に移植すると直ちに細菌を接種する^12、13を有する。ここでは、植物が生育環境の変化に適応する影響を避けるために、移植後数日後に根圏に接種することを提案する。この研究で説明した方法は、植物が根の滲出液を放出するのにも適しており、コロニー形成に影響を与えます。

植物の新芽を空気中で別々に成長させ、液体の浸漬から完全に遠ざけるために、細胞染色剤にいくつかの小さな変更と処理を加えて、この水耕栽培法で利用できるようにしました。さらに、この方法は、少量の正確な細菌コロニー形成測定にはより適していますが、水耕栽培で収集された大量の根滲出液には適していません¹⁴。この方法は、以前に発表された研究12,14,15に基づいて変更されていることに注意することが重要です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E