Summary
뿌리권에서 식물 성장 촉진 rhizobacteria (PGPR)의 식민지화는 성장 촉진 효과에 필수적입니다. 세균성 rhizosphere colonization의 검출 방법을 표준화 할 필요가 있습니다. 여기에서는 뿌리 표면의 박테리아 집락을 정량화하기 위한 재현 가능한 방법을 설명합니다.
Abstract
애기장대(Arabidopsis thaliana) 뿌리에 대한 박테리아 집락을 측정하는 것은 식물-미생물 상호 작용 연구에서 가장 빈번한 실험 중 하나입니다. rhizosphere에서 박테리아 집락을 측정하기 위한 표준화된 방법은 재현성을 향상시키기 위해 필요합니다. 우리는 먼저 수경 재배 조건에서 멸균 A.thaliana를 배양 한 다음 뿌리 구의 박테리아 세포를0.01의 OD 600의 최종 농도로 접종했습니다. 접종 2일 후에, 뿌리 조직을 채취하고 멸균수로 3회 세척하여 집락화되지 않은 세균 세포를 제거하였다. 그런 다음 뿌리의 무게를 측정하고 뿌리에 서식하는 박테리아 세포를 소용돌이로 수집했습니다. 세포 현탁액을 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액으로 그래디언트로 희석한 후 Luria-Bertani(LB) 한천 배지에 도금했습니다. 플레이트를 37°C에서 10시간 동안 배양한 후, LB 플레이트의 단일 콜로니를 계수하고 정규화하여 뿌리에 콜로니화된 박테리아 세포를 나타냈습니다. 이 방법은 단일-상호 작용 조건에서 rhizosphere의 박테리아 집락을 감지하는 데 사용되며 재현성이 우수합니다.
Introduction
단일 박테리아 균주에 의한 rhizosphere colonization을 감지하기 위한 정량적 및 정성적 방법이 있습니다. 정성적 방법의 경우 형광을 구성적으로 표현하는 균주를 사용해야 하며 형광 분포 및 강도는 형광 현미경 또는 레이저 공초점 기기 1,2에서 검사해야 합니다. 이러한 전략은 현장 박테리아 집락화(bacterial colonization in situ3)를 잘 반영할 수 있지만, 정량화에서 기존의 플레이트 계수 방법만큼 정확하지는 않습니다. 게다가, 현미경으로 부분적인 뿌리 영역만 표시하는 제한으로 인해 때때로 주관적인 편향의 영향을 받을 수 있습니다.
여기에서는 집락화된 박테리아 세포를 수집하고 플레이트의 박테리아 CFU를 계수하는 것을 포함하는 정량적 방법을 설명합니다. 이 방법은 식물 뿌리에서 제거 된 집락화 된 균주를 계산할 수있는 희석 및 도금을 기반으로하며 뿌리의 총 집락화 된 박테리아 수를 계산할 수 있습니다 4,5.
먼저, A. thaliana 를 수경 재배 조건에서 배양 한 다음 박테리아 세포를 0.01 OD600의 최종 농도로 rhizosphere에 접종했습니다. 감염된 뿌리 조직을 접종 2일 후에 채취하고 멸균수로 세척하여 집락화되지 않은 박테리아 세포를 제거했습니다. 또한, 뿌리에 집락화된 박테리아 세포를 수집하여 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 희석하고, Luria-Bertani(LB) 한천 배지에 도약했습니다. 37°C에서 10시간 동안 배양한 후, LB 플레이트의 단일 콜로니를 계수하고 정규화하여 뿌리에 콜로니화된 박테리아 세포를 결정했습니다.
이 방법은 적용 가능성이 높고 반복성이 우수하며 정확한 rhizosphere 박테리아 집락화 측정에 더 적합합니다.
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Protocol
1. 멸균 수경 A. thaliana 재배
- A. thaliana 묘목을 준비합니다.
- 1/2 MS 배지(Murashige 및 Skoog)와 2%(wt/vol) 자당 및 0.9%(wt/vol) 한천으로 구성된 배양 A. thaliana 묘목 배지를 준비합니다.
- 응고하기 전에 준비된 멸균 매체를 멸균 사각형 페트리 접시(13cm x 13cm)에 붓습니다. 습도를 유지하기 위해 공기 건조를 피하십시오.
- A. thaliana 씨앗을 4°C에서 1mL의 멸균수로 채워진 2mL 미세 원심분리기 튜브에 12시간 이상 담근 다음 씨앗을 2%(vol/vol) NaClO 1mL로 2분 동안 멸균합니다.
- 멸균수로 씨앗을 6번 철저히 씻어 NaClO 용액을 제거합니다. 멸균 1mL 팁이 있는 MS 한천 배지를 사용하여 페트리 접시에 씨앗을 뿌립니다.
- 통기성 있는 의료용 테이프로 페트리 접시를 밀봉하고 가벼운 인큐베이터에 수직으로 넣어 1주일 동안 자랍니다. 광 인큐베이터 주야간 비율을 16시간/8시간으로 설정하고 온도를 23°C, 습도를 40%-60%로 유지합니다.
- 이식 A. thaliana.
- 40μm 공극 크기의 세포 염색기에 5mm 구멍을 뚫고 멸균합니다.
- 세포 여과기의 구멍을 통해 7일 된 A. thaliana 식물 3개를 이식하고 0.5% 자당이 있는 멸균 액체 1/2MS 배지 3mL가 들어 있는 6웰 플레이트에 넣습니다.
- 6웰 플레이트를 광 인큐베이터(그림 1A)에 놓고 10일 동안 배양합니다.
2. 세균 배양 및 접종
- 접종을 위해 세균 현탁액을 준비합니다.
- Bacillus velezensis의 경우 박테리아 세포를 멸균 LB 배지에 접종하고 37°C에서 170rpm에서 진탕하여 0.8-1.2의 OD600에 도달할 때까지 배양합니다.
- 6000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 수집하고 세포를 PBS 완충액(2mM KH,2PO4, 8mMNa2HPO4, 136mM NaCl, 2.6mM KCl)에 재현탁시킵니다. 원심분리 및 재현탁 단계를 3회 반복하여 LB 배지와 박테리아 대사 산물을 제거합니다.
- 박테리아 세포를 OD600 0.01의 최종 농도에서 새로운 1/2 MS 배지에 현탁시킵니다. A. thaliana 묘목을 자라는 6-well plate에 박테리아 현탁액을 접종하고 6-well plates를 light incubator에 넣고 2일 동안 배양합니다.
3. 뿌리에 서식하는 박테리아 측정
- 뿌리 조직을 수확하고 집락화된 세포를 도금합니다.
참고: 모든 단계는 gnotobiotic 조건에서 수행해야 합니다.- 2mL 튜브의 무게를 측정하고 무게를 W0으로 기록합니다.
- 공동 배양된 A. thaliana 뿌리 조직을 수확하고 멸균수로 3회 세척합니다. 여과지에 뿌리를 올려 여분의 물을 제거합니다.
- 무게를 잰 마이크로 원심분리기 튜브에 뿌리를 넣고 튜브와 함께 뿌리의 무게를 잰 다음 W1로 기록합니다.
- 각 튜브에 1mL의 PBS를 추가하고 최대 속도로 8분 동안 튜브를 소용돌이칩니다.
- 수집된 뿌리 집락화된 박테리아 세포로 현탁액을 1 x 10-1-1 x 10-4(박테리아 집락화 능력에 따라)로 희석합니다. LB 한천 배지가 포함된 플레이트에 희석된 박테리아 현탁액을 펴고 37°C에서 10시간 동안 배양합니다.
- 콜론의 개수를 세고 데이터를 정규화합니다.
- LB 플레이트의 박테리아 군집을 계산합니다.
- 해당 희석에 따라 CFU를 계산하고 루트 프레시 웨이트(W1-W 0)로 데이터를 정규화합니다. 최종 결과는 접종 후 2일 시점에 뿌리 그램당 집락화된 박테리아 세포의 수를 나타냅니다(그림 1B).
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Representative Results
A. thaliana rhizosphere에서 이 방법으로 검출된 박테리아 집락 형성 능력의 정확도를 테스트하기 위해 Bacillus velezensis SQR9 WT와 파생 돌연변이 Δ8mcp를 A. thaliana rhizosphere에 별도로 접종했습니다. Δ8mcp는 모든 화학수용체 인코딩 유전자가 결여된 돌연변이이며, 집락화가 현저히 감소했다6. 우리는 현재의 뿌리 집락화 분석으로 접종 후 2일에 그들의 집락을 측정했습니다. 그 결과 Δ8mcp의 뿌리 집락화가 현저히 감소한 것으로 나타났으며, 이는 이 조건과 방법이 박테리아 집락을 효과적으로 측정한다는 것을 나타냅니다(그림 1C).
그림 1: A. thaliana 의 성장과 Bacillus velezensis SQR9 및 Δ8mcp의 뿌리 집락화. (A) 생후 7일 된 A. thaliana가 수경 재배 상태의 세포 염색기가 있는 6웰 플레이트에서 자라는 모습. (B) 생후 7일 된 A. thaliana의 측면 모습은 6개의 우물 판에서 자라고 있으며, 각 우물에는 3개의 묘목이 있습니다. (C) 제시된 분석을 사용하여 측정한 B. velezensis 야생형 SQR9 및 Δ8mcp 의 집락화. 6번의 반복실험이 포함되었으며 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우수한 재현성을 달성하기 위해 이 프로토콜의 집락화 감지 프로세스를 위한 4가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 각 실험에서 접종된 박테리아 세포의 수가 정확히 동일한지 확인해야 합니다. 둘째, 멸균수로 집락화되지 않은 박테리아 세척 강도를 조절하는 것도 필요합니다. 셋째, 모든 시료 희석 공정은 미세 원심분리기 튜브에 가라앉기 쉬운 박테리아의 특성으로 인한 흡수 오류를 피하기 위해 시료가 완전한 혼합 상태가 되도록 수행하기 전에 소용돌이쳐야 합니다. 따라서 각 흡수 전에 와류 기기를 사용하여 박테리아 현탁액을 혼합하는 것이 좋습니다. 넷째, 오염 가능성을 피하기 위해 이 방법을 사용하는 모든 작업 중에 무균을 엄격하게 보장해야 합니다.
이 방법은 뿌리 표면에 서식하는 박테리아를 결정하는 데 사용됩니다. 뿌리 표면 박테리아를 제외하고, 내생 박테리아 및 곰팡이도 식물 뿌리권에 서식합니다7. 내생균의 집락화 능력은 이 논문에 설명된 프로토콜을 사용하여 여전히 감지할 수 있지만, 내생균을 방출하기 위해 뿌리 조직을 갈아야 합니다. 그러나 내생균은 박테리아와 다릅니다. 대부분의 주류 방법은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 균사의 성장을 관찰하는데, 이는 시각화를 위한 형광 라벨링 박테리아와 유사한 정성적 검출 방법입니다8.
상이한 균주의 집락화를 비교할 때, 박테리아 휘발성 화합물9 및 식물 휘발성 화합물10,11의 영향을 피하기 위해 하나의 6-웰 플레이트에 접종해서는 안 된다. 우리는 SQR9의 집락화가 2일에서 4일 사이에 최대에 도달했기 때문에 뿌리를 감지하기 위해 접종 후 2일을 선택했습니다. 세균 집락을 검출하는 시간은 균주에 따라 조정할 수 있습니다.
설명된 다른 방법과 비교할 때 이 방법은 정확하고 작동하기 쉽습니다. 예를 들어, Noam et al.에 의해 기술된 방법은 고형으로 자란 애기장대를 수경재배 조건12,13에 이식할 때 즉시 박테리아로 접종됩니다. 여기에서, 우리는 변화된 성장 환경에 대한 식물 적응의 영향을 피하기 위해 이식 후 몇 일 후에 박테리아를 뿌리권에 접종해야 한다고 제안합니다. 이 연구에서 설명한 방법은 식물이 식민지화에 영향을 미치는 뿌리 삼출액을 방출하는 데에도 좋습니다.
식물 싹이 공기 중에서 따로 자랄 수 있고 액체 침지에서 완전히 멀리 떨어질 수 있도록 하기 위해 우리는 이 수경 재배 방법에 사용할 수 있도록 세포 염색기에서 몇 가지 사소한 수정과 처리를 했습니다. 더욱이, 이 방법은 소량의 정확한 세균 집락화 측정에 더 적합하지만, 수경배양14에서 수집된 대량의 뿌리 삼출물에는 적합하지 않다. 이 방법은 이전에 발표된 연구 12,14,15를 기반으로 수정되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
저자는 이 기사의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(32370135), 중국 농업 과학원 혁신 프로그램(CAAS-CSAL-202302), 장쑤 농업 임업 직업 대학의 과학 기술 프로젝트(2021kj29)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
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