Summary
Kolonisering av plantevekstfremmende rhizobakterier (PGPR) i rhizosfæren er avgjørende for den vekstfremmende effekten. Det er nødvendig å standardisere metoden for deteksjon av bakteriell rhizosfæren kolonisering. Her beskriver vi en reproduserbar metode for å kvantifisere bakteriekolonisering på rotoverflaten.
Abstract
Måling av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana rot er et av de hyppigste forsøkene i plantemikrobe interaksjonsstudier. En standardisert metode for måling av bakteriell kolonisering i rhizosfæren er nødvendig for å forbedre reproduserbarheten. Vi dyrket først steril A.thaliana i hydroponiske forhold og inokulerte deretter bakteriecellene i rhizosfæren ved en endelig konsentrasjon på OD600 på 0,01. På 2 dager etter inokulering ble rotvevet høstet og vasket tre ganger i sterilt vann for å fjerne de ukoloniserte bakteriecellene. Røttene ble deretter veid, og bakteriecellene kolonisert på roten ble samlet inn av virvel. Cellesuspensjonen ble fortynnet i en gradient med en fosfatbufret saltvannsbuffer (PBS), etterfulgt av plettering på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 10 timer, og deretter ble de enkelte koloniene på LB-plater talt og normalisert for å indikere bakteriecellene kolonisert på røtter. Denne metoden brukes til å oppdage bakteriell kolonisering i rhizosfæren i mono-interaksjonsbetingelser, med god reproduserbarhet.
Introduction
Det finnes kvantitative og kvalitative metoder for å oppdage rhizosfærekolonisering av en enkelt bakteriestamme. For den kvalitative metoden bør en stamme som konstitutivt uttrykker fluorescens brukes, og fluorescensfordelingen og intensiteten bør undersøkes under fluorescensmikroskopi eller laserkonfokalinstrumenter 1,2. Disse strategiene kan godt reflektere bakteriell kolonisering in situ3, men de er ikke like nøyaktige som tradisjonelle platetellingsmetoder i kvantifisering. Dessuten, på grunn av begrensningen av bare å vise delvise rotsoner under mikroskopet, kan det noen ganger påvirkes av subjektiv skjevhet.
Her beskriver vi en kvantitativ metode, som inkluderer å samle de koloniserte bakteriecellene og telle bakterielle CFUer på en tallerken. Denne metoden er basert på fortynning og plating der de koloniserte stammene som ble fjernet fra planterøtter kan telles, og det totale koloniserte bakterietallet på roten kan beregnes 4,5.
Først ble A. thaliana dyrket under hydroponiske forhold, og deretter ble bakterieceller inokulert i rhizosfæren ved en endelig konsentrasjon på 0, 01 OD600. Det infiserte rotvevet ble høstet 2 dager etter inokulering og vasket i sterilt vann for å fjerne de ukoloniserte bakteriecellene. Videre ble bakterieceller kolonisert på roten samlet, fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) buffer og belagt på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Etter inkubering ved 37 °C i 10 timer ble enkeltkolonier på LB-plater talt og normalisert for å bestemme bakteriecellene kolonisert på røttene.
Denne metoden er svært anvendelig, har god repeterbarhet, og er mer egnet for nøyaktig bestemmelse av bakteriell kolonisering av rhizosfæren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steril hydroponisk A. thaliana dyrking
- Forbered A. thaliana frøplanter.
- Forbered kultur A. thaliana frøplanter medium, som består av 1/2 MS medium (Murashige og Skoog) med 2% (wt / vol) sukrose og 0,9% (wt / vol) agar.
- Hell det tilberedte steriliseringsmediet i sterile firkantede petriskåler (13 cm x 13 cm) før størkning. Unngå lufttørking for å opprettholde fuktighet.
- Dypp A. thalianafrø i et 2 ml mikrosentrifugerør fylt med 1 ml sterilt vann ved 4 °C i over 12 timer, og steriliser deretter frøene med 1 ml 2% (vol/vol) NaClO i 2 minutter.
- Vask frøene grundig med sterilt vann seks ganger for å fjerne NaClO-løsningen. Så frøene på petriskåler med MS-agarmedium med en steril spiss på 1 ml.
- Forsegl petriskålene med pustende medisinsk tape og legg dem vertikalt i en lett inkubator for å vokse i 1 uke. Sett lysinkubatoren dag / natt forhold til 16 h / 8 timer, hold temperaturen på 23 ° C og fuktighet på 40% -60%.
- Transplantasjon A. thaliana.
- Skjær 5 mm hull på 40 μm celleflekker i porestørrelse og steril dem.
- Transplanter tre 7 dager gamle A. thaliana-planter gjennom hullene i en cellesil og legg dem i en 6-brønnsplate som inneholder 3 ml steril væske 1/2 MS-medium med 0,5% sukrose.
- Plasser 6-brønnplatene i en lysinkubator (figur 1A) og inkuber i 10 dager.
2. Bakteriedyrking og inokulering
- Forbered bakteriell suspensjon for inokulering.
- For Bacillus velezensis, inokuler bakterieceller i sterilt LB-medium og inkuber ved 37 ° C med risting ved 170 o / min til den når OD600 på 0,8-1,2.
- Samle bakteriecellene ved sentrifugering ved 6000 x g i 2 minutter og resuspender cellene i PBS-buffer (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Gjenta sentrifuge- og resuspenderingstrinnene 3 ganger for å fjerne LB-mediet og bakteriemetabolittene.
- Suspender bakteriecellene i et friskt 1/2 MS-medium ved en endelig konsentrasjon på OD600 0,01. Inokulere bakteriesuspensjonene til 6-brønnplatene som vokser A. thaliana-frøplanter , plasser 6-brønnplatene i lysinkubatoren og dyrk dem i 2 dager.
3. Måling av bakterier kolonisert på røtter
- Høst rotvevet og plate de koloniserte cellene.
MERK: Alle trinn skal utføres under gnotobiotisk tilstand- Vei 2 ml rørene og registrer vekten som W0.
- Høst det samdyrkede A. thaliana rotvevet og vask dem i sterilt vann 3 ganger. Legg roten på filterpapir for å fjerne overflødig vann.
- Sett roten inn i det veide mikrosentrifugerøret, vei røttene sammen med røret, og registrer det som W1.
- Tilsett 1 ml PBS til hvert rør og virv rørene i 8 minutter ved maksimal hastighet.
- Fortynn suspensjonene med de oppsamlede rotkoloniserte bakteriecellene til 1 x 10-1-1 x 10-4 (i henhold til bakteriekoloniseringsevnen). Fordel de fortynnede bakteriesuspensjonene på plater som inneholder LB-agarmedium og inkuber ved 37 °C i 10 timer.
- Telle koloniene og normaliser dataene.
- Tell bakteriekoloniene på LB-plater.
- Beregn CFUene i henhold til tilsvarende fortynning og normaliser dataene med rotens ferskvekt (W1-W 0). De endelige resultatene indikerer antall bakterieceller kolonisert per gram rot 2 dager etter inokulering (figur 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å teste nøyaktigheten av bakteriekoloniseringsevnen oppdaget ved denne metoden i A. thaliana-rhizosfæren, inokulerte vi Bacillus velezensis SQR9 WT og en avledet mutant Δ8mcp i A. thaliana rhizosphere separat. Δ8mcp er en mutant som mangler alle kjemoreceptorkodende gener, og den har en betydelig redusert kolonisering6. Vi målte deres kolonisering ved 2 dager etter inokulering ved den nåværende rotkoloniseringsanalysen. Resultatene viste en signifikant rotkoloniseringsreduksjon av Δ8mcp, noe som indikerer at denne tilstanden og metoden effektivt måler bakteriekoloniseringen (figur 1C).
Figur 1: Voksende A. thaliana og rotkolonisering av Bacillus velezensis SQR9 og Δ8mcp. (A) Det øverste bildet av 7 dager gamle A. thaliana som vokser i 6-brønnsplater med cellefarer i hydroponisk tilstand. (B) Sidevisningen av 7 dager gamle A. thaliana som vokser i 6-brønnsplater, hver brønn inneholder 3 frøplanter. (C) Kolonisering av B. velezensis villtype SQR9 og Δ8mcp målt ved hjelp av presentert analyse. Seks replikater ble inkludert, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å oppnå god reproduserbarhet er det fire kritiske trinn for koloniseringsdeteksjonsprosessen til denne protokollen. For det første er det nødvendig å sikre at antall inokulerte bakterieceller er nøyaktig det samme i hvert eksperiment. For det andre er det også nødvendig å kontrollere den ukoloniserte bakterierengjøringsintensiteten med sterilt vann. For det tredje må hver prøvefortynningsprosess virves før den utføres for å la prøven være i fullstendig blandingstilstand for å unngå absorpsjonsfeil på grunn av egenskapene til bakterier som er enkle å synke i mikrosentrifugerøret. Derfor anbefaler vi å bruke et virvelinstrument for å blande bakteriesuspensjonen før hver absorpsjon. For det fjerde bør asepsis sikres strengt under alle operasjoner ved bruk av denne metoden for å unngå mulighet for forurensning.
Denne metoden brukes til å bestemme bakteriene kolonisert på rotoverflaten. Bortsett fra rotoverflatebakterier, endofytiske bakterier og sopp koloniserer også planten rhizosfæren7. Koloniseringsevnen til endofytiske bakterier kan fortsatt oppdages ved å bruke protokollen beskrevet i dette papiret, men rotvevet skal males for å frigjøre endofytiske bakterier. Imidlertid er endofytiske sopp forskjellig fra bakterier. De fleste av de vanlige metodene bruker transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for å observere veksten av hyfer, som er en kvalitativ deteksjonsmetode som ligner fluorescerende merkingsbakterier for visualisering8.
Når man sammenligner koloniseringen av forskjellige stammer, bør de ikke inokuleres i en 6-brønnplate for å unngå påvirkning av bakterielle flyktige forbindelser9 og planteflyktige forbindelser10,11. Vi valgte 2-dagers etterinokulering for å oppdage rot fordi koloniseringen av SQR9 nådde maksimum mellom 2 og 4 dager; Tiden for å oppdage bakteriekoloniseringen kan justeres i henhold til stammene.
Sammenlignet med andre beskrevne metoder er denne metoden nøyaktig og enkel å betjene. For eksempel har metoden beskrevet av Noam et al. den solidvoksne arabidopsis inokulert med bakterier umiddelbart når den transplanteres til hydroponisk tilstand12,13. Her foreslår vi at bakteriene skal inokuleres til rhizosfæren etter flere dager med transplantasjon for å unngå påvirkning av plantetilpasning til det endrede vekstmiljøet. Metoden beskrevet i denne studien er også god for planter å frigjøre rotekssudat, noe som påvirker kolonisering.
For å la planteskuddene vokse separat i luften og helt vekk fra væskenedsenkingen, gjorde vi noen mindre modifikasjoner og behandling på cellefargleren for å gjøre dem tilgjengelige for denne hydroponiske metoden. Videre er denne metoden mer egnet for nøyaktig bakteriell koloniseringsbestemmelse i små mengder, men ikke for store mengder rotekssudater samlet i hydrokultur14. Det er viktig å merke seg at denne metoden er modifisert basert på tidligere publiserte studier 12,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (32370135), innovasjonsprogrammet til Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-CSAL-202302), Science and Technology Project of Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
