Summary
Колонизация ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR) в ризосфере, имеет важное значение для ее стимулирующего рост эффекта. Необходимо стандартизировать метод выявления бактериальной ризосферной колонизации. Здесь мы описываем воспроизводимый метод количественной оценки бактериальной колонизации на поверхности корня.
Abstract
Измерение бактериальной колонизации корня Arabidopsis thaliana является одним из наиболее частых экспериментов в исследованиях взаимодействия растений и микробов. Стандартизированный метод измерения бактериальной колонизации в ризосфере необходим для улучшения воспроизводимости. Сначала мы культивировали стерильную A.thaliana в гидропонных условиях, а затем инокулировали бактериальные клетки в ризосфере при конечной концентрации OD600 0,01. Через 2 дня после инокуляции ткань корня собирали и трижды промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Затем корни взвешивали, и бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали вихрем. Клеточную суспензию разбавляли градиентом с фосфатно-солевым буфером (PBS) с последующим нанесением на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 10 часов, а затем подсчитывали и нормализовали единичные колонии на LB-планшетах, чтобы указать на бактериальные клетки, колонизированные на корнях. Этот метод используется для обнаружения бактериальной колонизации в ризосфере в условиях моновзаимодействия, с хорошей воспроизводимостью.
Introduction
Существуют количественные и качественные методы выявления колонизации ризосферы одним штаммом бактерий. Для качественного метода следует использовать штамм, который конститутивно экспрессирует флуоресценцию, а распределение и интенсивность флуоресценции следует исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии или лазерных конфокальных инструментов 1,2. Эти стратегии могут хорошо отражать бактериальную колонизацию in situ3, но они не так точны, как традиционные методы подсчета планшетов при количественной оценке. Кроме того, из-за ограничения отображения под микроскопом только частичных корневых зон, иногда на него может влиять субъективная систематическая ошибка.
Здесь мы опишем количественный метод, который включает в себя сбор колонизированных бактериальных клеток и подсчет бактериальных КОЕ на планшете. Этот метод основан на разбавлении и покрытии, с помощью которых можно подсчитать колонизированные штаммы, которые были удалены из корней растений, и можно вычислить общее количество колонизированных бактерий на корне 4,5.
Сначала A. thaliana культивировали в гидропонных условиях, а затем бактериальные клетки инокулировали в ризосферу в конечной концентрации 0,01 OD600. Инфицированные корневые ткани собирали через 2 дня после инокуляции и промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Далее бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали, разбавляли в буфере с фосфатно-солевым буфером (PBS) и помещали на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). После инкубации при 37 °С в течение 10 ч подсчитывали и нормализовали единичные колонии на ЛБ-планшетах для определения бактериальных клеток, колонизированных на корнях.
Этот метод очень применим, имеет хорошую повторяемость и больше подходит для точного определения ризосферной колонизации бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Стерильное гидропонное выращивание A. thaliana
- Подготовьте рассаду A. thaliana .
- Приготовьте проросток культуры A. thaliana в среде, которая состоит из 1/2 среды МС (Мурасиге и Скуг) с 2% (масс./об.) сахарозы и 0,9% (масс./об.) агара.
- Подготовленную стерилизационную среду вылить в стерильные квадратные чашки Петри (13 см х 13 см) до застывания. Избегайте сушки воздуха для поддержания влажности.
- Погрузите семена A. thaliana в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, заполненную 1 мл стерильной воды при температуре 4 °C, на более чем 12 ч, а затем стерилизуйте семена 1 мл 2% (об/об.) NaClO в течение 2 мин.
- Тщательно промойте семена стерильной водой шесть раз, чтобы удалить раствор NaClO. Высевают семена на чашки Петри средой МС агар со стерильным кончиком 1 мл.
- Заклейте чашки Петри дышащим медицинским скотчем и поместите их вертикально в легкий инкубатор для выращивания в течение 1 недели. Установите соотношение светового дня и ночи в инкубаторе на 16 ч/8 ч, поддерживайте температуру 23 °C и влажность 40%-60%.
- Пересадка A. thaliana.
- Вырежьте отверстия 5 мм на 40 μм для окрашивания клеток размером поры и стерилизуйте их.
- Пересадите три 7-дневных растения A. thaliana через отверстия клеточного ситечка и поместите их в 6-луночный планшет, содержащий 3 мл стерильной жидкой среды 1/2 MS с 0,5% сахарозой.
- Поместите 6-луночные планшеты в легкий инкубатор (рисунок 1A) и инкубируйте в течение 10 дней.
2. Культивирование и инокуляция бактерий
- Приготовьте бактериальную суспензию для посева.
- Для Bacillus velezensis инокулируют бактериальные клетки в стерильную среду LB и инкубируют при 37 °C с встряхиванием при 170 об/мин до достижения наружного диаметра600 0,8-1,2.
- Соберите бактериальные клетки центрифугированием при 6000 x g в течение 2 мин и ресуспендируйте клетки в PBS-буфере (2 мМ KH2PO4, 8 мМ Na2HPO4, 136 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl). Повторите этапы центрифугирования и ресуспендирования 3 раза, чтобы удалить среду LB и бактериальные метаболиты.
- Суспендировать клетки бактерий в свежей среде с 1/2 МС при конечной концентрации наружного диаметра600 0,01. Инокулируйте бактериальные суспензии в 6-луночные планшеты, на которых растут саженцы A. thaliana , поместите 6-луночные планшеты в легкий инкубатор и культивируйте их в течение 2 дней.
3. Измерение бактерий, колонизированных на корнях
- Соберите корневую ткань и наложите колонизированные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны проводиться в условиях гнотобиотиков- Взвесьте 2 мл пробирок и запишите вес как W0.
- Соберите ткани корня A. thaliana и промойте их в стерильной воде 3 раза. Поместите корень на фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишнюю воду.
- Поместите корень в взвешенную микроцентрифужную пробирку, взвесьте корни вместе с пробиркой и запишите как W1.
- Добавьте 1 мл PBS в каждую пробирку и закрутите пробирки в течение 8 мин на максимальной скорости.
- Разбавляют суспензии собранными колонизированными корнями бактериальными клетками до 1 х 10-1-1 х 10-4 (в зависимости от способности бактерий к колонизации). Разбавленные бактериальные суспензии распределить по планшетам, содержащим среду LB-агара, и инкубировать при 37 °С в течение 10 ч.
- Подсчитайте колонии и нормализуйте данные.
- Подсчитайте колонии бактерий на LB-планшетах.
- Рассчитайте КОЕ в соответствии с соответствующим разбавлением и нормализуйте данные по сырой массе корня (W1-W 0). Окончательные результаты показывают количество колонизированных бактериальных клеток на грамм корня через 2 дня после инокуляции (рис. 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проверить точность способности бактерий к колонизации, обнаруженной этим методом в ризосфере A. thaliana, мы инокулировали Bacillus velezensis SQR9 WT и полученный мутантный Δ8mcp в ризосферу A. thaliana отдельно. Δ8mcp является мутантом, в котором отсутствуют все гены, кодирующие хеморецепторы, и у него значительно снижена колонизация6. Мы измерили их колонизацию через 2 дня после инокуляции с помощью настоящего анализа колонизации корня. Результаты показали значительное снижение колонизации корней Δ8mcp, что указывает на то, что это условие и метод эффективно измеряют колонизацию бактерий (рис. 1C).
Рисунок 1: Выращивание A. thaliana и колонизация корней Bacillus velezensis SQR9 и Δ8mcp. (A) Вид сверху на 7-дневную A. thaliana, растущую в 6-луночных планшетах с клеточным красителем в гидропонном состоянии. (B) Вид сбоку на 7-дневную A. thaliana, растущую в 6-луночных планшетах, каждая лунка содержит 3 сеянца. (C) Колонизация B. velezensis дикого типа SQR9 и Δ8mcp , измеренная с помощью представленного анализа. Было включено шесть повторений, и данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для достижения хорошей воспроизводимости существует четыре критических шага для процесса обнаружения колонизации этого протокола. Во-первых, необходимо убедиться, что количество инокулированных клеток бактерий в каждом эксперименте одинаково. Во-вторых, также необходим контроль интенсивности очистки неколонизированных бактерий стерильной водой. В-третьих, каждый процесс разбавления пробы должен быть подвергнут вихревому воздействию перед выполнением, чтобы образец находился в состоянии полного смешивания, чтобы избежать ошибок абсорбции из-за характеристик бактерий, которые легко погружаются в микроцентрифужную пробирку. Поэтому мы рекомендуем использовать вихревой инструмент для перемешивания бактериальной суспензии перед каждой абсорбцией. В-четвертых, асептика должна быть строго обеспечена во время всех операций с использованием этого метода, чтобы избежать любой возможности заражения.
Этот метод используется для определения бактерий, колонизированных на поверхности корня. Помимо поверхностных бактерий корня, эндофитные бактерии и грибы также колонизируют ризосферу растений7. Колонизационная способность эндофитных бактерий все еще может быть обнаружена с помощью протокола, описанного в этой статье, но ткань корня должна быть измельчена для высвобождения эндофитных бактерий. Однако эндофитные грибы отличаются от бактерий. Большинство основных методов используют просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) для наблюдения за ростом гиф, что является качественным методом обнаружения, аналогичным флуоресцентному мечению бактерий для визуализации8.
При сравнении колонизации различных штаммов их не следует инокулировать в один 6-луночный планшет, чтобы избежать влияния бактериальных летучих соединений9 и растительных летучих соединений10,11. Мы выбрали 2-дневную постинокуляцию для обнаружения корня, потому что колонизация SQR9 достигла максимума между 2 и 4 днями; Время обнаружения бактериальной колонизации может быть скорректировано в соответствии со штаммами.
По сравнению с другими описанными методами, этот метод является точным и простым в эксплуатации. Например, способ, описанный Noam et al., заключается в том, что твердо выращенный арабидопсис инокулируется бактериями сразу после пересадки в гидропонное состояние12,13. Здесь мы предлагаем, чтобы бактерии были инокулированы в ризосферу после нескольких дней пересадки, чтобы избежать влияния адаптации растений к изменившейся среде роста. Метод, описанный в этом исследовании, также хорош для растений, чтобы выделять корневой экссудат, который влияет на колонизацию.
Чтобы побеги растений росли отдельно на воздухе и полностью вдали от погружения в жидкость, мы внесли некоторые незначительные изменения и обработали клеточный краситель, чтобы сделать их доступными для этого гидропонного метода. Кроме того, этот метод больше подходит для точного определения бактериальной колонизации в небольших количествах, но не для больших количеств корневых экссудатов, собранных в гидрокультуре14. Важно отметить, что этот метод модифицирован на основе ранее опубликованных исследований 12,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (32370135), Инновационной программой Китайской академии сельскохозяйственных наук (CAAS-CSAL-202302), Научно-техническим проектом Цзянсуского профессионального колледжа сельского и лесного хозяйства (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
