Summary
Die Besiedlung mit pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) in der Rhizosphäre ist essentiell für ihre wachstumsfördernde Wirkung. Es ist notwendig, die Methode zum Nachweis der bakteriellen Rhizosphärenbesiedlung zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Wurzeloberfläche.
Abstract
Die Messung der bakteriellen Besiedlung der Arabidopsis thaliana-Wurzel ist eines der häufigsten Experimente in Studien zur Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, ist eine standardisierte Methode zur Messung der bakteriellen Besiedlung in der Rhizosphäre notwendig. Wir kultivierten zunächst steriles A.thaliana unter hydroponischen Bedingungen und inokulierten dann die Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von OD600 von 0,01. 2 Tage nach der Inokulation wurde das Wurzelgewebe entnommen und dreimal in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Anschließend wurden die Wurzeln gewogen und die an der Wurzel besiedelten Bakterienzellen durch einen Wirbel gesammelt. Die Zellsuspension wurde in einem Gradienten mit einem phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und anschließend auf ein Luria-Bertani (LB)-Agarmedium aufgebracht. Die Platten wurden 10 h lang bei 37 °C inkubiert, und dann wurden die einzelnen Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die Bakterienzellen anzuzeigen, die auf den Wurzeln besiedelt waren. Diese Methode wird verwendet, um bakterielle Besiedlung in der Rhizosphäre unter Monointeraktionsbedingungen mit guter Reproduzierbarkeit nachzuweisen.
Introduction
Es gibt quantitative und qualitative Methoden, um die Rhizosphärenbesiedlung durch einen einzelnen Bakterienstamm nachzuweisen. Für die qualitative Methode sollte ein Stamm verwendet werden, der konstitutiv Fluoreszenz exprimiert, und die Fluoreszenzverteilung und -intensität sollte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokalen Laserinstrumenten untersucht werden 1,2. Diese Strategien können die bakterielle Besiedlung in situ3 gut widerspiegeln, aber sie sind bei der Quantifizierung nicht so genau wie herkömmliche Plattenzählmethoden. Aufgrund der Einschränkung, nur partielle Wurzelzonen unter dem Mikroskop anzuzeigen, kann dies manchmal durch subjektive Verzerrungen beeinflusst werden.
Hier beschreiben wir eine quantitative Methode, die das Sammeln der besiedelten Bakterienzellen und das Zählen der bakteriellen KBE auf einer Platte beinhaltet. Dieses Verfahren basiert auf einer Verdünnung und Plattierung, bei der die besiedelten Stämme, die von den Pflanzenwurzeln abgestreift wurden, gezählt und die Gesamtzahl der besiedelten Bakterien auf der Wurzel berechnet werdenkann 4,5.
Zuerst wurde A. thaliana unter hydroponischen Bedingungen kultiviert, und dann wurden Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von 0,01 OD600 inokuliert. Das infizierte Wurzelgewebe wurde 2 Tage nach der Inokulation entnommen und in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Des Weiteren wurden Bakterienzellen, die an der Wurzel besiedelt waren, gesammelt, in phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und auf ein Luria-Bertani (LB) Agarmedium aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 10 h wurden einzelne Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die auf den Wurzeln besiedelten Bakterienzellen zu bestimmen.
Diese Methode ist sehr gut anwendbar, hat eine gute Wiederholbarkeit und eignet sich besser für die genaue Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Rhizosphäre.
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Protocol
1. Steriler hydroponischer Anbau von A. thaliana
- Bereiten Sie A . thaliana-Sämlinge vor.
- Bereiten Sie Kulturmedium für A. thaliana vor, das aus 1/2 MS-Medium (Murashige und Skoog) mit 2 % (wt/vol) Saccharose und 0,9 % (wt/vol) Agar besteht.
- Gießen Sie das vorbereitete Sterilisationsmedium vor dem Erstarren in sterile quadratische Petrischalen (13 cm x 13 cm). Vermeiden Sie das Austrocknen an der Luft, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
- Tauchen Sie die Samen von A. thaliana für mehr als 12 Stunden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 1 mL sterilem Wasser bei 4 °C gefüllt ist, und sterilisieren Sie die Samen dann 2 Minuten lang mit 1 mL 2 % (vol/vol) NaClO.
- Waschen Sie die Samen sechsmal gründlich mit sterilem Wasser, um die NaClO-Lösung zu entfernen. Säen Sie die Samen auf Petrischalen mit MS-Agar-Medium mit einer sterilen 1-ml-Spitze.
- Verschließen Sie die Petrischalen mit atmungsaktivem medizinischem Klebeband und legen Sie sie vertikal in einen leichten Inkubator, um sie 1 Woche lang zu züchten. Stellen Sie das Tag-/Nachtverhältnis des Lichtinkubators auf 16 h/8 h ein, halten Sie die Temperatur auf 23 °C und die Luftfeuchtigkeit auf 40%-60%.
- Transplantation von A. thaliana.
- Schneiden Sie 5 mm Löcher in einen 40 μm porengroßen Zellfärber und sterilisieren Sie sie.
- Transplantieren Sie drei 7 Tage alte A. thaliana-Pflanzen durch die Löcher eines Zellsiebs und geben Sie sie in eine 6-Well-Platte mit 3 ml sterilem flüssigem 1/2 MS-Medium mit 0,5 % Saccharose.
- Legen Sie die 6-Well-Platten in einen Lichtinkubator (Abbildung 1A) und inkubieren Sie sie 10 Tage lang.
2. Bakterienkultivierung und Inokulation
- Bereiten Sie die Bakteriensuspension für die Inokulation vor.
- Bei Bacillus velezensis werden die Bakterienzellen in steriles LB-Medium inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inkubiert, bis es einen OD600 von 0,8-1,2 erreicht.
- Sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 6000 x g für 2 min und resuspendieren Sie die Zellen in PBS-Puffer (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Resuspendierungsschritte 3 Mal, um das LB-Medium und die bakteriellen Metaboliten zu entfernen.
- Die Bakterienzellen werden in einem frischen 1/2 MS-Medium bei einer Endkonzentration von OD600 0,01 suspendiert. Impfen Sie die Bakteriensuspensionen auf die 6-Well-Platten, auf denen A . thaliana-Sämlinge wachsen, legen Sie die 6-Well-Platten in den Lichtinkubator und kultivieren Sie sie 2 Tage lang.
3. Messung von Bakterien, die sich auf Wurzeln ansiedeln
- Ernten Sie das Wurzelgewebe und plattieren Sie die besiedelten Zellen.
HINWEIS: Alle Schritte sollten unter gnotobiotischen Bedingungen durchgeführt werden- Wiegen Sie die 2 mL Röhrchen und notieren Sie das Gewicht mit W0.
- Ernten Sie die co-kultivierten A. thaliana-Wurzelgewebe und waschen Sie sie 3 Mal in sterilem Wasser. Legen Sie die Wurzel auf Filterpapier, um das überschüssige Wasser zu entfernen.
- Geben Sie die Wurzel in das gewogene Mikrozentrifugenröhrchen, wiegen Sie die Wurzeln zusammen mit dem Röhrchen und notieren Sie es als W1.
- Geben Sie 1 mL PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen 8 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit durch.
- Verdünnen Sie die Suspensionen mit den gesammelten wurzelbesiedelten Bakterienzellen auf 1 x 10-1-1 x 10-4 (je nach Besiedlungsfähigkeit der Bakterien). Die verdünnten Bakteriensuspensionen auf Platten mit LB-Agarmedium verteilen und 10 h bei 37 °C inkubieren.
- Zählen Sie die Kolonien und normalisieren Sie die Daten.
- Zählen Sie die Bakterienkolonien auf LB-Platten.
- Berechnen Sie die KBE entsprechend der entsprechenden Verdünnung und normalisieren Sie die Daten mit dem Wurzelfrischgewicht (W1-W 0). Die Endergebnisse zeigen die Anzahl der besiedelten Bakterienzellen pro Gramm Wurzel 2 Tage nach der Inokulation (Abbildung 1B).
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Representative Results
Um die Genauigkeit der mit dieser Methode nachgewiesenen Besiedlungsfähigkeit der Bakterien in der Rhizosphäre von A. thaliana zu testen, inokulierten wir Bacillus velezensis SQR9 WT und eine abgeleitete Mutante Δ8mcp separat in die Rhizosphäre von A. thaliana . Das Δ8mcp ist eine Mutante, der alle Chemorezeptor-kodierenden Gene fehlen und die eine signifikant verringerte Besiedlung aufweist6. Wir haben ihre Besiedlung 2 Tage nach der Inokulation mit dem vorliegenden Wurzelbesiedlungsassay gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Reduktion der Wurzelbesiedlung von Δ8mcp, was darauf hindeutet, dass diese Bedingung und Methode die Bakterienbesiedlung effektiv misst (Abbildung 1C).
Abbildung 1: Wachstum von A. thaliana und die Wurzelbesiedlung von Bacillus velezensis SQR9 und Δ8mcp. (A) Die Draufsicht auf 7 Tage alte A. thaliana, die in 6-Well-Platten mit Zellfärber in hydroponischem Zustand wächst. (B) Die Seitenansicht von 7 Tage alten A. thaliana, die in 6-Well-Platten wächst, die jeweils 3 Sämlinge enthalten. (C) Besiedlung von B. velezensis Wildtyp SQR9 und Δ8mcp , gemessen mit dem vorgestellten Assay. Sechs Replikate wurden eingeschlossen, und die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Um eine gute Reproduzierbarkeit zu erreichen, gibt es vier kritische Schritte für den Besiedlungsnachweis dieses Protokolls. Zunächst muss sichergestellt werden, dass die Anzahl der geimpften Bakterienzellen in jedem Experiment genau gleich ist. Zweitens ist es auch notwendig, die Reinigungsintensität der unbesiedelten Bakterien mit sterilem Wasser zu kontrollieren. Drittens muss jeder Probenverdünnungsprozess vor der Durchführung vortexiert werden, damit sich die Probe in einem vollständigen Mischzustand befindet, um Absorptionsfehler aufgrund der Eigenschaften von Bakterien zu vermeiden, die leicht im Mikrozentrifugenröhrchen versenkt werden können. Daher empfehlen wir, die Bakteriensuspension vor jeder Aufnahme mit einem Vortex-Instrument zu mischen. Viertens sollte die Asepsis bei allen Operationen, bei denen diese Methode angewendet wird, streng sichergestellt werden, um jede Möglichkeit einer Kontamination zu vermeiden.
Mit dieser Methode werden die auf der Wurzeloberfläche besiedelten Bakterien bestimmt. Neben Bakterien an der Wurzeloberfläche besiedeln auch endophytische Bakterien und Pilze die Rhizosphäre der Pflanze7. Die Besiedlungsfähigkeit endophytischer Bakterien kann immer noch unter Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Protokolls nachgewiesen werden, aber das Wurzelgewebe sollte so gemahlen werden, dass endophytische Bakterien freigesetzt werden. Die endophytischen Pilze unterscheiden sich jedoch von Bakterien. Die meisten gängigen Methoden verwenden die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), um das Wachstum von Hyphen zu beobachten, eine qualitative Nachweismethode, die der fluoreszierenden Markierung von Bakterien zur Visualisierung ähnelt8.
Beim Vergleich der Besiedlung verschiedener Stämme sollten diese nicht in einer 6-Well-Platte geimpft werden, um den Einfluss der bakteriellen flüchtigen Verbindungen9 und der pflanzlichen flüchtigen Verbindungen10,11 zu vermeiden. Wir wählten 2 Tage nach der Inokulation für den Nachweis der Wurzel, da die Besiedlung von SQR9 das Maximum zwischen 2 und 4 Tagen erreichte; Die Zeit für den Nachweis der bakteriellen Besiedlung kann je nach Stamm angepasst werden.
Im Vergleich zu anderen beschriebenen Methoden ist diese Methode genau und einfach zu bedienen. Zum Beispiel lässt das von Noam et al. beschriebene Verfahren die festgewachsene Arabidopsis sofort mit Bakterien impfen, wenn sie in den hydroponischen Zustand versetzt wird12,13. Hier schlagen wir vor, dass die Bakterien nach mehreren Tagen der Transplantation in die Rhizosphäre geimpft werden sollten, um den Einfluss der Pflanzenanpassung an die veränderte Wachstumsumgebung zu vermeiden. Die in dieser Studie beschriebene Methode ist auch gut für Pflanzen, um Wurzelexsudat freizusetzen, das die Besiedlung beeinflusst.
Um die Pflanzentriebe getrennt an der Luft und völlig weg von der flüssigen Immersion wachsen zu lassen, haben wir einige kleinere Modifikationen und Bearbeitungen am Zellfärber vorgenommen, um sie für diese hydroponische Methode verfügbar zu machen. Darüber hinaus eignet sich dieses Verfahren besser für die genaue Bestimmung der bakteriellen Besiedlung in kleinen Mengen, nicht jedoch für große Mengen von Wurzelexsudaten, die in Hydrokulturen gesammelt werden14. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode auf der Grundlage bereits veröffentlichter Studien modifiziert wurde 12,14,15.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit den Inhalten dieses Artikels haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32370135), dem Innovationsprogramm der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS-CSAL-202302) und dem Wissenschafts- und Technologieprojekt des Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
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