Summary
La colonización de las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) en la rizosfera es esencial para su efecto promotor del crecimiento. Es necesario estandarizar el método de detección de la colonización bacteriana de la rizosfera. Aquí, describimos un método reproducible para cuantificar la colonización bacteriana en la superficie de la raíz.
Abstract
La medición de la colonización bacteriana en la raíz de Arabidopsis thaliana es uno de los experimentos más frecuentes en los estudios de interacción planta-microbio. Es necesario un método estandarizado para medir la colonización bacteriana en la rizosfera para mejorar la reproducibilidad. Primero cultivamos A. thaliana estéril en condiciones hidropónicas y luego inoculamos las células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de OD600 de 0,01. A los 2 días después de la inoculación, el tejido de la raíz se cosechó y se lavó tres veces en agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. A continuación, se pesaron las raíces y se recogieron por vórtice las células bacterianas colonizadas en la raíz. La suspensión celular se diluyó en un gradiente con un tampón salino tamponado con fosfato (PBS), seguido de un recubrimiento en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Las placas se incubaron a 37 °C durante 10 h y, a continuación, se contaron y normalizaron las colonias individuales en placas LB para indicar las células bacterianas colonizadas en las raíces. Este método se utiliza para detectar la colonización bacteriana en la rizosfera en condiciones de mono-interacción, con buena reproducibilidad.
Introduction
Existen métodos cuantitativos y cualitativos para detectar la colonización de la rizosfera por una sola cepa bacteriana. Para el método cualitativo, se debe utilizar una cepa que exprese fluorescencia constitutivamente, y la distribución e intensidad de la fluorescencia debe examinarse con microscopía de fluorescencia o instrumentos confocales láser 1,2. Esas estrategias pueden reflejar bien la colonización bacteriana in situ3, pero no son tan precisas como los métodos tradicionales de recuento en placa en la cuantificación. Además, debido a la limitación de mostrar solo zonas radiculares parciales bajo el microscopio, a veces puede estar influenciado por un sesgo subjetivo.
Aquí, describimos un método cuantitativo, que incluye la recolección de las células bacterianas colonizadas y el recuento de las UFC bacterianas en una placa. Este método se basa en la dilución y el recubrimiento mediante el cual se pueden contar las cepas colonizadas que se eliminaron de las raíces de las plantas, y se puede calcular el número total de bacterias colonizadas en la raíz 4,5.
Primero, A. thaliana se cultivó en condiciones hidropónicas, y luego se inocularon células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de 0.01 OD600. Los tejidos radiculares infectados se recolectaron 2 días después de la inoculación y se lavaron con agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. Además, se recolectaron células bacterianas colonizadas en la raíz, se diluyeron en tampón salino tamponado con fosfato (PBS) y se colocaron en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Después de la incubación a 37 °C durante 10 h, se contaron y normalizaron colonias individuales en placas LB para determinar las células bacterianas colonizadas en las raíces.
Este método es altamente aplicable, tiene buena repetibilidad y es más adecuado para la determinación precisa de la colonización bacteriana de la rizosfera.
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Protocol
1. Cultivo hidropónico estéril de A. thaliana
- Prepara las plántulas de A. thaliana .
- Prepare el medio de cultivo de plántulas de A. thaliana , que consiste en 1/2 medio MS (Murashige y Skoog) con 2% (peso/volumen) de sacarosa y 0,9% (peso/volumen) de agar.
- Vierta el medio de esterilización preparado en placas de Petri cuadradas estériles (13 cm x 13 cm) antes de la solidificación. Evite secar al aire para mantener la humedad.
- Sumerja las semillas de A. thaliana en un tubo de microcentrífuga de 2 mL lleno con 1 mL de agua estéril a 4 °C durante más de 12 h, y luego esterilice las semillas con 1 mL de NaClO al 2% (vol/vol) durante 2 min.
- Lave bien las semillas con agua estéril seis veces para eliminar la solución de NaClO. Siembre las semillas en placas de Petri con medio de agar MS con una punta estéril de 1 mL.
- Selle las placas de Petri con cinta médica transpirable y colóquelas verticalmente en una incubadora ligera para que crezcan durante 1 semana. Ajuste la relación día/noche de la incubadora de luz a 16 h/8 h, mantenga la temperatura a 23 °C y la humedad entre el 40% y el 60%.
- Trasplante de A. thaliana.
- Corte agujeros de 5 mm en un tintor celular de 40 μm de tamaño de poro y estériles.
- Trasplante tres plantas de A. thaliana de 7 días de edad a través de los orificios de un colador de células y colóquelas en una placa de 6 pocillos que contenga 3 mL de medio líquido estéril 1/2 MS con 0.5% de sacarosa.
- Coloque las placas de 6 pocillos en una incubadora ligera (Figura 1A) e incube durante 10 días.
2. Cultivo e inoculación de bacterias
- Prepare la suspensión bacteriana para la inoculación.
- En el caso de Bacillus velezensis, inocular las células bacterianas en un medio LB estéril e incubar a 37 °C agitando a 170 rpm hasta alcanzar un diámetro exterior de600 de 0,8-1,2.
- Recoja las células bacterianas por centrifugación a 6000 x g durante 2 min y vuelva a suspender las células en tampón PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Repita los pasos de centrifugado y resuspensión 3 veces para eliminar el medio LB y los metabolitos bacterianos.
- Suspender las células bacterianas en un medio fresco de 1/2 MS a una concentración final de OD600 0,01. Inocular las suspensiones de bacterias en las placas de 6 pocillos que cultivan plántulas de A. thaliana , colocar las placas de 6 pocillos en la incubadora de luz y cultivarlas durante 2 días.
3. Medición de bacterias colonizadas en las raíces
- Recolecta el tejido de la raíz y coloca las células colonizadas.
NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo condiciones gnotobióticas- Pesa los tubos de 2 ml y registra el peso como W0.
- Coseche los tejidos de la raíz de A. thaliana cocultivados y lávelos en agua estéril 3 veces. Coloca la raíz sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua.
- Coloque la raíz en el tubo de microcentrífuga pesado, pese las raíces junto con el tubo y regístrelo como W1.
- Agregue 1 mL de PBS a cada tubo y haga vórtice los tubos durante 8 min a la velocidad máxima.
- Diluir las suspensiones con las células bacterianas colonizadas por las raíces recolectadas a 1 x 10-1-1 x 10-4 (de acuerdo con la capacidad de colonización de las bacterias). Extienda las suspensiones bacterianas diluidas en placas que contengan medio de agar LB e incube a 37 °C durante 10 h.
- Cuente las colonias y normalice los datos.
- Cuente las colonias bacterianas en placas LB.
- Calcular las UFCs según la dilución correspondiente y normalizar los datos con el peso fresco de la raíz (W1-W 0). Los resultados finales indican el recuento de células bacterianas colonizadas por gramo de raíz a los 2 días después de la inoculación (Figura 1B).
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Representative Results
Para probar la precisión de la capacidad de colonización de bacterias detectada por este método en la rizosfera de A. thaliana, inoculamos Bacillus velezensis SQR9 WT y un mutante derivado Δ8mcp en la rizosfera de A. thaliana por separado. El Δ8mcp es un mutante que carece de todos los genes que codifican para quimiorreceptores, y tiene una colonización significativamente disminuida6. Se midió su colonización a los 2 días después de la inoculación mediante el presente ensayo de colonización radicular. Los resultados mostraron una reducción significativa de la colonización radicular de Δ8mcp, lo que indica que esta condición y método miden eficazmente la colonización bacteriana (Figura 1C).
Figura 1: Crecimiento de A. thaliana y colonización radicular de Bacillus velezensis SQR9 y Δ8mcp. (A) La vista superior de A. thaliana de 7 días de edad creciendo en placas de 6 pocillos con tinción celular en condición hidropónica. (B) La vista lateral de A. thaliana de 7 días de edad creciendo en placas de 6 pocillos, cada pocillo contiene 3 plántulas. (C) Colonización de B. velezensis tipo salvaje SQR9 y Δ8mcp medida utilizando el ensayo presentado. Se incluyeron seis réplicas y los datos se presentan como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para lograr una buena reproducibilidad, hay cuatro pasos críticos para el proceso de detección de colonización de este protocolo. En primer lugar, es necesario asegurarse de que el número de células bacterianas inoculadas sea exactamente el mismo en cada experimento. En segundo lugar, también es necesario controlar la intensidad de limpieza de las bacterias no colonizadas con agua estéril. En tercer lugar, cada proceso de dilución de la muestra debe ser vertiginado antes de realizarse para que la muestra esté en un estado de mezcla completo para evitar los errores de absorción debido a las características de las bacterias que son fáciles de hundir en el tubo de microcentrífuga. Por lo tanto, recomendamos utilizar un instrumento de vórtice para mezclar la suspensión bacteriana antes de cada absorción. En cuarto lugar, la asepsia debe garantizarse estrictamente durante todas las operaciones que utilicen este método para evitar cualquier posibilidad de contaminación.
Este método se utiliza para determinar las bacterias colonizadas en la superficie de la raíz. Excepto las bacterias de la superficie de la raíz, las bacterias endófitas y los hongos que también colonizan la rizosfera de la planta7. La capacidad de colonización de las bacterias endófitas aún se puede detectar utilizando el protocolo descrito en este artículo, pero el tejido de la raíz debe molerse para liberar bacterias endófitas. Sin embargo, los hongos endófitos son diferentes de las bacterias. La mayoría de los métodos convencionales utilizan la microscopía electrónica de transmisión (TEM) para observar el crecimiento de las hifas, que es un método de detección cualitativa similar a las bacterias fluorescentes de marcaje para la visualización8.
Al comparar la colonización de diferentes cepas, no deben inocularse en una placa de 6 pocillos para evitar la influencia de los compuestos volátiles bacterianos9 y los compuestos volátiles de las plantas10,11. Elegimos 2 días después de la inoculación para la detección de raíz porque la colonización de SQR9 alcanzó el máximo entre 2 y 4 días; El tiempo de detección de la colonización bacteriana se puede ajustar según las cepas.
En comparación con otros métodos descritos, este método es preciso y fácil de operar. Por ejemplo, el método descrito por Noam et al. hace que la arabidopsis cultivada sólidamente sea inoculada con bacterias inmediatamente cuando se trasplanta a la condición hidropónica12,13. Aquí, proponemos que las bacterias deben ser inoculadas a la rizosfera después de varios días de trasplante para evitar la influencia de la adaptación de la planta al entorno de crecimiento modificado. El método descrito en este estudio también es bueno para que las plantas liberen exudado de las raíces, lo que afecta la colonización.
Para permitir que los brotes de las plantas crezcan por separado en el aire y completamente lejos de la inmersión líquida, hicimos algunas modificaciones menores y procesamos en el tinte celular para que estuvieran disponibles para este método hidropónico. Además, este método es más adecuado para la determinación precisa de la colonización bacteriana en pequeñas cantidades, pero no para grandes cantidades de exudados radiculares recolectados en hidrocultivo14. Es importante destacar que este método es modificado con base en estudios previamente publicados 12,14,15.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32370135), el Programa de Innovación de la Academia China de Ciencias Agrícolas (CAAS-CSAL-202302), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Escuela Vocacional de Agricultura y Silvicultura de Jiangsu (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
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