Summary
A colonização de rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPR) na rizosfera é essencial para seu efeito promotor de crescimento. É necessário padronizar o método de detecção da colonização da rizosfera bacteriana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para quantificar a colonização bacteriana na superfície da raiz.
Abstract
A medição da colonização bacteriana na raiz de Arabidopsis thaliana é um dos experimentos mais frequentes em estudos de interação planta-micróbio. Um método padronizado para medir a colonização bacteriana na rizosfera é necessário para melhorar a reprodutibilidade. Primeiro cultivamos A.thaliana estéril em condições hidropônicas e, em seguida, inoculamos as células bacterianas na rizosfera a uma concentração final de OD600 de 0,01. Aos 2 dias após a inoculação, o tecido radicular foi colhido e lavado três vezes em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. As raízes foram então pesadas e as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas por vórtice. A suspensão celular foi diluída em um gradiente com tampão tampão salino tampão fosfato (PBS), seguido de plaqueamento em meio de ágar Luria-Bertani (LB). As placas foram incubadas a 37 °C por 10 h e, em seguida, as colônias únicas nas placas LB foram contadas e normalizadas para indicar as células bacterianas colonizadas nas raízes. Este método é usado para detectar colonização bacteriana na rizosfera em condições de monointeração, com boa reprodutibilidade.
Introduction
Existem métodos quantitativos e qualitativos para detectar a colonização da rizosfera por uma única cepa bacteriana. Para o método qualitativo, deve-se utilizar uma cepa que expresse constitutivamente a fluorescência, e a distribuição e intensidade da fluorescência devem ser examinadas em microscopia de fluorescência ou instrumentos confocais a laser 1,2. Essas estratégias podem refletir bem a colonização bacteriana in situ3, mas não são tão precisas quanto os métodos tradicionais de contagem de placas na quantificação. Além disso, devido à limitação de exibir apenas zonas radiculares parciais ao microscópio, às vezes pode ser influenciado por viés subjetivo.
Aqui, descrevemos um método quantitativo, que inclui a coleta das células bacterianas colonizadas e a contagem das UFCs bacterianas em uma placa. Este método é baseado na diluição e plaqueamento pelo qual as cepas colonizadas que foram retiradas das raízes das plantas podem ser contadas, e o número total de bactérias colonizadas na raiz pode ser calculado 4,5.
Primeiro, A. thaliana foi cultivada em condições hidropônicas e, em seguida, as células bacterianas foram inoculadas na rizosfera a uma concentração final de 0,01 OD600. Os tecidos radiculares infectados foram colhidos 2 dias após a inoculação e lavados em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. Além disso, as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas, diluídas em tampão salino tampão tampolado com fosfato (PBS) e semeadas em meio de ágar Luria-Bertani (LB). Após incubação a 37 °C por 10 h, colônias únicas em placas LB foram contadas e normalizadas para determinar as células bacterianas colonizadas nas raízes.
Este método é altamente aplicável, tem boa repetibilidade e é mais adequado para a determinação precisa da colonização bacteriana da rizosfera.
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Protocol
1. Cultivo hidropônico estéril de A. thaliana
- Prepare mudas de A. thaliana .
- Prepare o meio de mudas de cultura A. thaliana , que consiste em meio 1/2 MS (Murashige e Skoog) com 2% (peso / vol) de sacarose e 0,9% (peso / vol) de ágar.
- Despeje o meio de esterilização preparado em placas de Petri quadradas estéreis (13 cm x 13 cm) antes da solidificação. Evite secar ao ar para manter a umidade.
- Mergulhe as sementes de A. thaliana em um tubo de microcentrífuga de 2 mL cheio de 1 mL de água estéril a 4 ° C por mais de 12 h e, em seguida, esterilize as sementes com 1 mL de NaClO a 2% (vol / vol) por 2 min.
- Lave bem as sementes com água estéril seis vezes para remover a solução de NaClO. Semeie as sementes em placas de Petri com meio de ágar MS com uma ponta estéril de 1 mL.
- Sele as placas de Petri com fita médica respirável e coloque-as verticalmente em uma incubadora leve para crescer por 1 semana. Defina a relação dia/noite da incubadora de luz para 16 h/8 h, mantenha a temperatura em 23 °C e a umidade em 40%-60%.
- Transplante A. thaliana.
- Corte orifícios de 5 mm no corante de células de tamanho de poro de 40 μm e esterilize-os.
- Transplante três plantas de A. thaliana de 7 dias através dos orifícios de um filtro de células e coloque-as em uma placa de 6 poços contendo 3 mL de meio líquido estéril 1/2 MS com 0,5% de sacarose.
- Coloque as placas de 6 poços em uma incubadora leve (Figura 1A) e incube por 10 dias.
2. Cultivo e inoculação de bactérias
- Prepare a suspensão bacteriana para inoculação.
- Para Bacillus velezensis, inocular células bacterianas em meio LB estéril e incubar a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir OD600 de 0,8-1,2.
- Colete as células bacterianas por centrifugação a 6000 x g por 2 min e ressuspenda as células em tampão PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Repita as etapas de centrifugação e ressuspensão 3 vezes para remover o meio LB e os metabólitos bacterianos.
- Suspender as células bacterianas num meio fresco de 1/2 MS a uma concentração final de OD600 0,01. Inocule as suspensões de bactérias nas placas de 6 poços que cultivam mudas de A. thaliana , coloque as placas de 6 poços na incubadora leve e cultive-as por 2 dias.
3. Medição de bactérias colonizadas nas raízes
- Colha o tecido radicular e coloque as células colonizadas em placas.
NOTA: Todas as etapas devem ser conduzidas em condições gnotobióticas- Pese os tubos de 2 mL e registre o peso como W0.
- Colha os tecidos radiculares de A. thaliana co-cultivados e lave-os em água estéril 3 vezes. Coloque a raiz em papel de filtro para remover o excesso de água.
- Coloque a raiz no tubo de microcentrífuga pesado, pese as raízes junto com o tubo e registre-o como W1.
- Adicione 1 mL de PBS a cada tubo e vortex os tubos por 8 min na velocidade máxima.
- Dilua as suspensões com as células bacterianas colonizadas por raízes coletadas para 1 x 10-1-1 x 10-4 (de acordo com a capacidade de colonização da bactéria). Espalhar as suspensões bacterianas diluídas em placas contendo meio de ágar-LB e incubar a 37 °C durante 10 h.
- Conte as colônias e normalize os dados.
- Conte as colônias bacterianas em placas LB.
- Calcular as UFC de acordo com a diluição correspondente e normalizar os dados com a massa fresca das raízes (W1-W 0). Os resultados finais indicam a contagem de células bacterianas colonizadas por grama de raiz aos 2 dias pós-inoculação (Figura 1B).
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Representative Results
Para testar a precisão da capacidade de colonização de bactérias detectada por este método na rizosfera de A. thaliana, inoculamos Bacillus velezensis SQR9 WT e um mutante derivado Δ8mcp na rizosfera de A. thaliana separadamente. O Δ8mcp é um mutante que não possui todos os genes codificadores de quimiorreceptores e tem uma colonização significativamente diminuída6. Medimos sua colonização 2 dias após a inoculação pelo presente ensaio de colonização radicular. Os resultados mostraram uma redução significativa da colonização radicular de Δ8mcp, indicando que essa condição e método medem efetivamente a colonização bacteriana (Figura 1C).
Figura 1: Crescimento de A. thaliana e colonização radicular de Bacillus velezensis SQR9 e Δ8mcp. (A) A vista superior de A. thaliana de 7 dias crescendo em placas de 6 poços com corante de células em condição hidropônica. (B) A vista lateral de A. thaliana de 7 dias crescendo em placas de 6 poços, cada poço contendo 3 mudas. (C) Colonização de B. velezensis SQR9 e Δ8mcp do tipo selvagem medido usando o ensaio apresentado. Seis réplicas foram incluídas e os dados são apresentados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para obter uma boa reprodutibilidade, existem quatro etapas críticas para o processo de detecção de colonização deste protocolo. Primeiro, é necessário garantir que o número de células bacterianas inoculadas seja exatamente o mesmo em cada experimento. Em segundo lugar, também é necessário controlar a intensidade da limpeza de bactérias não colonizadas com água estéril. Terceiro, cada processo de diluição da amostra precisa ser submetido a vórtice antes de ser realizado para permitir que a amostra esteja em um estado de mistura completo para evitar os erros de absorção devido às características das bactérias que são fáceis de afundar no tubo da microcentrífuga. Portanto, recomendamos o uso de um instrumento de vórtice para misturar a suspensão bacteriana antes de cada absorção. Em quarto lugar, a assepsia deve ser rigorosamente assegurada durante todas as operações que utilizam este método para evitar qualquer possibilidade de contaminação.
Este método é usado para determinar as bactérias colonizadas na superfície da raiz. Exceto bactérias da superfície radicular, bactérias endofíticas e fungos também colonizam a rizosfera da planta7. A capacidade de colonização de bactérias endofíticas ainda pode ser detectada usando o protocolo descrito neste artigo, mas o tecido radicular deve ser moído para liberar bactérias endofíticas. No entanto, os fungos endofíticos são diferentes das bactérias. A maioria dos métodos convencionais usa microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para observar o crescimento das hifas, que é um método de detecção qualitativa semelhante às bactérias de marcação fluorescente para visualização8.
Ao comparar a colonização de diferentes cepas, elas não devem ser inoculadas em uma placa de 6 poços para evitar a influência dos compostos voláteis bacterianos9 e compostos voláteis vegetais10,11. Optou-se por 2 dias pós-inoculação para detecção de raiz porque a colonização de SQR9 atingiu o máximo entre 2 e 4 dias; O tempo de detecção da colonização bacteriana pode ser ajustado de acordo com as cepas.
Comparado com outros métodos descritos, este método é preciso e fácil de operar. Por exemplo, o método descrito por Noam et al. tem a arabidopse de crescimento sólido inoculada com bactérias imediatamente quando transplantada para a condição hidropônica12,13. Aqui, propomos que as bactérias sejam inoculadas na rizosfera após vários dias de transplante para evitar a influência da adaptação da planta ao ambiente de crescimento alterado. O método descrito neste estudo também é bom para as plantas liberarem exsudato radicular, o que afeta a colonização.
Para permitir que os brotos das plantas cresçam separadamente no ar e completamente longe da imersão líquida, fizemos algumas pequenas modificações e processamento no corante celular para disponibilizá-los para este método hidropônico. Além disso, este método é mais adequado para a determinação precisa da colonização bacteriana em pequenas quantidades, mas não para grandes quantidades de exsudatos radiculares coletados em hidrocultura14. É importante ressaltar que esse método é modificado com base em estudos publicados anteriormente 12,14,15.
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Disclosures
Os autores declaram não ter conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32370135), pelo Programa de Inovação da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas (CAAS-CSAL-202302), pelo Projeto de Ciência e Tecnologia da Faculdade Vocacional de Agricultura e Silvicultura de Jiangsu (2021kj29).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
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