Summary
Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.
Abstract
A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma proteína conservada que facilita o enovelamento de outras proteínas dentro da célula, tornando-a uma chaperona molecular. Enquanto Hsp70 não é essencial para células de E. coli crescendo em condições normais, esta chaperona torna-se indispensável para o crescimento em temperaturas elevadas. Uma vez que a Hsp70 é altamente conservada, uma maneira de estudar a função de chaperona de genes de Hsp70 de várias espécies é expressá-los heterologamente em cepas de E. coli que são deficientes em Hsp70 ou expressam uma Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. As células de E. coli dnaK756 são incapazes de suportar o DNA do bacteriófago λ. Além disso, sua Hsp70 nativa (DnaK) exibe atividade ATPase elevada, enquanto demonstra afinidade reduzida por GrpE (fator de troca de nucleotídeos Hsp70). Como resultado, as células de E. coli dnaK756 crescem adequadamente em temperaturas que variam de 30 °C a 37 °C, mas morrem em temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razão, essas células servem de modelo para o estudo da atividade de chaperona da Hsp70. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação dessas células na realização de um ensaio de complementação, possibilitando o estudo da função da chaperona in cellulo da Hsp70.
Introduction
As proteínas de choque térmico desempenham um papel importante como chaperonas moleculares, facilitando o enovelamento de proteínas, prevenindo a agregação proteica e revertendo o mau enovelamento de proteínas 1,2. A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma das chaperonas moleculares mais proeminentes, desempenhando um papel central na homeostase proteica 3,4. DnaK é o homólogo 5 de E. coli Hsp70.
Vários ensaios biofísicos, bioquímicos e baseados em células foram desenvolvidos para explorar a atividade de chaperona de Hsp70 e rastrear inibidores direcionados a essa chaperona 6,7,8. Hsp70 é uma proteína altamente conservada. Por essa razão, vários Hsp70s de organismos eucarióticos, como o Plasmodium falciparum (o principal agente da malária), têm sido relatados para substituir a função DnaK em E. coli 6,9. Desta forma, um ensaio de complementação baseado em E. coli foi desenvolvido envolvendo a expressão heteróloga de Hsp70s em E. coli para explorar sua função citoprotetora. Normalmente, este ensaio envolve a utilização de células de E. coli que são deficientes para DnaK ou que expressam um DnaK nativo que está funcionalmente comprometido. Embora a DnaK não seja essencial para o crescimento de E. coli em condições normais, ela se torna essencial quando as células são cultivadas sob condições estressantes, como temperaturas elevadas ou outras formas de estresse10,11.
Cepas de E. coli que foram desenvolvidas para estudar a função Hsp70 usando um ensaio de complementação incluem E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) e E. coli dnaK756. As células dnaK103 de E. coli produzem um DnaK truncado que não é funcional e, como tal, as células crescem adequadamente a 30 °C, enquanto a cepa é sensível ao estresse térmico e ao frio12,13. Da mesma forma, a cepa de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) não cresce acima de 40 °C14,15. A cepa de E. coli dnaK756 expressa um DnaK nativo mutante (DnaK756) caracterizado por três substituições de glicina para aspartato nas posições 32, 455 e 468, dando origem a resultados proteostáticos comprometidos. Consequentemente, essa cepa é resistente ao DNA λ do bacteriófago14. Além disso, E. coli dnaK756 exibe elevada atividade da ATPase, enquanto sua afinidade pelo fator de troca de nucleotídeos, GrpE, é reduzida16. E. coli Linhagens mutantes de DnaK servem como modelos ideais para investigar a atividade de chaperona de Hsp70 através de uma abordagem de complementação. Como a DnaK só é essencial sob condições estressantes, o ensaio de complementação é tipicamente conduzido em temperaturas elevadas (Figura 1). Algumas vantagens do uso de E. coli para este estudo incluem seu genoma bem caracterizado, crescimento rápido e baixo custo de cultivo e manutenção17.
Neste artigo, descrevemos em detalhes um protocolo envolvendo o uso de células de E. coli dnaK756 para estudar a função da Hsp70. As Hsp70s que empregamos no ensaio são DnaK selvagens e seu derivado quimérico, KPf (composto pelo domínio ATPase da DnaK fundido ao domínio C-terminal de ligação ao substrato C-terminal Hsp70-1 6,18). O KPf-V436F foi heterologamente expresso como um controle negativo, uma vez que a mutação essencialmente o bloqueia de substratos de ligação, revogando assim sua atividade de chaperona9.
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Protocol
1. Transformação
OBS: Utilize vidraria estéril para cultura, ponteiras de pipeta e meios recém-preparados e autoclavados. Preparar culturas das células de E. coli em ágar 2x triptona de levedura (YT) [1,6% triptona (p/v), 1% extrato de levedura (p/v), 0,5% NaCl (p/v), 1,5% ágar (p/v)]. Os reagentes gerais utilizados no protocolo e suas fontes são fornecidos na Tabela de Materiais.
- Rotular tubos de microcentrífuga de 2,0 mL e alíquota de 50 μL de células competentes de E. coli dnaK756, mantendo as células no gelo.
- Para os tubos de microcentrífuga de 2,0 mL com células competentes, alíquota de 10-50 ng de pQE60/DnaK, pQE60/KPf e pQE60/KPf-V436F plasmidialDNA 9 em tubos separados.
- Manter os tubos de microcentrífuga de 2,0 mL contendo as células competentes e o DNA plasmidial em gelo por 30 min.
- Choque térmico da mistura células-DNA competente por 60 s a 42 °C e retorno dos tubos de microcentrífuga de volta ao gelo por 10 min.
- Adicionar 950 μL de caldo fresco 2x YT (pré-incubado a 37 °C) e incubar a 37 °C agitando a 150 rotações/min durante 1 h. Deixe as células crescerem por muito mais tempo para incentivar sua recuperação, se necessário.
NOTA: Evite agitar as células vigorosamente. - Pipetar 100 μL das células e espalhá-las em placas de ágar 2x YT contendo 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina para a respectiva cepa e 100 μg/mL de ampicilina (ver Tabela de Materiais) para seleção de plasmídeos.
- Centrifugar o resto das células (cujo volume é agora de aproximadamente 900 μL) durante 1 min a 5000 x g (a 4 °C) utilizando uma microcentrífuga de bancada.
- Decantar cerca de 800 μL do caldo e usar o meio restante para ressuspender as células peletizadas.
- Plaquear as células recuperadas na placa de ágar 2x YT.
- Incubar ambas as placas de ágar durante a noite (ou aproximadamente 17 h) a 37 °C.
NOTA: Essas células crescem muito lentamente e podem precisar ser incubadas por muito mais tempo. Tenha cuidado para identificar as colônias que podem começar muito pequenas. A placa contendo células ressuspensas após centrifugação (etapa 1.7) serve como back-up caso a eficiência de transformação das células seja baixa, caso em que as células peletizadas podem melhorar a recuperação de quaisquer células transformadas. No entanto, se a eficiência de transformação for excelente, a placa de ágar na qual as células concentradas foram plaqueadas pode ser caracterizada por uma cultura crescida após a incubação, dificultando a identificação de colônias únicas. Nesse caso, a outra placa de ágar pode ser aquela em que crescem colônias bem espaçadas.
2. Revestimento celular
- Pegar uma única colônia dos transformadores e inocular-a em 10 mL de caldo 2x YT suplementado com 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina para a seleção das células de E. coli dnaK756 e 100 μg/mL de ampicilina para seleção de plasmídeos.
OBS: Utilizar frascos (≥50 mL) para garantir a aeração ao agitar a cultura. Incubar o inóculo durante a noite (17 h) a 37 °C enquanto agita a 150 rotações/min. - Faça uma leitura de absorvância em OD600 na manhã seguinte.
- Limpe a superfície da bancada de trabalho usando etanol 75% para esfregar a superfície em preparação para a detecção de células.
- Usando um tubo de microcentrífuga de 2 mL, padronizar a cultura para uma leitura OD600 de 2,0 usando caldo de 2x YT.
NOTA: Certifique-se de que as leituras OD são feitas corretamente, pois esta etapa é importante para padronizar a densidade celular nas várias amostras. - Usando tubos de microcentrífuga de 2 mL, prepare diluições seriadas das células de 100 a 10-5.
- Incubar as placas de ágar a serem usadas para identificar as células em um forno regulado a 40 °C para permitir que as placas sequem com as tampas parcialmente abertas para garantir que o vapor de água escape.
NOTA: Para garantir que as células sejam identificadas a distâncias uniformemente separadas, desenhe linhas em um pedaço de papel no qual um modelo de locais de detecção é impresso. - Spot 2 μL das células diluídas em série nas placas de ágar suplementadas com 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 100 μg/mL de ampicilina e 0,5 mM IPTG (para a indução da expressão das proteínas recombinantes) (ver Tabela de Materiais).
- Colocar cada amostra em duas placas separadas (uma a incubar a 37 °C e outra a 43,5 °C).
OBS: Evite perfurar a placa de ágar. - Amostras de controle spot na mesma placa que as amostras experimentais para minimizar os efeitos ambientais.
- Conduza a detecção rapidamente para garantir que o processo seja concluído antes que as células comecem a crescer, pois isso pode gerar padrões de crescimento distorcidos.
OBS: É importante evitar aerossóis ao detectar, pois estes contaminariam as placas. Também é importante manter as placas fechadas entre as manchas para evitar contaminação. - Incubar uma placa a 37 °C (temperatura de crescimento permissiva) e a outra à temperatura de crescimento não permissiva de 43,5 °C.
NOTA: Incube as placas viradas de cabeça para baixo para evitar a acumulação de vapor na tampa, pois a água condensada lavaria as colónias manchadas das suas posições. - Coloque todas as placas nas incubadoras ao mesmo tempo e evite abrir a incubadora até a manhã seguinte.
OBS: Abrir a porta da incubadora várias vezes durante a incubação das placas é desaconselhado. Isso ocorre porque o acesso do ar à incubadora pode resultar em flutuações de temperatura que afetam negativamente o crescimento celular.
3. Confirmação da expressão de proteínas recombinantes
- Usando um laço estéril, pegue parte das células restantes da mesma colônia de células transformadas de E. coli dnaK756.
- Inocular as células em caldo YT 10 mL suplementado com 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina e 100 μg/mL de ampicilina. Incubar durante a noite (17 h) a 37 °C enquanto agita a 150 rotações/min.
- Transferir a cultura para 90 mL de caldo estéril de 2x YT contendo os antibióticos necessários, conforme mencionado na etapa 3.2. Deixe as células crescerem até a fase logarítmica média (OD600 = 0,4-0,6).
- Tomar 2 mL da cultura da amostra antes da indução (0 h de amostra de indução).
- Adicionar IPTG a uma concentração final de 1 mM para induzir a produção de proteínas e reincubar as células a 37 °C.
- Tomar uma segunda amostra de 2 mL 6 h após a indução.
- Colher as células centrifugando a 5000 x g durante 10 min. Manter a temperatura da centrífuga a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet em tampão PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) e armazenar a -20 °C.
4. Análises de SDS-PAGE e western blot
- Preparar géis de SDS 2x 10% conforme descrito anteriormente19.
- Manter um dos géis SDS-PAGE para coloração subsequente usando a coloração de Coomassie para visualizar as bandas de proteínas. Use o segundo gel SDS-PAGE para realizar a análise de western blot.
- Alíquota 80 μL das amostras ressuspensas e misturá-las com 20 μL de tampão de carregamento 4x Laemmli SDS.
- Ferva a suspensão a 100 °C durante 10 min. Em seguida, carregue 10 μL de cada amostra no gel pré-moldado de SDS (ver Tabela de Materiais).
- Realizar eletroforese à temperatura ambiente por 1 h usando uma tensão de 120 V em uma solução de 1x de tampão de corrida SDS (Tris 25 mm, glicina 250 mm, SDS 0,1% (p/v).
- Manchar o gel com coloração de Coomassie (ver Tabela de Materiais) por 1 h, seguido de coloração usando tampão de coloração (50% (v/v) metanol, 10% (v/v) ácido acético em água destilada) por 2 h.
- Visualize as bandas de proteínas presentes no gel usando um sistema de imagem em gel (consulte a Tabela de Materiais). Execute novamente outro gel SDS-PAGE com as mesmas amostras seguindo o protocolo acima mencionado.
- Quando a corrida eletroforética terminar, tome géis de SDS-PAGE para realizar a análise de western blot, como descrito anteriormente19.
- Lavar a membrana de nitrocelulose para a qual as proteínas foram transferidas três vezes em tampão de lavagem (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
- Use α-DnaK (ver Tabela de Materiais) para detectar DnaK e α-PfHsp70-17 para detectar KPf e seu mutante, KPf-V436F), respectivamente.
- Utilizar os anticorpos na diluição de 1:2000 em leite desnatado a 5%. Incubar a 4 °C enquanto agita a 60 rotações/min durante 1 h.
- Remover anticorpos não especificamente ligados lavando a membrana de nitrocelulose em TBS-Tween 3 vezes em 15 min.
- Incubar a membrana no anticorpo secundário (α-coelho, ver Tabela de Materiais) nas mesmas condições da etapa anterior. Segue-se a lavagem subsequente nas mesmas condições que o anticorpo primário.
- Resolva as bandas usando o reagente de detecção de quimioluminescência (ECL) aprimorado.
- Visualize as bandas usando um imageador de gel.
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Representative Results
A Figura 2 apresenta a imagem do ágar escaneado contendo células que foram manchadas e cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C e 43,5 °C, respectivamente. No lado direito da Figura 2, os componentes do western blot excisados representam a expressão de DnaK, KPf e KPf-V436F em células de E. coli dnaK756. Como esperado, todas as células de E. coli dnaK756 cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C conseguiram crescer. Entretanto, sob as condições de crescimento não permissivo de 43,5 °C, apenas células que expressam heterologamente DnaK e KPf conseguiram crescer, como relatado anteriormente 6,9,20 (Figura 2). Por outro lado, as células que expressam KPf-V436F cresceram apenas a 37 °C, mas não cresceram a 43,5 °C. Isso demonstra que DnaK e KPf foram capazes de restaurar o defeito de crescimento de células de E. coli dnaK756 sob condições de estresse térmico. A falha das células em expressar heterologamente KPf-V436F em suportar o crescimento de células a 43,5 °C demonstra a falta de função chaperona desta proteína. A este respeito, KPf-V436F serve como uma proteína de controle negativo ideal.
Figura 1: Princípio do ensaio de complementação utilizando células de E. coli dnaK756 para estudar a função de chaperona de proteínas heterologamente expressas. E. coli dnaK756 expressa uma proteína nativa DnaK756 que é incapaz de proteger as células contra o estresse térmico. A introdução de Hsp70 heteróloga funcional resgata as células da morte após exposição ao estresse térmico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ensaio em placa de complementação demonstrando as capacidades de DnaK e KPf para proteger células de E. coli dnaK756 contra estresse térmico. As células transformadas foram cultivadas a 37 °C (temperatura de crescimento permissiva) e 43,5 °C (temperatura de crescimento não permissiva). As células foram padronizadas e plaqueadas em diluições seriadas. 'N' simboliza 'Neat', representando a primeira mancha composta por células não diluídas. No extremo direito estão as excisões de western blot que representam a expressão das três proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo demonstra a utilidade das células dnaK756 de E. colina exploração da função chaperona de Hsp70 heterologamente expressa. Este ensaio pode ser adotado para rastrear inibidores visando a função de Hsp70 em celulose. No entanto, uma limitação deste método é que Hsp70s incapazes de substituir DnaK em E. coli não são compatíveis com este ensaio. A falta de modificação pós-traducional21 de algumas Hsp70s não-nativas pode explicar sua falta de função dentro do sistema E. coli . Um ensaio de complementação baseado em levedura22 pode abordar algumas das deficiências do ensaio baseado em E. coli.
Várias etapas fundamentais são cruciais para garantir resultados reprodutíveis. Isso inclui garantir que apenas as células transformadas pela respectiva construção de plasmídeo sejam usadas durante o plaqueamento. Além disso, é importante evitar a contaminação da cultura ao longo das etapas. Além disso, como as células DnaK de E. coli estressadas são suscetíveis à filamentação excessiva10, é importante evitar agitação vigorosa durante o cultivo, pois esse estiramento físico promove extensa filamentação. Células excessivamente filamentadas fornecem leituras de crescimento aparente falsas mais altas em OD600, levando a uma superestimação do crescimento da cultura e impactando negativamente a padronização celular antes do plaqueamento. Embora a Hsp70 não seja essencial para o crescimento de E. coli em condições normais, células carentes dessa proteína são suscetíveis ao estresse10. Por esta razão, as células de E. coli dnaK756 crescem muito mais lentamente após serem transformadas ou durante sua recuperação de estoques de glicerol. Além disso, são extremamente sensíveis às flutuações de temperatura. Portanto, é importante evitar abrir a porta da incubadora, uma vez que as placas de ágar chapeadas são colocadas dentro até que seja hora de visualizar as placas.
Os dados de western blot são importantes para confirmar a expressão das respectivas proteínas Hsp70 recombinantes em células de E. coli dnaK756. A falha em expressar a respectiva proteína leva a um resultado falso-negativo para células que crescem sob temperatura de crescimento não permissiva.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado com financiamento obtido do International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) grant number, HDI/CRP/012, Research Directorate of the University of Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) e da National Research Foundation (NRF) da África do Sul (grant numbers, 75464 & 92598) concedido à AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
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