Summary
Detta protokoll demonstrerar chaperonaktiviteten hos värmechockprotein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-celler fungerar som en modell för analysen eftersom de har en infödd, funktionellt nedsatt Hsp70, vilket gör dem mottagliga för värmestress. Den heterologa introduktionen av funktionell Hsp70 räddar tillväxtbristen hos cellerna.
Abstract
Heat shock protein 70 (Hsp70) är ett konserverat protein som underlättar veckningen av andra proteiner i cellen, vilket gör det till en molekylär chaperon. Även om Hsp70 inte är nödvändigt för E. coli-celler som växer under normala förhållanden, blir detta chaperon oumbärligt för tillväxt vid förhöjda temperaturer. Eftersom Hsp70 är mycket konserverat är ett sätt att studera chaperonfunktionen hos Hsp70-gener från olika arter att heterologiskt uttrycka dem i E. coli-stammar som antingen har brist på Hsp70 eller uttrycker en naturlig Hsp70 som är funktionellt komprometterad. E. coli dnaK756-celler kan inte stödja λ bakteriofag DNA. Dessutom uppvisar deras naturliga Hsp70 (DnaK) förhöjd ATPas-aktivitet samtidigt som de visar minskad affinitet för GrpE (Hsp70 nukleotidutbytesfaktor). Som ett resultat växer E. coli dnaK756-celler tillräckligt vid temperaturer från 30 °C till 37 °C, men de dör vid förhöjda temperaturer (>40 °C). Av denna anledning fungerar dessa celler som en modell för att studera chaperonaktiviteten hos Hsp70. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för applicering av dessa celler för att genomföra en komplementeringsanalys, vilket möjliggör studier av in cellulo chaperonfunktionen hos Hsp70.
Introduction
Värmechockproteiner spelar en viktig roll som molekylära chaperoner genom att underlätta proteinveckning, förhindra proteinaggregering och vända felveckningav proteiner 1,2. Värmechockprotein 70 (Hsp70) är en av de mest framträdande molekylära chaperoner, som spelar en central roll i proteinhomeostas 3,4. DnaK är E. coli Hsp70-homolog5.
Olika biofysiska, biokemiska och cellbaserade analyser har utvecklats för att utforska chaperonaktiviteten hos Hsp70 och för att screena för hämmare riktade mot detta chaperon 6,7,8. Hsp70 är ett mycket konserverat protein. Av denna anledning har flera Hsp70 av eukaryota organismer, såsom Plasmodium falciparum (malarians huvudämne), rapporterats ersätta DnaK-funktionen i E. coli 6,9. På detta sätt har en E. coli-baserad komplementeringsanalys utvecklats som involverar det heterologa uttrycket av Hsp70 i E. coli för att utforska deras cytoprotektiva funktion. Vanligtvis innebär denna analys användning av E. coli-celler som antingen har brist på DnaK eller som uttrycker en naturlig DnaK som är funktionellt komprometterad. Även om DnaK inte är nödvändigt för E. coli-tillväxt under normala förhållanden, blir det viktigt när cellerna odlas under stressiga förhållanden som förhöjda temperaturer eller andra former av stress10,11.
E. coli-stammar som har utvecklats för att studera Hsp70-funktionen med hjälp av en komplementeringsanalys inkluderar E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) och E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-celler producerar en trunkerad DnaK som är icke-funktionell, och som sådan växer cellerna tillräckligt vid 30 °C, medan stammen är känslig för kyla och värmestress 12,13. På samma sätt växer inte stammen E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) över 40 °C14,15. E. coli dnaK756-stammen uttrycker en muterad naturlig DnaK (DnaK756) som kännetecknas av tre glycin-till-aspartat-substitutioner vid positionerna 32, 455 och 468, vilket ger upphov till komprometterade proteostatiska resultat. Följaktligen är denna stam resistent mot bakteriofag λ DNA14. Dessutom uppvisar E. coli dnaK756 förhöjd ATPas-aktivitet, medan dess affinitet för nukleotidutbytesfaktorn, GrpE, är reducerad16. E. coli DnaK-mutantstammar fungerar som idealiska modeller för att undersöka chaperonaktiviteten hos Hsp70 genom en komplementeringsmetod. Eftersom DnaK endast är essentiellt under stressiga förhållanden utförs komplementeringsanalysen vanligtvis vid förhöjda temperaturer (figur 1). Några fördelar med att använda E. coli för denna studie inkluderar dess välkarakteriserade genom, snabba tillväxt och den låga kostnaden för odling och underhåll17.
I den här artikeln beskriver vi i detalj ett protokoll som involverar användning av E. coli dnaK756-celler för att studera funktionen hos Hsp70. De Hsp70 som vi använde i analysen är vildtyps-DnaK och dess chimära derivat, KPf (som består av ATPas-domänen av DnaK fusionerad med den C-terminala substratbindande domänen av Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F uttrycktes heterologiskt som en negativ kontroll eftersom mutationen i huvudsak blockerar den från att binda substrat, vilket upphäver dess chaperonaktivitet9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Omvandling
OBS: Använd sterila glas för odling, pipettspetsar och nyberedda och autoklaverade medier. Förbered kulturer av E. coli-cellerna i 2x jästrypton (YT) [1,6 % trypton (vikt/volym), 1 % jästextrakt (vikt/volym), 0,5 % NaCl (vikt/volym), 1,5 % agar (vikt/volym)] agar. Allmänna reagenser som används i protokollet och deras källor finns i materialförteckningen.
- Märk 2,0 ml mikrocentrifugrör och alikvot 50 μL kompetenta E. coli dnaK756-celler, håll cellerna på is.
- Till 2,0 ml mikrocentrifugrör med kompetenta celler, alikvot 10-50 ng av pQE60/DnaK, pQE60/KPf och pQE60/KPf-V436F plasmid-DNA9 i separata rör.
- Håll 2.0 ml mikrocentrifugrören som innehåller de kompetenta cellerna och plasmid-DNA på is i 30 minuter.
- Värmechocka den kompetenta cell-DNA-blandningen i 60 s vid 42 °C och lägg tillbaka mikrocentrifugrören på is i 10 minuter.
- Tillsätt 950 μl färsk 2x YT-buljong (förinkuberad vid 37 °C) och inkubera vid 37 °C under omskakning med 150 varv/min i 1 timme. Låt cellerna växa mycket längre för att uppmuntra deras återhämtning om det behövs.
OBS: Undvik att skaka cellerna kraftigt. - Pipettera över 100 μl av cellerna och sprid ut dem på 2x YT-agarplattor innehållande 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin för respektive stam och 100 μg/ml ampicillin (se materialtabell) för plasmidval.
- Centrifugera resten av cellerna (vars volym nu är cirka 900 μL) i 1 minut vid 5000 x g (vid 4 °C) med en bänkmikrocentrifug.
- Dekantera ca 800 μL av buljongen och använd det återstående mediet för att återsuspendera de pelleterade cellerna.
- Platta de återvunna cellerna på 2x YT-agarplattan.
- Inkubera båda agarplattorna över natten (ca 17 timmar) vid 37 °C.
OBS: Dessa celler växer mycket långsamt och kan behöva inkuberas mycket längre. Var noga med att upptäcka kolonierna som kan börja mycket små. Plattan som innehåller celler som återsuspenderas efter centrifugering (steg 1.7) fungerar som en reserv om cellernas omvandlingseffektivitet är dålig, i vilket fall de pelleterade cellerna kan förbättra återvinningen av eventuella omvandlade celler. Men om omvandlingseffektiviteten är utmärkt kan agarplattan på vilken koncentrerade celler pläterades karakteriseras av en övervuxen kultur vid inkubation, vilket gör det svårt att identifiera enskilda kolonier. I så fall kan den andra agarplattan vara den på vilken välplacerade kolonier växer.
2. Cellplätering
- Plocka upp en enda koloni från transformanterna och inokulera den i 10 ml 2x YT-buljong kompletterad med 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin för urval av E. coli dnaK756-celler och 100 μg/ml ampicillin för plasmidval.
OBS: Använd kolvar (≥50 ml) för att säkerställa luftning vid omrörning av kulturen. Inkubera inokulet över natten (17 timmar) vid 37 °C under omskakning med 150 varv/min. - Gör en absorbansavläsning vid OD600 följande morgon.
- Rengör arbetsbänkens yta med 75 % etanol för att svabba ytan som förberedelse för cellspotting.
- Använd ett 2 ml mikrocentrifugrör och standardisera kulturen till en OD600-avläsning på 2.0 med 2x YT-buljong.
OBS: Se till att OD-avläsningarna tas korrekt eftersom detta steg är viktigt för att standardisera celldensiteten över de olika samples. - Använd 2 ml mikrocentrifugrör och förbered serieutspädningar av cellerna från 100 till 10-5.
- Inkubera agarplattorna som ska användas för att placera cellerna i en ugn inställd på 40 °C så att plattorna kan torka med locken delvis öppna för att säkerställa att vattenånga kommer ut.
OBS: För att säkerställa att cellerna är prickiga på jämnt separerade avstånd, rita linjer på ett papper på vilket en mall av spotting platser skrivs ut. - Placera 2 μl av de serieutspädda cellerna på agarplattorna kompletterat med 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin, 100 μg/ml ampicillin och 0,5 mM IPTG (för induktion av uttryck av de rekombinanta proteinerna) (se materialförteckning).
- Lägg varje prov på två separata plattor (den ena inkuberas vid 37 °C och den andra vid 43,5 °C).
OBS: Undvik att sticka hål på agarplattan. - Stickproverna på samma platta som de experimentella proverna för att minimera miljöpåverkan.
- Utför spottingen snabbt för att säkerställa att processen är klar innan cellerna börjar växa, eftersom detta kan generera skeva tillväxtmönster.
OBS: Det är viktigt att undvika aerosoler vid spotting, eftersom dessa skulle förorena plattorna. Det är också viktigt att hålla plattorna stängda mellan fläckarna för att undvika kontaminering. - Inkubera den ena plattan vid 37 °C (tillåten tillväxttemperatur) och den andra vid den icke-tillåtna tillväxttemperaturen 43,5 °C.
OBS: Inkubera plattorna vända upp och ner för att undvika att ånga samlas på locket, eftersom det kondenserade vattnet skulle tvätta bort de fläckiga kolonierna från sina positioner. - Lägg alla plattor i inkubatorerna samtidigt och undvik att öppna inkubatorn förrän morgonen därpå.
OBS: Vi rekommenderar inte att du öppnar inkubatordörren flera gånger under inkubationen av plattorna. Detta beror på att tillgången till luft i inkubatorn kan resultera i temperaturfluktuationer som påverkar celltillväxten negativt.
3. Bekräfta uttryck av rekombinanta proteiner
- Använd en steril slinga för att plocka upp en del av de återstående cellerna från samma koloni av transformerade E. coli dnaK756-celler.
- Inokulera cellerna i 10 ml YT-buljong kompletterad med 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin och 100 μg/ml ampicillin. Inkubera över natten (17 timmar) vid 37 °C under skakning vid 150 varv/min.
- Överför kulturen till 90 ml steril 2x YT-buljong som innehåller nödvändiga antibiotika enligt punkt 3.2. Låt cellerna växa till mitten av logfasen (OD600 = 0,4-0,6).
- Ta 2 ml av provkulturen före induktion (0 timmar induktionsprov).
- Tillsätt IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM för att inducera proteinproduktion och inkubera cellerna på nytt vid 37 °C.
- Ta ett andra 2 ml prov 6 timmar efter induktion.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 5000 x g i 10 min. Håll centrifugtemperaturen på 4 °C.
- Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i PBS-buffert (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) och förvara vid -20 °C.
4. SDS-PAGE och western blot-analyser
- Förbered 2x 10% SDS-geler som tidigare beskrivits19.
- Behåll en av SDS-PAGE-gelerna för efterföljande färgning med Coomassie-fläck för att se proteinbanden. Använd den andra SDS-PAGE-gelen för att utföra western blot-analys.
- Avlägsna 80 μl av de återsuspenderade proverna och blanda det med 20 μl 4x Laemmli SDS-belastningsbuffert.
- Koka suspensionen vid 100 °C i 10 min. Fyll sedan på 10 μL av varje prov på den prefabricerade SDS-gelen (se materialförteckning).
- Utför elektrofores vid rumstemperatur i 1 timme med en spänning på 120 V i en 1x lösning av SDS-löpbuffert (25 mm Tris, 250 mm glycin, 0,1 % (vikt/volym) SDS).
- Färga gelen med Coomassie stain (se Materialtabell) i 1 timme, följt av avfärgning med avfärgningsbuffert (50 % (v/v) metanol, 10 % (v/v) ättiksyra i destillerat vatten) i 2 timmar.
- Visualisera proteinbanden som finns i gelen med hjälp av ett gelavbildningssystem (se materialförteckning). Kör en annan SDS-PAGE-gel igen med samma samples enligt ovan nämnda protokoll.
- När den elektroforetiska körningen är slut, ta SDS-PAGE-geler för att utföra western blot-analys som tidigare beskrivits19.
- Tvätta nitrocellulosamembranet på vilket proteinerna överfördes tre gånger i tvättbuffert (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
- Använd α-DnaK (se materialförteckning) för att detektera DnaK respektive α-PfHsp70-17 för att detektera KPf respektive dess mutant, KPf-V436F).
- Använd antikropparna i spädning 1:2000 i 5 % fettfri mjölk. Inkubera vid 4 °C under skakning med 60 varv/min i 1 timme.
- Avlägsna icke-specifikt bundna antikroppar genom att tvätta nitrocellulosamembranet i TBS-Tween 3 gånger på 15 minuter.
- Inkubera membranet i den sekundära antikroppen (α-kanin, se materialtabell) under samma betingelser som i föregående steg. Detta följs av efterföljande tvätt under samma betingelser som den primära antikroppen.
- Lös upp banden med hjälp av ECL-detektionsreagens (enhanced chemiluminescence).
- Visualisera banden med hjälp av en gelkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar en bild av de skannade agarinnehållande celler som upptäcktes och odlades vid den tillåtna tillväxttemperaturen 37 °C respektive 43,5 °C. På höger sida av figur 2 representerar utskurna western blot-komponenter uttrycket av DnaK, KPf och KPf-V436F i E. coli dnaK756-celler. Som väntat lyckades alla E. coli dnaK756-celler som odlats vid den tillåtna tillväxttemperaturen 37 °C växa. Under de icke-tillåtande tillväxtbetingelserna på 43,5 °C var det dock endast celler som heterologt uttryckte DnaK och KPf som lyckades växa, vilket tidigare rapporterats 6,9,20 (figur 2). Å andra sidan växte celler som uttrycker KPf-V436F endast vid 37 °C men misslyckades med att växa vid 43,5 °C. Detta visar att DnaK och KPf kunde återställa tillväxtdefekten hos E. coli dnaK756-celler under värmestressförhållanden. Att celler som heterologt uttrycker KPf-V436F inte kan stödja cellernas tillväxt vid 43,5 °C visar att detta protein inte har någon chaperonfunktion. I detta avseende fungerar KPf-V436F som ett idealiskt negativt kontrollprotein.
Figur 1: Princip för komplementeringsanalys med användning av E. coli dnaK756-celler för att studera chaperonfunktionen hos heterologiskt uttryckta proteiner. E. coli dnaK756 uttrycker ett naturligt DnaK756-protein som inte kan skydda cellerna mot värmestress. Introduktion av funktionell heterolog Hsp70 räddar cellerna från döden vid exponering för värmestress. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Komplementplatteanalys som visar DnaK:s och KPf:s förmåga att skydda E. coli dnaK756-celler mot värmestress. De transformerade cellerna odlades vid 37 °C (tillåten tillväxttemperatur) och 43,5 °C (icke-tillåtande tillväxttemperatur). Cellerna standardiserades och pläterades som seriespädningar. "N" symboliserar "snyggt", vilket representerar den första fläcken som består av outspädda celler. Längst till höger finns de västra blot-excisionerna som representerar uttrycket av de tre proteinerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet visar användbarheten av E. coli dnaK756-cellerför att utforska chaperonfunktionen hos heterologt uttryckt Hsp70. Denna analys kan användas för att screena hämmare som riktar sig mot Hsp70-funktionen i cellulo. En begränsning med denna metod är dock att Hsp70 som inte kan ersätta DnaK i E. coli inte är kompatibla med denna analys. Brist på posttranslationell modifiering21 av vissa icke-nativa Hsp70 kan förklara deras brist på funktion inom E. coli-systemet . En jästbaserad komplementeringsanalys22 kan åtgärda några av bristerna i den E. coli-baserade analysen.
Flera viktiga steg är avgörande för att säkerställa reproducerbara resultat. Dessa inkluderar att säkerställa att endast celler som transformeras av respektive plasmidkonstruktion används under pläteringen. Dessutom är det viktigt att undvika kontaminering av grödan under hela steget. Dessutom, eftersom stressade E. coli DnaK-celler är mottagliga för överdriven filamentation10, är det viktigt att undvika kraftig skakning under odling, eftersom denna fysiska stam främjar omfattande filamentation. Överdrivet filamenterade celler ger högre falska skenbara tillväxtvärden vid OD600, vilket leder till en överskattning av odlingstillväxten och negativt påverkar cellstandardiseringen före plätering. Även om Hsp70 inte är nödvändigt för E. coli-tillväxt under normala förhållanden, är celler som saknar detta protein stresskänsliga. Av denna anledning växer E. coli dnaK756-celler mycket långsammare efter att ha omvandlats eller under deras återhämtning från glycerollager. Dessutom är de extremt känsliga för temperaturfluktuationer. Därför är det viktigt att undvika att öppna inkubatordörren när de pläterade agarplattorna är placerade inuti tills det är dags att titta på plattorna.
Western blot-data är viktiga för att bekräfta uttrycket av respektive rekombinanta Hsp70-proteiner i E. coli dnaK756-celler. Underlåtenhet att uttrycka respektive protein leder till ett falskt negativt resultat för celler som växer under icke-tillåtande tillväxttemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Arbetet finansierades med anslag från International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) anslagsnummer, HDI/CRP/012, Research Directorate of the University of Venda, anslag I595, Department of Science and Innovation (DSI) och National Research Foundation (NRF) i Sydafrika (anslagsnummer, 75464 och 92598) som tilldelats AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I.
- Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
