Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

Summary

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Abstract

Dit protocol beschrijft de kenmerken van epidermale groeifactorreceptor (EGFR) van COS7 fibroblastcellen en daaropvolgende correlatieve fluorescentiemicroscopie en milieu scanning elektronenmicroscoop (ESEM) van hele cellen in gehydrateerde toestand. Fluorescent quantum dots (QD) gekoppeld aan EGFR via een tweestaps labeling protocol, een efficiënte en specifieke eiwitmarkerend, maar vermijdt-label geïnduceerde clustering van de receptor. Fluorescentie microscopie ontvangen overzichtsbeeld van de cellulaire locaties van de EGFR. De scanning transmissie elektronenmicroscoop (STEM) detector werd gebruikt voor de QD labels met nanoschaal resolutie detecteren. De resulterende correlatieve beelden te leveren gegevens van de cellulaire EGFR distributie, en de stoichiometrie bij de enkele moleculair niveau in de natuurlijke context van de gehydrateerde intacte cel. ESEM-STEM beelden bleek de receptor aanwezig als monomeer, zoals homodimeer en in kleine clusters. Labelen met twee verschillende QDs,dat wil zeggen, één die uitzendt bij 655 nm en 800 toonden dezelfde karakteristieke resultaten.

Introduction

Een nieuwe aanpak werd onlangs geïntroduceerd, om het gehele cellen met gelabelde eiwitten in vloeibare toestand door middel STEM ^1-3 of correlatieve fluorescentiemicroscopie en STEM ^4-7. Deze methode kan het bestuderen van de ruimtelijke verdeling van membraaneiwitten en eiwitcomplexen inbegrip van hun stoichiometrie op één enkel molecuul in de intacte plasmamembranen van gehele cellen. Hier beschrijven we een protocol waarbij een twee-staps specifieke etikettering van receptoreiwitten met fluorescerende quantum dots (QDs) ^8, en correlatieve licht microscopie en ESEM-STEM. Als voorbeeld hebben we de EGFR, een membraaneiwit dat tot de proteïne kinase superfamilie. Bij ligandbinding, de receptor activeert en vormt een dimeer met een ander geactiveerde EGFR; de daaropvolgende signaal cascade drijft celproliferatie ^9. Mutaties die leiden tot abnormale EGFR expressie of activiteit speelt een centrale rol bij vele soorten kanker ^10. Studying van de ruimtelijke ordening van dit membraan receptor in hele cellen geeft belangrijke informatie context over de functie en eventuele wijzigingen daarvan ^11-14. Het blijft echter moeilijk om de verdeling van EGFR-monomeren, dimeren en clusters sonde direct op een (sub) cellulaire niveau biochemische methoden of conventionele microscopie ^15. Onze methode kan visualiseren EGFR met een ruimtelijke resolutie van enkele nanometers zodanig dat de plaatsen van eiwitten in een complex kan worden bepaald. Het belangrijkste is de verkregen informatie over de stoichiometrische verdeling betreft de natieve toestand van het eiwit in de intacte cel.

Teneinde een korte afstand tussen het label en de receptor te bereiken, werd EGFR rechtstreeks gemerkt door zijn ligand EGF, via een biotine-streptavidine binding met een QD. Dit label kan worden gedetecteerd met zowel fluorescentie- en elektronenmicroscopie. We hebben dit label gebruikt voor correlatieve beeldvorming van COS7 cellen invloeistof ingesloten in een microfluïdische kamer eerder ^1,16,17. Echter, wegens een veelvoud van streptavidinemoleculen per QD Dit label kan receptor clustering induceren, wat leidt tot een lage labelingsefficiëntie of vrij duur experimenten, en het is niet worden geconcludeerd over de stoichiometrie van het eiwit onderzocht. Label geïnduceerde receptor clustering kan geheel worden vermeden door toepassing van de twee-staps procedure labeling hier gepresenteerde resultaat een probe die gebiotinyleerd EGF welke slechts een streptavidine-quantum dot (STR-QD) is gekoppeld. De cellen worden eerst geïncubeerd met gebiotinyleerd EGF, en vervolgens gefixeerd. De fixatiestap bepaalt het tijdstip waarop eiwitten processen gestopt (afhankelijk van de snelheid van fixatie). STR-QD wordt daarna toegepast als tweede stap van de etikettering protocol. Clustering vindt niet plaats omdat de dynamische beweging van de membraan eiwitten gehinderde zodra de eiwitten zijn bevestigd. Bovendien is de STR-QD oplossing die deduurste component van het experiment kan worden toegepast in een geoptimaliseerde lage concentratie en deze tweede etikettering tijd niet-essentieel, dat wil zeggen, kan de QD worden gekoppeld enkele minuten.

Om de stoichiometrie van EGFR studeren als verdeeld in hele cellen, cellulaire monsters werden bereid op silicium microchips ^18. Nadat de twee stappen QD labeling en de registratie van fluorescentiemicroscopie beelden werden de cellen gespoeld met zuiver water, en afgebeeld in gehydrateerde toestand door middel ESEM ^STEM-19. De resulterende correlatieve beelden geven informatie over de cellulaire EGFR distributie, en de stoichiometrie in hun natuurlijke context van gehydrateerde cellen. Een soortgelijke werkwijze werd gebruikt om HER2 eiwitten in borstkankercellen te bestuderen in een recente studie ^7.

Protocol

1. Voorbereiding van de etikettering en Fixatie reagentia Bereid labeling buffer (BSA-GEL-PBS) met behulp geautoclaveerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS). Supplement met 1% BSA (bovine albumine fractie V, biotine gratis) en 0,2% gelatine (GEL, van koud water vis huid) en vortex / goed schudden. Opmerking: Houdbaarheid ~ 5 dagen bij 4 ° C. Bereid wasbuffer (BSA-PBS) vanaf geautoclaveerd fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4. Supplement met 1% BSA en vortex / goed schudden. Opmerking: Houdbaarheid ~ 5 dagen bij 4 ° C. Bereid 50 mM boraatbuffer (BB) van 200 mM boorzuur voorraadoplossing, pH ingesteld op 8,3 met 200 mM natriumtetraboraat. Opmerking: Houdbaarheid ~ 12 maanden bij 4 ° C. Bereid 0,1 M cacodylaatbuffer (CB) van 0,2 M natriumcacodylaat voorraadoplossing, pH aangepast tot 7,4, aangevuld met 0,1 M sucrose. Opmerking: Geopende voorraadoplossing kan worden bewaard ~ 5 dagen bij 4 ° C. Bereid 0,1 M glycine in PBS (GLY-PBS). Opmerking: Houdbaarheid ~ 2 maanden bij 4 ° C. Bereid 3% paraformaldehyde in CB (3% PFA) uit vers gemaakt of geopend flesje van 16% PFA, stock oplossing, EM leerjaar. Opmerking: Geopende voorraadoplossing kan worden bewaard ~ 5 dagen bij 4 ° C. Bereid 2% glutaaraldehyde in CB (2% GA) uit vers gemaakt (of geopend flesje) 25% GA voorraad oplossing, EM leerjaar. Opmerking: Geopende voorraadoplossing kan worden bewaard ~ 5 dagen bij 4 ° C. Bereid 300 nM EGF-biotine merkoplossing Verdunnen 6 uM EGF-biotine voorraad oplossing in BSA-GEL-PBS, gebruik dan een volume van 100-200 pi per microchip. Gebruik binnen een paar uur. Bereid 10 nM STR-QD labeling oplossing Centrifugeer de streptavidine-QD voorraad oplossing voor 4 min bij 8000 xg, neem supernatant en verdund 1:10 in BB. Verschillende soorten QDs kan worden gebruikt, bijvoorbeeld QD655 of QD800. Verdunnen tot de uiteindelijke concentratie in BSA-GEL-PBS, gebruiken 75-100 ul per microchip. Gebruik binneneen paar uur. 2. Voorbereiding van Siliciumnitride Membrane Microchips Reinig een microscoop objectglaasje, zoals gebruikt voor lichtmicroscopie met een schone kamer tissue en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) rang ethanol. In een laminaire luchtstroom werkbank met een laag stof, opent een diameter van 100 mm petrischaal, en leg de schoongemaakte microscoop glas in de schaal; Laat de schaal geopend. Met schone pincet, bij voorkeur bekleed met koolstof vezel of andere deklaag, neemt 4-10 microchips met dunne (50 nm) siliciumnitride membranen achter elkaar, uit hun opbergdoos en op het glaasje. Pak de microchips zachtjes op hun zijde en raak de fragiele bovenzijde, bestaande uit de dunne siliciumnitride membraan. Neem grote zorg om altijd het membraan naar boven en niet aanraken. Opmerking: De microchips moet rechthoekig zijn en vlakke randen loodrecht op hun siliciumnitride gedektgezicht, zodat zij gemakkelijk kunnen worden vastgegrepen. Sluit het deksel van de petrischaal en breng het naar een zuurkast. Een nieuwe cleanroom weefsel en deponeren naast de petrischaal. Bereid twee schone 200 ml glazen bekers vult een met 50-70 ml aceton, en de andere met eenzelfde volume ethanol, beide HPLC kwaliteit. Breng de microchips van het glaasje eerste op de clean room weefsel. Uit het weefsel overdragen microchips een voor een in de eerste beker met aceton voor het verwijderen van de beschermende laklaag. Wacht 2 min, terwijl zachtjes bewegen van het bekerglas enkele malen zodat de microchips goed gespoeld. Breng de microchips direct in de beker met ethanol, zonder dat ze uitdrogen. Wacht 2 min. Overdragen dan de beker naar de laminaire luchtstroom werkbank. Een nieuwe cleanroom weefsel. Breng de chips op het weefsel en laat ze drogen voor een paar minuten. Breng de microchips op het glaasje in de petrischaal, sluit het gerecht,en breng het naar het plasma schoner. Stort het glaasje met de microchips in het plasma schoner. Voer een 5 min reinigingsprogramma het oppervlak van het siliciumnitride membraan hydrofiel te maken. Opmerking: Geschikt instellingen toegepast voor onze plasma schoner zijn: 70 mTorr, gas stroom van 11,5 sccm gedurende O 2 en 35,0 SCCM voor Ar, 50 W vooruit radiofrequentie (RF) doel, 5 W RF-bereik en max. gereflecteerde RF. Zet het glaasje met de microchip terug in de petrischaal, en sluit het deksel. Zorg ervoor dat de microchips steriel te houden vanaf nu. Onderzoek het raam gebieden van de microchips onder een lichtmicroscoop voor mogelijke membraan scheurt of resterende vuildeeltjes. Breng de petrischaal op de laminaire luchtstroom werkbank. Plaats de volgende items in de laminaire luchtstroom workbench: buizen / flessen die gesteriliseerd 0,01% poly-L-lysine-oplossing (. PLL, mol wt 150,000-300,000, steriel gefiltreerd en celkweek getest), HPLCkwaliteit water, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, DMEM zonder serum, een nieuwe cleanroom weefsel, een steriele 24-well plaat (een 12-well plaat kan worden gebruikt), een steriele 96- well plaat, steriele pipet tips, een pipet, en platte, ronde tip, pincet. Neem de 24-well plaat, en goed te vullen een met PLL, en twee putten met HPLC kwaliteit water, gebruik een ong. volume van 1 ml per putje. Neem de 96-well plaat en vul voor elke microchip twee putten met serum aangevuld DMEM en één goed met serumvrij DMEM, gebruik een ong. volume van 200 gl per putje. Vanaf nu gebruik pincet met steriele tips om de microchips te behandelen. Dit te bereiken, bijvoorbeeld door kort vlammen en vervolgens afkoelen van de uiteinden van de pincet. Overdragen eerst de microchips van het glaasje op de clean room weefsel. Uit het weefsel, dragen tot zes microchips in de PLL-gevulde goed, incubeer de microchips gedurende 5 min. Niete: Voor een experiment met meer microchips, vul extra putten in de 24-well plaat. Vervolgens reinigen de microchips door ze één voor één, in de eerste-water gevulde put en van daaruit in de tweede bronwater gevuld. Laat de microchips niet achter in het water langer dan ongeveer een minuut om de verwijdering van PLL voorkomen. Tenslotte plaats ze afzonderlijk in de DMEM-gevulde putjes van de 96-well plaat. Sla de 96-wells plaat in het CO 2-incubator tot de celsuspensie bereid. 3. Voorbereiding van de Cellen op Microchips Voer een subcultuur van COS7 cellen om een ​​celsuspensie te bereiden met een concentratie van ca. 5 x 10 5 cellen / ml. Zorg ervoor dat de cellen mono-gedispergeerd. Neem de 96-wells plaat met microchips en voeg een druppel celsuspensie aan elk microchip. Wacht 5 min. Start om het venster gebieden van de microchips te onderzoeken met een omgekeerde microscoop om choose het juiste moment voor het overbrengen in een nieuwe put met serumvrij DMEM. Opmerking: Een goede dichtheid van cellen wordt bereikt met ongeveer één cel per 2.500 um 2 gebied, overeenkomend met 24 COS7 cellen op een venstergrootte van 150 x 400 urn. Hogere celdichtheden de risico maximale afvlakking van de cellen hinderen. Wees ervan bewust dat na een cel naar beneden is neergedaald op de SIN membraan, die het nodig heeft 3-5 min om voldoende hechting te weerstaan ​​drijvende off tijdens de overdracht naar de nieuwe goed te ontwikkelen. Transfer microchip naar de volgende goed wanneer voldoende cellen hebben gehouden op het raam. Houd de microchips altijd met de cellen naar boven en vermijd het aanraken van deze kant. Na de overdracht, onderzoeken elk microchip venster weer. Als er te veel cellen werden weggewassen en het aantal resterende cellen onvoldoende, opnieuw fijnstampen de celsuspensie (te breken nieuw gevormde cel klonten) en herhaal stappen 3,1-3,5. Wanneer alle overgedragen microchips genoeghechtende cellen op hun raam gebieden, de overdracht van de chips in de laatste goed met serumvrij DMEM. Plaats de 96-well plaat terug in de CO 2 incubator en laat de cellen te herstellen en plat uit voor enkele uren, de beste O / N. 4. EGFR Labeling, Fixatie en fluorescentie microscopie Voor de volgende stappen gebruikt een 96 putjes en een 24-wells plaat. Pre-vullen putten met de respectievelijke oplossingen en gebruik maken van een rij of kolom per microchip. De 24-wells plaat wordt gebruikt onder de zuurkast voor de fixatie stappen met CB, PFA en GA. Overdragen altijd microchips met de cellen naar boven en vermijd het aanraken van deze kant. Spoel microchips door het plaatsen van de chips in een goed met verse BSA-GEL-PBS en plaats 96 putjesplaat in incubator bij 37 ° C gedurende 5 min. Incubeer bij 300 nM EGF-biotine oplossing voor 3 min bij 37 ° C. Omdat de cellen begint endocytose van EGF-gelabelde EGFRs, gaat zo snel mogelijk step 4,4. Spoel 3 maal met PBS en 1 keer met CB (nu 96 well plaat is weer bij RT). Incubeer in 3% PFA gedurende 10 min. Spoel chips 1 keer met CB, en 3 keer met PBS. Incubeer in GLY-PBS gedurende 2 minuten, spoel 2 maal met 1 keer PBS. Incubeer bij 10 nM STR-QD gedurende 10 min. Spoel 4 maal met BSA-PBS. Dompel een microchip in een glazen bodem 35 mm schaal voorgevuld met BSA-PBS bij kamertemperatuur. Verwerven differentieel interferentie contrast (DIC) beelden en fluorescentie beelden van QD-gelabelde cellen. Gebruik een 40X lucht doelstelling overzicht beelden van cellen gelabeld met QD655. Gebruik van een olie-immersie objectief (bijvoorbeeld 63x) de meest efficiënte verzameling van het uitgezonden fluorescentielicht mogelijk maken; Dit is met name nodig wanneer beeldvorming cellen gelabeld met QD800. Gebruik een filter kubus die de QDs fluorescentie excitatie licht tussen 340 en 380 nm bloot, en laat de collectie van uitgestraalde licht boven 420 nm suitabel voor de meeste QDs (Filter kubus A in dit geval). Minimaliseren van de lichtintensiteit te intens licht dat het monster kunnen beschadigen te voorkomen. Stel de belichtingstijd minstens 300 ms, zodat de signalen van QDs worden vastgelegd, merken dat de fluorescentie van QDs een knipperend gedrag. Pas de lichtintensiteit en de versterking om heldere beelden te leveren zonder zichtbare ruis in het beeld, terwijl het minimaliseren van de lichtintensiteit. Let op: U kunt een kortere belichtingstijd gebruikt worden als reeks beelden zijn afkomstig uit dezelfde regio. Deze reeksen kunnen worden bewerkt om een ​​beeld maximum projectie verkregen, waardoor middeling en daarmee geluidsreductie van het resulterende beeld. Plaats de afgebeelde microchip achterkant (cellen naar boven) in een putje van een 96-wells plaat gevuld met BSA-PBS. Spoel microchips 1 keer in CB. Incubeer in 2% GA gedurende 10 min. Spoel 1 keer in CB, en 3 keer met BSA-PBS. Store microchips tot ESEM imaging, in BSA-PBS voorgevulde putjes van een nieuwe 96-well plaat. Voor elke microchip vult een rij van vier putten met HPLC-grade water. Opmerking: De monsters kunnen bij 4 ° C worden bewaard gedurende enkele weken, maar de beste resultaten worden bereikt wanneer de volledige reeks beeldvorming wordt uitgevoerd binnen twee dagen. QDs zal langzaam beginnen los te maken van het monster, is het daarom niet aanbevolen om meer dan 10 dagen wachten voordat het ESEM beeldvorming wordt uitgevoerd. Opmerking: Fluorescentie afbeeldingen worden opgeslagen voor latere analyse. De posities van de cellen in de afbeeldingen kunnen gemakkelijk worden gecorreleerd met elektronenmicroscopie foto lokaliseren via de hoeken van het raam SiN en het meten van de posities ten opzichte van de hoeken. Opmerking: Het is raadzaam om de fluorescentie beelden van hoge kwaliteit af te drukken en te gebruiken ter oriëntatie bij het opnemen van de ESEM beelden. 5. Wet ESEM-STEM van hele cellen Bereid de ESEM voor natte STEM Monteer de gasvormige secundaire elektron detector (GSED) en de Peltier fase met het STEM detector (onder het monster). Start de stroming van koelwater door de fase en de temperatuur tot 3 ° C. Het decor xy-coördinaten op nul en pas de werkafstand tot ongeveer 6 mm. Tijdens de ESEM imaging, houdt de 96-well plaat met de microchips te koelen, bijvoorbeeld op bevroren koelelementen, in een piepschuim doos. Voor het laden van een monster in de voorgekoelde ESEM-bèta fase neemt de 96-well plaat uit de koelbak en plaats deze dicht bij de geopende ESEM fase. Zet een nieuwe cleanroom weefsel ernaast. Snel spoelen van een microchip (met de cellen naar boven) door dompelen vier keer, telkens voor ongeveer een seconde, in een goed gevuld met HPLC-grade water. Blot de achterzijde van het microchip kort op de clean room weefsel en plaats de microchip in de voorgekoelde fase. Zorg ervoor dat de cellen nat blijft, kan ditherkend door een reflecterend oppervlak (drogen resulteert in een saaie oppervlak). Bevochtig het monster oppervlak met 3 pi van gekoelde HPLC-grade water (zorg ervoor dat het oppervlak niet aan te raken met de pipet tip), en bevestig het monster in het podium. Leg drie additionele 3 pi waterdruppels op het podium nabij de sample. Sluit het monster kamer Zuiveren het monster kamer door fietsen de druk vijf keer tussen de 800 en 1500 Pa. Beëindig het fietsen met 800 Pa. Schakel de elektronenbundel (30 kV) en onderzocht op het monster onder de kleinste vergroting beide detectors, dwz de GSED en de STEM detector te zoeken naar de locatie van de microchip venster. Opmerking: Als het water laag te dik is, kan het venster niet zichtbaar. In dit geval, begint de druk te verlagen tot 760 Pa en wacht een paar minuten. Het venster eerste wordt zichtbaar met de GSED. Plaats het SiN membraan venster in het midden van het beeld door de specimensen het podium en het verminderen van de druk tot 750-720 Pa. Let op: Als het water laag is dun genoeg, het venster wordt ook zichtbaar bij de STEM detector. Vanaf nu gebruik maken van de donkere gebied segment van de STEM detector om beelden op te nemen. Eerst verkrijgen één of twee beelden die alle cellen op een totale raamoppervlak. Vergelijk deze ESEM beelden met de lichtmicroscoop beelden, zoekt de hoeken van het venster SiN. Correleren frames van beide modaliteiten microscopie coördineren door vergelijking van de vergroting, rotatie en eventuele spiegelen. Zoek dezelfde cellen in beide beelden. Selecteer zeer kleine vuildeeltjes of een cel regio met kleine elementen imaging instellingen, zoals de eucentrische hoogte, het scherpstellen en de correctie van lens stigmatism passen. Werken bij een vergroting van ten minste 50.000X, gebruik een elektron sonde huidige ongeveer 0,6 nA, een pixel-verblijftijd van 30 microseconden, en een beeldformaat van 1024 x 884 pixels. Opmerking: Andere instellingen kunnen ook be gebruikt zolang een verhoging van het elektron dosis vermeden. Opmerking: Ook bij het werken zeer schoon, de chip oppervlakken zullen in de praktijk altijd een aantal vuildeeltjes bevatten, omdat het protocol niet wordt uitgevoerd in een cleanroom-omgeving. Om STEM beelden op te nemen van de QD-gelabelde cellen, verwijzen naar de fluorescentie beelden en kies een cel van belang. Opmerking: Het is het beste om te beginnen met een cel toont sterke QD signalen. Het opnemen van een STEM overzicht beeld van deze cel. Ga naar een perifeer gebied waar de cel grens is zichtbaar en opnieuw in te 50.000X vergroting bereiken. Beelden opnemen tonen individuele QDs Gebruik pixelverblijftijden van 20-30 psec. Om stralingsschade, afbeelding elke regio te vermijden, slechts één keer met een hoge vergrotingsfactor. Opmerking: Meestal, in deze fase zowel de focus en de correctie van de stigmatism, moeten sommige fijnafstelling. Na het opnemen van een voldoende aantal sterke vergroting beelden, uitzoomen, en ackatern ander beeld STEM overzicht, die de regio's zojuist opgenomen met een hoge vergrotingsfactor zo donker rechthoeken. Opmerking: Deze overzichtsbeeld zullen later dienen om ESEM en fluorescentiebeelden correleren en om de exacte locatie van de sterke vergroting's bepalen binnen de cellulaire context. Gaan naar de volgende cel van belang, te beginnen met een overzicht afbeelding, het opnemen van een serie van hoge vergrotingsfactor afbeeldingen en eindigen met een overzicht afbeelding. Aan het einde van een ESEM opnamesessie, de druk op 850-900 Pa voordat de kamer ventileren. Opmerking: Deze drukverhoging verhoogt de kans op het winnen van het microchip weer een nat oppervlak; Maar dit kan niet altijd worden bereikt. Een monster, dat nooit is gedroogd kan worden hersteld in BSA-PBS en, indien gewenst, opnieuw onderzocht in het ESEM op een later tijdstip.

Representative Results

Figuur 1 en 2 tonen representatieve beelden van QD655 gemerkt, membraangebonden EGFR gevisualiseerd in intacte, volledig gehydrateerd COS-7-cellen. Het beeld DIC in Figuur 1 a geeft een indruk van het membraan topografie van de cellen en de overeenkomstige beeld fluorescentie in Figuur 1b toont de verdeling van EGFR na 3 min van EGF-biotine incubatie. Figuur 1 A en B elk aan elkaar gestikt van twee beelden die zijn opgenomen met een 40x lucht doelstelling. De geactiveerde EGF EGFR wordt verdeeld over het gehele celoppervlak. In de meeste cellen een lichte verhoging van de fluorescentie (figuur 1B) te zien in de cel randen, hetgeen een plaatselijk verhoogde frequentie van EGFR 20. Controle-experimenten uitgevoerd met gebruikmaking van een soortgelijk protocol geverifieerde EGFR specifieke labeling (gegevens niet getoond). Deze controles omvatten: 1) een controle-labeling zonder voorafgaande incubatie van de cells met EGF-biotine, dat wil zeggen, alleen incubatie met STR-QDs, en 2) een incubatie met niet-gebiotinyleerd EGF en STR-QDs. De drie cellen gemarkeerd met rechthoeken werden verder onderzocht met ESEM-STEM. De ESEM STEM-afbeeldingen in Figuur 1C – E tonen lage vergroting overzicht van deze cellen. Deze transmissiebeelden weerspiegelen gehele cellen in gehydrateerde toestand met een dunne laag water verblijvende via cel geplaatst op een silicium chip met siliciumnitride (SiN) kijkvenster. De vacuümkamer in de microscoop bevatte waterdamp en het evenwicht tussen de monstertemperatuur en de druk werd ingesteld op een dun laagje vloeistof over de cellen te handhaven. De afzonderlijke cellen zijn te herkennen op grond van hun vorm en ligging aan het SiN membraan venster. De lage vergroting ESEM-bèta beelden onthullen fijne structuren zoals filopodia, zich vanaf de cel rand naar naburige cellen en een aantal structurenbinnenin de cel dunnere gebieden. Dikke centrale cellulaire regio's, waaronder de kern verschijnen wit omdat de transmissie door het monster is niet mogelijk voor de elektronen van de gebruikte energie (30 keV). ESEM STEM-beelden met een hoge resolutie zijn opgenomen in de dunnere, perifere regio's. De ruimtelijke resolutie van ESEM-bèta van nanodeeltjes in de dunne gebieden van cellen in een dunne vloeistoflaag werd bepaald in een eerdere studie 6 te bedragen 3 nm. Vier hoge-resolutiebeelden figuur 2A – D werden opgenomen ter plaatse van de kleine rechthoeken in figuur 1C – E. De vergroter voldoende individuele QDs, verschijnen als heldere, kogelvormige staven onderscheiden, elk gebonden aan een individu EGFR. De QD655 heeft typische afmeting van 6 x 14 nm 2. Figuur 2A (overeenkomende met het rechthoekige gebied op de cel Figu aangegevenre 1C) toont QD etiketten op een membraan vouw diagonaal oversteken van de afbeelding. Deze membraanstructuur een hogere EGFR dichtheid dan de omringende membraangebieden. Op verschillende locaties, twee labels waren in de nabijheid. Twee voorbeelden met afstanden van 20 en 24 nm zijn aangeduid met pijlpunten. Deze paren labels worden geïnterpreteerd als behorend tot EGFR dimeren. Figuur 2B geeft een voorbeeld van de rand van een cel (figuur 1D, links rechthoek), kan EGFR monomeren en dimeren zoals goed te zien. Figuur 2C (Figuur 1C, rechts rechthoek) werd opgenomen van een gebied met een lagere fluorescentie-signaal, dat wil zeggen, een lagere dichtheid EGFR. Toch werd EGFR hier ook gevonden in dimeren ook. Bovendien twee clusters van 10 of 11 EGFRs aanwezig waren (zie ellipsen). Figuur 2D toont een ander voorbeeld van een membraan vouw (figuur 1E) met kleinere clusters zoals 5-6 EGFRs, naast verschillende monomerenen dimeren. Als voorbeeld van de soort informatie die verkregen kan worden uit deze gegevens, het paar correlatiefunctie 21 g (x) bepaald voor alle label posities in figuur 2. Merk op dat deze analyse niet tot dit protocol en de procedure beschreven elders 6,7. g (x) een maat voor de kans dat een deeltje te vinden binnen een bepaalde radiale afstand x in een referentie deeltje. g (x) = 1 staat voor een willekeurige verdeling, en een grotere waarde bewijs voor clustering. De posities van in totaal 210 labels werden automatisch gedetecteerd in vier beelden van Figuur 2A-D en g (x) werd berekend met een binafmeting van 5 nm en een afvlakfilter met een bandbreedte van 10 nm. The g (x) curve (figuur 3) toont een voorkeursuitvoeringsvorm center-to-center QD afstand van 25 nm. EGFRs zijn dus niet willekeurig georiënteerd, maar een aanzienlijk deel daarvan verblijft in deze voorkeursafstand. Van een approximate moleculair model 6 (figuur 3 inzet) schatten we dat de hart-op-hart afstand tussen de QD en EGF bindingsplaats bedraagt ​​~ 14 nm en hart-op-hart afstand tussen de beide QDs bevestigd aan een EGFR dimeer te worden ~ 27 nm (deze waarde kan variëren van enkele nanometers vanwege de flexibiliteit van de linker). De geprefereerde label afstand is derhalve aan de verwachte label afstand voor de EGFR dimeer binnen de nauwkeurigheid van de methode. The g (x) curve groter dan de eenheid voor afstand van maximaal 300 nm, hetgeen de aanwezigheid van clusters, in overeenstemming met de gegevens. Uit deze analyse blijkt dat de stoichiometrie van de EGFR kunnen worden bestudeerd met onze methode. Figuur 4 een soortgelijk resultaat toont als figuur 2, behalve dat de labeling werd uitgevoerd met EGF-QD800 en een 63x olie-immersie objectief werd gebruikt voor het de fluorescentie. Deze gegevens bevestigen dat deze typische resultaten worden ook gevonden bijde EGFR etikettering wordt gedaan met QDs, die uitzenden in de buurt van rode spectrum. Figuur 4A is de fluorescentie beeld van een representatieve cel, Figuur 4B toont dezelfde cel in ESEM-STEM overzicht modus en een 150.000 x vergroting is opgenomen Figuur 4C is aan het bovenste membraan van de cel (zie rechthoek in figuur 4B). Vergelijkbaar met figuur 2A en D, de beelden vastleggen QD-gelabeld EGFR op een membraan vouw en toont monomere, dimere en geclusterde receptoren. Merk op dat het elektron dichte QD kern lijkt iets kleiner en ronder dan de kernen van QDs uitzendt bij 655 nm, in overeenstemming met hun kleinere kerndiameter van 22 ~ 5 nm. Figuur 1. Correlatieve DIC, fluorescentie en ESEM-STEM van EGF-QD655 gemerkte EGFR tot volledig gehydrateerde COS-7-cellen </strong>. (A) DIC beeld van de cellen gekweekt op het SiN membraan raamoppervlak, die een topografisch beeld van het plasmamembraan. (B) het Fluorescentie toont cellen op het centraal gelegen SiN membraan venster (aangegeven door de gestippelde rechthoek). (C – E) Drie ESEM-STEM lage vergroting beelden van de cellen gemarkeerd met rechthoeken in A en B. Deze cel overzicht beelden dienen om de precieze locatie van de later opgenomen beelden met hoge resolutie te bepalen. De locatie van de vier beelden met hoge resolutie (zie figuur 2A-D) zijn gemarkeerd met witte rechthoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <strong> Figuur 2. Hoge-resolutie ESEM-STEM beelden beeltenis membraangebonden EGFRs. (A) Microfoto bij 75,000X vergroting van het gemarkeerde gebied in figuur 1B. Veel monomeren zichtbaar. Verschillende dimeren zijn aangeduid met pijlpunten. (B) en (C) beelden verkregen bij 50.000 maal vergroting van de linker respectievelijk rechter, membraan gemarkeerde gebieden in figuur 1C. Clusters van EGFR's worden geschetst. (D) beeld opgenomen met 50.000 maal vergroting op de locatie gemarkeerd in figuur 1D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Paar correlatiefunctie g (x) als functie van de radiale afstand x bepaald voor de inter-parti cle afstanden van 210 labels gedetecteerd in Figuur 2A-D. De piek bij 25 nm geeft aan dat een center-to-center QD afstand heeft een veel hogere kans van optreden dan willekeurig, waarbij ag (x) = 1 een toeval. De stippellijn is een gids voor het oog die g (x) van een willekeurige verdeling. De inzet toont een benaderde moleculaire model van de EGFR dimeer met gebonden EGF en streptavidine gecoate QDs bevestigd via biotine. De modellen van streptavidine, EFG en de EGFR werden verkregen uit CPK modellen van de 1stp (streptavidine), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO en 2GS6 (EGFR) structuren in de RCSB Protein Protein Databank, gecreëerd door Jmol Version 12.2.15. De biotine model is zo opgesteld in RCSB Ligand Explorer versie 1.0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. /53186/53186fig4.jpg "/> Figuur 4. Voorbeelden van COS-7 cel gemerkt met EGF-QD800 en afgebeeld met correlatieve fluorescentie en ESEM-STEM. (A) image Fluorescentie, (B) lage vergroting overzichtsbeeld ESEM-STEM. (C) Hoge-resolutie opgenomen ter plaatse van de rechthoek in b op 150,000X vergroting. Monomeer, dimeer, en geclusterde EGFRs zijn vergelijkbaar met de etikettering met EGF-QD655 gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het bestuderen van de ruimtelijke verdeling en de stoichiometrie van de membraaneiwitten, zoals EGFR, in gehele cellen levert belangrijke informatie over de functie context en eventuele wijzigingen daarin ^11-14. Het is een uitdaging om de verdeling van monomeren, dimeren en clusters studie direct op subcellulair niveau met behulp van gangbare biochemische methoden, waarbij informatie verloren over de lokalisatie van het eiwit in de cel of verschillen tussen cellen ^15. De labeling en microscopische methoden hier beschreven kan de visualisatie van eiwitcomplexen op een lengteschaal van enkele nanometers zodat de stoichiometrie kan worden onderzocht in de context van afzonderlijke, intacte cellen ^4-7. Dit is niet mogelijk met (superresolutie) lichtmicroscopie ²³ omdat de resolutie onvoldoende is om moleculen die in een eiwitcomplex onderscheiden. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is een ensemble gemiddelde techniek <sup> 24 en niet noodzakelijkerwijs detecteren dimeren en hogere orde clusters als gevolg van de korte afstand van de energieoverdracht ^25. Proximity ligatie assays ²⁶ eigenlijk niet om afstanden en dus niet kunnen onderscheiden tussen een cellulair gebied met een eiwitrijk dichtheid, onvermijdelijk leidt tot een aantal gedetecteerde nabijheid van toeval, een cellulaire regio met een soortgelijke eiwit dichtheid maar eiwithoudende complexen vertonen verschillende afstanden tussen de labels. De vereiste hoge resolutie aan de bestanddelen van eiwitcomplexen zichtbaar wordt bereikt door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM). Echter, conventionele TEM van gehele cellen beperkt door het vereiste van dunne monsters / secties snijden door het plasmamembraan ²⁷ of plasmamembraan scheuren of verbreken ^28,29 resulteert in willekeurig gevormde stukjes membraan. Het plasmamembraan wordt dus niet afgebeeld als geheel leidt tot een gebrekvan mogelijk cruciale cellulaire context informatie.

Andere experimentele uitdaging voor de studie van proteïne stoichiometrie in cellen ontstaan ​​uit het toegepaste eiwit labeling. Veel gebruikte immunokleuring draagt ​​het probleem dat men op één stoichiometrie tussen receptor en label alleen kan worden bereikt met een monovalent probe; Dit is niet het geval wanneer primaire en secundaire antilichamen vereist. Om informatie over het eiwit stoichiometrie te verkrijgen, is het noodzakelijk dat een probe bindt een uniek epitoop op de receptor en heeft een bindingsplaats voor een fluorescente probe of hoog atoomnummer nanodeeltjes aan de andere kant. Ten tweede wordt de nauwkeurigheid bereikt met antilichaam-labeling beperkt vanwege hun grote omvang ³⁰ om 30 nm, zodat een onderscheid tussen naburige enkele eiwitten homodimeren of grotere clusters niet haalbaar is, althans niet voor receptoren van de EGFR familie. Veel kleinere specifieke labels worden in de literatuur en ca bekendn ook worden toegepast voor intracellulaire etikettering ^31, maar die worden niet vaak gebruikt. De lengte van de gehele label (EGF-biotine-streptavidine-QD) is van dezelfde afmeting als EGFR, en voldoende klein om het dimeer te detecteren. Bovendien is de beschreven twee-staps labeling procedure vermijdt labeling geïnduceerde receptor clustering.

Onze werkwijze is niet moeilijk, niet meer dan fluorescentiemicroscopie van gelabelde eiwitten. Echter, een experiment dient zeer zorgvuldig te worden uitgevoerd, aangezien het aantal stappen en voegt een fout in één van de stappen kunnen leiden tot een volledig falen in het experiment. Omgaan met de microchips is niet meer vervelend dan de afhandeling van TEM roosters, maar een opleiding lege chips wordt aanbevolen. ESEM-STEM van hele gehydrateerde cellen is waarschijnlijk het moeilijkste aspect en vereist tenminste een bekwame bediener en enkele dagen praktijken om een ​​oplossing ongeveer 3 nm bereiken nodig QDs visualiseren. Straling damLeeftijd van de onderzoeken meetobject een risico. De druk en temperatuur moeten zorgvuldig worden bekeken op een waterlaag handhaven. Bovendien kan de dikte van de waterlaag variëren tussen cellen. Het is raadzaam om de aanwezigheid van de waterlaag met de gasvormige elektronendetector boven het monster volgen, zoals elders ⁶ beschreven. Cellulaire regio's moeten slechts een of twee keer worden afgebeeld om schade te voorkomen.

Een belangrijke beperking van de methode is dat hoge-resolutie over de ultrastructuur afwezig. Andere technieken, zoals cryo TEM, nodig om de eiwitstructuur en de cellulaire ultrastructuur ¹⁵ bestuderen. Ten tweede, het bestuderen van de dynamische wisselwerking van een veelvoud van eiwitten in levende cellen in de time-lapse microscoop niet haalbaar vanwege stralingsschade en vereist state-of-the-art lichtmicroscopie ^23. Momenteel is onze werkwijze niet geschikt zijn om de absolute niveau van dimeren aangezien de lAbeling efficiëntie is niet bekend, maar we verwachten dat deze gegevens in de toekomst toe te voegen. Is het toch mogelijk om te vertellen als dimeren aanwezig zijn of niet. Uit de literatuur is bekend, dat zelfs een labelingsefficiëntie ongeveer 15% volstaat om dimeren te detecteren met voldoende statistische significantie ^32.

Het is goed mogelijk andere membraangebonden receptoren te bestuderen via hun ligand, via gebiotinyleerd Fab fragmenten van antilichamen of via andere kleine linkers ⁷ met de beschreven twee-staps labeling protocol. Aangezien we al hebben aangetoond dat twee verschillende kleuren (kleuren) van QDs kan worden gebruikt, en goud nanodeeltjes labeling werd gebruikt in eerder werk ^6, lijkt het mogelijk om meerdere eiwit species label in hetzelfde experiment. De voornaamste uitdaging voor de studie van de stoichiometrie van meervoudige eiwit species is die een vergelijkbare merkingsrendement beide soorten of althans een normalisering van de verkregen relatieve stoichiometrie op respective etikettering efficiëntie. Toch hebben de twee QDs gebruikt in deze studie niet te veel verschillen in merkingsrendement (zie figuren 2 en 4). De beschreven werkwijze met twee stappen labeling met QDs en correlatieve fluorescentiemicroscopie en ESEM-STEM presenteert een levensvatbare methode om de complexe interactie van membraaneiwitten te bestuderen in de intacte plasmamembranen van gehele cellen.

Materials

Inverted fluorescence microscope	Leica	AF6000 + DMI6000B
ESEM	FEI Company	Quanta 400 FEG
Chemicals
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate	Gibco	31966-021
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid	Gibco	14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)	Gibco	16000-036
Cellstripper	Mediatech, Inc.	25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS	Carl Roth	1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)	Carl Roth	O163.2
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041-500G
Glycine	Carl Roth	T873.1
shoul	Molecular Probes	E3477
Sodium teraborate decahydrate	Sigma-Aldrich	S9640-500G
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10173MP
Materials
Silicon microchips with silicon nitride membranes	DENS Solutions	Custom made
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm