相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

Summary

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Abstract

このプロトコルは、COS7線維芽細胞上の上皮成長因子受容体（EGFR）のラベル付けを説明し、その後の相関蛍光顕微鏡および水和状態における全細胞の環境制御型走査電子顕微鏡（ESEM）。蛍光量子ドット（QD）は、受容体の標識誘発性クラスタリングを回避しながら、効率的かつ特異的なタンパク質標識を提供し、二段階標識化プロトコルを介してEGFRに結合させました。蛍光顕微鏡は、EGFRの細胞位置の概観画像を提供しました。走査型透過電子顕微鏡（STEM）検出器は、ナノスケールの分解能でQDのラベルを検出するために使用しました。結果として得られる相関画像は、水和した無傷の細胞の自然な文脈での単一分子レベルでの細胞のEGFR分布、および化学量論のデータを提供します。 ESEM-STEM像は、モノマーとして、ホモ二量体として、そして小さなクラスターに存在するように受容体を明らかにしました。二つの異なる量子ドットを用いた標識、すなわち、一つは655 nmで発光すると800に類似した特性の結果を明らかにしました。

Introduction

新しいアプローチは、STEM ^1-3、または相関蛍光顕微鏡およびSTEM ^4-7を用いて、液体の状態で標識したタンパク質を用いて画像全体の細胞に、最近導入されました。この方法は、全細胞の無傷の原形質膜における単一分子レベルでそれらの化学量論を含む膜タンパク質およびタンパク質複合体の空間分布を研究することが可能です。ここでは、蛍光量子ドット^（QD）8、および相関光顕微鏡およびESEM-STEMと受容体タンパク質の二段階特異的な標識を含むプロトコルを記述します。例として、EGFR、タンパク質キナーゼスーパーファミリーに属する膜タンパク質を研究しました。リガンドが結合すると、受容体が活性化し、その後、別の活性化したEGFRとの二量体を形成し;後続のシグナルカスケードは、細胞増殖^{9を駆動します} 。異常なEGFR発現または活性につながる変異は癌¹⁰の多くの種類の中で中心的な役割を果たしています。 StudyinG全細胞におけるこの膜受容体の空間的配置は、その機能と^11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。しかし、それは直接biochemical-または従来の顕微鏡法¹⁵で（サブ）細胞レベルでのEGFRモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を調べるために困難なまま。我々の方法は、複合体中のタンパク質の位置を決定することができるように、数ナノメートルの空間分解能でのEGFRを可視化することが可能です。最も重要なのは、化学量論的分布に関する得られた情報は、無傷の細胞内タンパク質の天然の状況に関するものです。

ラベルと受容体との間の短い距離を達成するために、EGFRを直接QDにビオチン – ストレプトアビジン結合を用いて、そのリガンドEGFを介して標識しました。このラベルは、蛍光 – および電子顕微鏡の両方を検出することができます。私たちは、COS7細胞の相関イメージングでは、このラベルを使用しています以前^1,16,17マイクロ流体チャンバ内に封入された液体。しかし、QDあたりストレプトアビジン分子の複数のアカウントで、このラベルは、低標識効率というより高価な実験につながる、受容体のクラスター化を誘導することができる、それは調査中のタンパク質の化学量論に結論することはできません。ラベル誘導される受容体のクラスタリングは一つだけのストレプトアビジン量子ドット（STR-QD）が結合されたビオチン化EGFを含むプローブで得られ、ここで提示二段階標識化手順を使用することによって完全に回避することができます。細胞は、まず、ビオチン化EGFと共にインキュベートし、次いで固定されています。固定工程は、タンパク質のプロセスは（固定の速度に依存）が停止された時点を決定します。 STR-QDは、標識プロトコルの2番目のステップで、その後に適用されます。タンパク質が固定されるとタンパク質の動的な膜の動きが阻害されるため、クラスタリングは行われません。である。また、STR-QDソリューション、実験の最も高価な成分は、最適化された低濃度で適用することができ、そして標識のこの第二段階は、時間重要ではない、 すなわち、QDは、数分内に結合することができます。

細胞全体に分布するようにEGFRの化学量論を研究するために、細胞試料は、シリコンマイクロチップ^18上に作製しました。二段階QD標識、および蛍光顕微鏡画像の記録を適用した後、細胞を、純水でリンスし、そしてESEM-STEM ^{19を使用して}水和状態で撮像されました。結果として得られる相関画像は、水和した細胞の彼らの自然な文脈での細胞のEGFR分布、および化学量論に関する情報を提供します。同様の方法は、最近の研究⁷乳癌細胞におけるHER2タンパク質を研究するために使用しました。

Protocol

標識および固定試薬の調製オートクレーブ処理し、リン酸緩衝生理食塩水を用いて標識化緩衝液（BSA-GEL-PBS）、pHが7.4（PBS）を調製します。 1％のBSA（ウシアルブミン画分V、ビ​​オチンを含まない）、および0.2％ゼラチン（GEL、冷水魚皮由来）と渦とのサプリメント/ウェル振ります。 注：4℃で3〜5日間保存することができます。 オートクレーブ処理し、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中の洗浄緩衝液（BSA-PBS）を調製。 1％のBSAおよびボルテックスでサプリメント/よく振って。注：4℃で3〜5日間保存することができます。 200 mMのから50mMのホウ酸緩衝液（BB）ホウ酸原液を調製し、pHを200mMの四ホウ酸ナトリウムで8.3に調整しました。注：4℃〜12ヶ月間保存することができます。 0.2Mのカコジル酸ナトリウム原液、pHを7.4に調整し、0.1 Mショ糖を補っから、0.1Mカコジル酸緩衝液（CB）を準備します。 注：オープンストック溶液を4℃で約5日間保存することができます。 （PBS中にGを、0.1Mグリシンを準備LY-PBS）。 注：4℃で〜2ヶ月間保存することができます。 16％PFAの焼きたてたり開いバイアルからCBの3％パラホルムアルデヒド（3％PFA）、原液、EMグレードを準備します。 注：オープンストック溶液を4℃で約5日間保存することができます。 たて（または開いたバイアル）からCB中の2％グルタルアルデヒド（2％GA）25％のGA原液、EMグレードを準備します。 注：オープンストック溶液を4℃で約5日間保存することができます。 300 nMのEGF-ビオチン標識溶液を準備します BSA-GEL-PBSで6μMのEGF-ビオチン原液を希釈し、マイクロチップあたり100〜200μLの量を使用しています。数時間以内に使用してください。 10 nMのSTR-QD標識溶液を準備します 、8,000×gで4分間、ストレプトアビジン – QD原液を遠心上清を取り、BBで1:10に希釈します。 QDの異なるタイプは、例えば、QD655、QD800又はために、使用することができます。マイクロチップ当たり75〜100μLを使用して、BSA-GEL-PBS中の最終濃度に希釈します。内での使用数時間。 窒化ケイ素膜マイクロチップの作製クリーンルーム組織および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードのエタノールを用いて、光学顕微鏡検査のために使用されるように、顕微鏡用ガラススライドをきれい。 低粉塵レベルの層流ワークベンチでは、直径100mmのペトリ皿を開き、皿にきれいに顕微鏡ガラスを置きます。オープン料理を残します。 優先的に炭素繊維または他のコーティングで被覆された清潔なピンセット、と、その収納ボックスのうち、ガラススライド上に薄い（50 nm）の窒化シリコン膜との4-10マイクロチップ、次々に、取ります。その両側に優しくマイクロチップをつかみ、壊れやすい上側に触れないよう、薄いシリコン窒化膜からなります。常に膜側を上にして維持するために細心の注意を取り、それを触れないでください。 注：マイクロチップは長方形で、それらの窒化シリコンカバーさに垂直な平らなエッジを持っている必要がありますそれらが容易に把持できるように、直面します。 ペトリ皿の蓋を閉め、換気フードにそれを持って来ます。新しいクリーンルーム組織を取得し、ペトリ皿の横にそれを堆積させます。 、エタノールの同様の容量で50-70と1ミリリットルのアセトンを充填し、他のことでHPLCグレードの両方を2きれいな200mlのガラス製ビーカーを準備します。最初のクリーンルーム組織上にスライドガラスからマイクロチップを転送します。 組織、転送マイクロチップ保護レジスト層を除去するためにアセトンで第1のビーカーに一つずつあります。静かにマイクロチップがよくすすぐことを確認するために、ビーカーを数回移動させながら、2分待ってください。 それらが乾燥させることなく、直接エタノールを入れたビーカーにマイクロチップを転送します。 2分待ちます。そして、層流ワークベンチにビーカーを転送します。新しいクリーンルーム組織を取得します。 組織上にチップを移し、数分のためにそれらが乾燥してみましょう。ペトリ皿中のガラススライド上にマイクロチップを移し、皿を閉じ、プラズマクリーナーにそれを持って来ます。 プラズマクリーナーにマイクロチップを用いてガラススライドを堆積させます。窒化シリコン膜の親水性の表面をレンダリングする5分間の洗浄プログラムを実行します。 注意：私たちのプラズマクリーナーに適用される適当な設定は次のとおりです。70トル、O 2 11.5 SCCMとArのための35.0 SCCM、50 W前方の無線周波数（RF）ターゲット、5 WのRF範囲と最大のガスの流れ。 RFを反映しています。 バックペトリ皿にマイクロチップを用いてガラススライドを入れ、その蓋を閉めます。今から滅菌マイクロチップを保つように注意してください。 可能な膜が破裂するか、残りの汚れ粒子のための光学顕微鏡下でマイクロチップのウィンドウ領域を調べます。 層流ワークベンチにペトリ皿を持参してください。 滅菌0.01％ポリ-L-リジン溶液を含むチューブ/ボトル（PLL、モル質量150,000-300,000、滅菌濾過し、そして細胞培養試験を行った。）、HPLC：層流ワークベンチで、以下の項目を配置しますグレードの水、血清を含まない10％ウシ胎児血清、DMEMを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、新たなクリーンルーム組織、無菌の24ウェルプレート（12ウェルプレートを使用することもできる）、無菌96-ウェルプレート、滅菌ピペットチップ、ピペット、およびフラット、丸い先端、ピンセット。 24ウェルプレートを取り、およびPLLとよくものを記入し、HPLCグレードの水で2ウェルは、約使用しています。ウェルあたり1 mlの容量。 96ウェルプレートを取り、すべてのマイクロチップのために、DMEM、無血清DMEMで1つのウェルを補足した血清との2つの井戸を埋める、約使用しています。ウェルあたり200μlの量。 今からマイクロチップを処理するための無菌のヒントを使用ピンセットに。簡単に燃える、その後、ピンセットの先端をクーリングオフすることにより、例えば、これを達成します。 まずクリーンルーム組織上にスライドガラスからマイクロチップを転送します。 組織から、よくPLLに満ちたに最大6つのマイクロチップを転送、5分間のマイクロチップをインキュベートします。 ありませんE：より多くのマイクロチップを用いた実験では、24ウェルプレートに追加の井戸を埋めます。 続いて最初の水で満たされたウェルに、1つずつ、それらを配置することにより、マイクロチップをすすぎ、そこから第2ウェルの水で満たされたに。 PLLの除去を回避するために長く、約分以上水にマイクロチップを放置しないでください。 最後に、96ウェルプレートのDMEMを充填したウェルに個別にそれらを配置します。細胞懸濁液が調製されるまでCO 2インキュベーター中で 96ウェルプレートを保管してください。 マイクロチップ上の細胞の調製およその濃度で細胞懸濁液を調製するためにCOS7細胞の継代培養を行います。 5×10 5細胞/ ml。細胞が単分散であることを確認します。 マイクロチップで96ウェルプレートを取り出し、各マイクロチップに細胞懸濁液の1滴を追加します。 5分待ちます。 町に倒立顕微鏡を用いてマイクロチップのウィンドウ領域を調べるために開始無血清DMEMで新しいウェルにそれを転送するための適切なタイミングOSE。 注意：細胞の良い密度は150×400ミクロンのウィンドウサイズの24 COS7細胞に対応し、2500ミクロン2の面積あたり約1細胞を用いて達成されます。高い細胞密度は、細胞の最大の平坦化を妨害する危険性を有します。細胞はSIN膜上に落ち着いた後、それは新しいウェルに転送中オフ浮動抵抗するのに十分な接着力を開発するために3-5分を必要としていることに注意してください。 十分な細胞が窓に付着した場合に次のウェルにマイクロチップを転送します。上を向い細胞と常にマイクロチップを保持し、こちら側の任意の感動を避けます。 転送後、再び各マイクロチップウィンドウを調べます。あまりにも多くの細胞が洗い流され、残りの細胞の数が不十分な場合は、再磨砕細胞懸濁液（新たに形成された細胞塊を破壊するため）、リピートは3.1から3.5を繰り返します。 すべての転送マイクロチップは十分に持っている場合そのウィンドウ領域に細胞を付着させ、無血清DMEMとの最後のウェルにチップを移す。バックCO 2インキュベーターに96ウェルプレートを置き、細胞を回収し、いくつかの時間、最高のO / Nのために平らにしましょう。 4. EGFRラベル付け、固定し、蛍光顕微鏡以下の手順については、96ウェル、24ウェルプレートを使用しています。それぞれの溶液でウェルを事前に記入し、マイクロチップごとに1行または列を使用します。 24ウェルプレートは、CB、PFAおよびGAで固定ステップのヒュームフードの下で使用されています。常に上を向く細胞とマイクロチップを転送し、こちら側の任意の感動を避けます。 その後、5分間、37℃のインキュベーターに96ウェルプレートを配置し、新鮮なBSA-GEL-PBSでウェル内にマイクロチップを配置することによって、マイクロチップをすすぎます。 37℃で3分間、300 nmのEGF – ビオチン溶液でインキュベートします。細胞は、EGF標識のEGFRのエンドサイトーシスを開始しますので、STEするでき​​るだけ速く進みますP 4.4。 （現在96ウェルプレートをRTで再びです）PBSで3回すすぎ、およびCBで1時間。 10分間、3％PFAでインキュベートします。 チップをCBで1時間、PBSで3回洗浄します。 2分間GLY-PBS中でインキュベートし、1時間PBSで2回すすいでください。 10分間10 nMのSTR-QDでインキュベートします。 BSA-PBSで4回洗浄します。 室温でBSA-PBSで予め充填されたガラスボトム35mmの皿にマイクロチップを沈めます。 微分干渉コントラスト（DIC）画像やQD標識細胞の蛍光画像を取得します。 QD655で標識した細胞の概要​​画像の40倍の空気の目標を使用してください。放出された蛍光光の最も効率的な収集を可能にするために（例えば、63X）油浸対物レンズを使用します。 QD800で標識した細胞を画像化するとき、これは特に必要とされています。 340と380 nmの蛍光励起光に量子ドットを公開し、420 ​​nmのスイ上記放出された光の収集を可能にするフィルターキューブを使用してくださいほとんどの量子ドット（この場合のフィルタキューブA）用のテーブル。 サンプルに損傷を与える可能性があり、あまりにも強い光を避けるために、光強度を最小化します。すべてのQDの信号が捕捉されるように、量子ドットの蛍光が点滅動作を持っていることを指摘し、少なくとも300ミリ秒に露光時間を設定します。 光の強度を調整し、光強度を最小化しながら、可視画像のノイズのない明るい画像を提供するための増幅。 注：画像系列が同じ領域から取得された場合あるいは、より短い露光時間を使用することができます。これらのシリーズは、平均化し、得られた画像のこのようにノイズ低減をもたらす、最大投影画像を生成するために処理することができます。 BSA-PBSで満たされた96ウェルプレートのウェルに戻す（細胞が上を向く）画像化されたマイクロチップを置きます。 CBにマイクロチップを1回洗浄します。 10分間、2％のGAでインキュベートします。 CBで1時間、BSA-PBSで3回洗浄します。 ESEM私まで店舗マイクロチップmagingは、BSA-PBSで新しい96ウェルプレートのウェルに予め充填されました。すべてのマイクロチップのためのHPLCグレードの水で4つのウェルの列を埋めます。 注：サンプルは、数週間、4℃で保持することができる、しかし、完全なイメージングシリーズは2日以内に行われた場合、最良の結果が達成されます。量子ドットは、ゆっくりと、試料から分離するために開始します、したがって、ESEMイメージングが行われる前に10日以上待つことをお勧めしません。 注意：蛍光画像は、将来の分析のために保存されています。画像内の細胞の位置を容易にSiNウィンドウの隅をローカライズし、コーナーに対する相対位置を計測介して、電子顕微鏡画像と相関させることができます。 注：これは、高品質の蛍光画像を印刷し、ESEM画像を記録する際の向きのためにそれらを使用することをお勧めします。 全細胞の5ウェットESEM-STEM 湿ったSTEM用のESEMを準備ガス状の二次電子dをマウントしますetector（GSED）、および（サンプルの下にあります）STEM検出器を含むペルチェステージ。 ステージを冷却水の流れを起動し、3℃に温度を設定。 ステージのxy座標をゼロに設定し、約6 mmの作動距離を調整します。 マイクロチップは、発泡スチロールの箱に、凍結された冷却要素のインスタンスのために、冷却してESEMイメージングの間に、96ウェルプレートを保ちます。 予冷ESEM-STEMのステージにサンプルをロードするために、冷却容器の外に96ウェルプレートを取り、近くにオープンしたESEMステージに配置します。その横に新しいクリーンルーム組織を置きます。 すぐによくHPLCグレードの水で満たされたに、1秒程度、それを4回、各時間浸漬して（上を向く細胞と）マイクロチップをすすぎます。 クリーンルームの組織に簡単にマイクロチップの裏面をブロット及び予冷段階にマイクロチップを配置します。細胞が濡れたままていることを確認し、これをすることができます反射面によって認識（鈍い面で結果を乾燥させます）。 冷却、HPLCグレードの水の3μL（ピペットチップで表面を触らないようにしてください）​​で試料表面を湿らせ、ステージ内のサンプルを修正します。 サンプルに近いステージに3つの追加の3μlの水滴を置きます。 試料室を閉じます 800と1500 Paの間の圧力を5回循環させることにより、試料室をパージします。800 Paのでサイクリングを終了します。 上の電子ビーム（30キロボルト）を切り替えて、マイクロチップウィンドウの位置を検索するための検出器、 すなわち、GSED、およびSTEM検出器の両方で最も低い倍率でサンプルを調べます。 注：水層が厚すぎる場合には、ウィンドウが表示されない場合があります。この場合、760 Paまで圧力を下げ始めると、数分待ってください。ウィンドウが最初GSEDで見えるようになります。 SPECIMを移動させることにより、画像の中心にあるのSiN膜ウィンドウの位置を調整しステージアンと750から720 PAに圧力を減らします。 注：水層が十分に薄い場合、ウィンドウはまた、STEM検出器で見えるようになります。 ここから画像を記録するSTEM検出器の暗視野セグメントを使用しています。まず、完全なウィンドウ領域上のすべてのセルを示す1または2つの画像を取得します。 光学顕微鏡像でこれらのESEM画像を比較し、SiNからウィンドウの隅に移動します。 倍率、回転、および可能なミラーリングを比較することにより、両方の顕微鏡検査様式のフレーム座標相関。両方のイメージで同じ細胞を探します。 このようなユーセントリックの高さ、細かいフォーカスレンズ非点収差の補正などの画像設定を調整するための小さな特徴を持つ非常に小さな汚れ粒子又はセル領域を選択します。少なくとも50.000Xの倍率での作業は、電子プローブ電流の周りに0.6 nAの、30マイクロ秒のピクセル滞留時間、および1024×884ピクセルの画像サイズを使用します。 注：他の設定は、Bもよいですeは限り電子線量の増加が回避されるように使用されます。 注意：非常にきれいな作業場合でもプロトコルはクリーンルーム環境で実行されていないため、チップ表面は、実際には常に、多少の汚れ粒子が含まれています。 QD標識細胞からSTEM像を記録するには、蛍光画像を参照し、目的の細胞を選択します。 注：これは強力なQDの信号を示す細胞で開始するのが最善の方法です。 このセルのSTEMの概要イメージを記録します。 セル境界が表示されている周辺領域に移動し、50.000X倍率に到達するためにズームイン。 個々の量子ドットを示すレコードイメージは、20〜30マイクロ秒の画素滞留時間を使用しています。一度だけ高い倍率での放射線損傷、画像毎に領域を回避するためです。 注：通常、この段階では、両方の、フォーカス、非点収差の補正は、いくつかの微調整が必​​要です。 十分な高倍率画像の数、ズームアウト、および交流の記録した後、帖別のSTEMの概要イメージ、ちょうど暗い長方形のような高倍率で記録された領域を描きました。 注：これらの概観画像は、後のESEMと蛍光画像を相関させ、細胞のコンテキスト内の高倍率画像の正確な位置を決定するのに役立ちます。 、関心の次のセルに進み概観画像で始まる、高倍率の一連の画像を記録し、概観画像で終わります。 ESEM画像化セッションの終了時に、チャンバを通気を開始する前に、850〜900 Paまでの圧力を増加させます。 注：圧力のこの増加は、まだ湿った表面にマイクロチップを回復する機会が向上します。しかし、これは必ずしも達成できません。アウト乾燥されていないサンプルは、後の時点で、ESEMに再調査、必要に応じて、BSA-PBSで復元することができます。

Representative Results

図1及び2は、無傷の 、完全に水和したCOS-7細胞中で可視化QD655標識し、膜に結合したEGFRの代表的な画像を示します。 図1のAでDIC画像は、細胞の膜地形の印象を与え、 図1Bに対応する蛍光画像は、EGFビオチンのインキュベーションの3分後にEGFRの分布を示している。 図1AおよびBは、それぞれ 2から一緒に縫合されています40Xエア目的で記録された画像。 EGFはEGFRの細胞表面全体にわたって分布している活性化されます。ほとんどの細胞では、蛍光のわずかな増強（ 図1B）は、EGFR 20の局所的に増大した発生したことを示す、セル端部で見られます。同様のプロトコルを用いて行った対照実験（データは示されていない）特定のEGFR標識を検証しました。これらのコントロールが含ま：CEの以前のインキュベーションなし1）対照用標識EGF-ビオチンとLLS、 すなわち、STR-QDを持つ唯一のインキュベーション、および非ビオチン化EGFおよびSTR-量子ドットと2）のインキュベーション。 四角形でマークされた三つのセルは、さらに、ESEM-STEMで調査しました。 図1Cに示されているESEM-STEM像- Eは 、これらの細胞の低倍率の概要を示しています。これらの透過画像は、窒化シリコン（SiN）覗き窓を有するシリコンマイクロチップ上に配置されたセルの上に存在する水の薄い層を有する水和状態で全細胞を反映します。顕微鏡の真空チャンバは、水蒸気を含有し、試料温度と圧力との間のバランスは、細胞上の液体の薄層を維持するように調整しました。個々の細胞は、容易にSiN膜ウィンドウにその形状および位置のために認識することができます。低倍率ESEM-STEM像は、糸状仮足、隣接セルに向かってセル端から延びる、およびいくつかの構造などの微細構造を明らかにする薄いセル領域の内側。サンプルを通る伝送が使用されるエネルギー（30keVの）の電子に対しては不可能であるため、核を含む厚い中央の細胞領域が白く見えます。 高解像度のESEM-STEM像が薄く、周辺領域に記録されました。薄い液体層内の細胞の薄い領域中のナノ粒子のESEM-STEM用の空間分解能は、3ナノメートルに達するために、以前の研究6で決定しました。 図2（a）に示す 4つの高解像度画像- Dは図1Cに小さな長方形の位置で記録した- E.を使用倍率は明るく、弾丸形状のロッドに現れる、個々の量子ドットを識別するのに十分であった、個別にバインドされた各EGFR。 QD655は6×14 nmの2の典型的な寸法を有します。 矩形領域に対応する図2Aは、（Figuのセルに表示されています1C RE）膜上のQDラベルが画像を横切る斜め倍を示しています。この膜構造は、周囲の膜の領域よりも高いEGFR密度を有します。いくつかの場所では、2つのラベルが近接にありました。 20および24ナノメートルの距離の2つの例が矢じりで示されています。ラベルのこれらのペアは、EGFR二量体に属するものとして解釈される。 図2Bは 、EGFRの単量体および二量体も同様に見ることができ、細胞（ 図1D、左の長方形）の端から例を示します。 図2C（図1C、右の矩形）低い蛍光信号、 すなわち、下のEGFR密度の領域から記録しました。それにもかかわらず、EGFRも同様に二量体で、ここで発見されました。また、10または11のEGFRの二つのクラスタが存在していた（楕円を参照）。 図2Dは ​​、いくつかの単量体に加えて、5-6のEGFRなどの小さいクラスターを有する膜倍（ 図1E）の他の例を示していますそして、二量体。 このデータから得られる情報の種類の一例として、対相関関数21 G（x）は、図2中のすべてのラベルの位置について決定した。この分析は、このプロトコルの一部ではないことに注意し、手順を説明しました他の場所で6,7。 G（x）は、基準粒子から一定の半径方向の距離xの中に発見される粒子の可能性の尺度です。 G（x）= 1ランダムな分布を示し、大きい値は、クラスタリングの証拠です。 210ラベルの合計の位置が自動的に図2A-Dの4つの画像で検出された、およびg（x）は5nmのビンサイズ及び10nmの帯域幅を有する平滑化フィルタを用いて計算しました。 G（x）の曲線（ 図3）は、25nmの好ましい中心QDの距離を示しています。 EGFRには、このようにランダムに配向していないが、それらの大部分は、この好ましい距離で存在します。 approximatから電子分子モデル6（ 図3挿入図）私たちは、QDおよびEGF結合ポケットの中心間距離は〜14nmであり、EGFRにダイマーに取り付けられた2つの量子ドット間の中心間の距離に達すると推定しています（この値は、リンカーの柔軟性のために、数ナノメートルだけ変化する可能性がある）〜27nmであること。好適なラベル距離は方法の精度内でのEGFR二量体の予想ラベル距離とこのように一致しています。 G（x）の曲線は、データと一致したクラスタの存在を示す、最大300nmの距離を統一よりも大きいです。この分析は、EGFRの化学量論は、提案手法を用いて研究できることを示しています。 図4は 、標識は、EGF-QD800で行い、63X油浸対物レンズは、蛍光画像のために使用したことを除いて、図2と同様の結果を示しています。このデータは、これらの典型的な結果も発見されたときことを確認しますEGFRの標識は近い赤色スペクトルで発光する量子ドットを用いて行われている。 図4（a）は、代表的な細胞の蛍光画像である、 図4Bは、ESEM-STEMの概要モードと図4Cの同じセルが記録15万倍の倍率の画像であることを示していますセルの上位膜の境界で（ 図4Bの四角形を参照）。 図2AおよびDを図のように 、画像は、膜倍にQDで標識されたEGFRをキャプチャして、モノマー、ダイマー、およびクラスタ化された受容体を示しています。 〜5nmの彼らの小さいコアサイズ22と一致し、電子密度の高い量子ドットのコアは655 nmで発光する量子ドットのコアよりもやや小さく、丸く表示されていることに注意してください。 図1.相関DIC、蛍光およびEGF-QD655のESEM-STEMは、完全に水和したCOS-7細胞に、EGFRをラベル </st原形質膜の地形的な印象を与えるのSiN膜のウィンドウ領域上で増殖した細胞の>（A）DIC画像を栄。 （B）（破線の長方形でマーク）中央に位置するのSiN膜ウィンドウ上の細胞を示す蛍光画像。 （C – E）三ESEM-STEM低倍率の画像A、B内の四角形でマークされた細胞から。これらの細胞概観画像が記録され、その後、高解像度画像の正確な位置を決定するのに役立ちます。 （ 図2A-Dに示されている）4つの高解像度画像の位置は、白い長方形のマークが付いています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <stroNG>図2.高解像度ESEM-STEM像は、膜結合のEGFRを描いた。 図1（b）にマークされた領域の75,000Xの倍率で（A）顕微鏡写真。多くのモノマーは、表示されます。いくつかの二量体は矢頭で示しています。 （B）、左の50,000X倍率で取得（C）画像、 図1Cにマークされ、それぞれの権利、膜の領域。 EGFRのクラスタは概説されています。 （D）図1Dにマークされた場所に50,000X倍率で記録した画像は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3対相関関数g（x）の半径方向距離の関数がインターパルティについて決定xと図2A-Dに検出されたすべての210のラベルのCLEの距離は25 nmでのピークは、Ag（x）は1に偶然を示し=なる中心QD距離は、ランダムより発生する非常に高い可能性を有することを示します。破線はラ​​ンダム分布の目表すG（x）のためのガイドです。挿入図は、ビオチンを介して結合した結合されたEGFおよびストレプトアビジンコーティングされた量子ドットとのEGFR二量体のおよその分子モデルを示します。 1stpのCPKモデルから得られたストレプトアビジン、EGFとEGFRのモデル（ストレプトアビジン）、1EGF（EGF）、1NQL、2JWA、1M17、1IVOと2GS6（EGFR）の構造のJmolバージョンで作成されたRCSBプロテインプロテインデータバンク、中12.2.15。 RCSBリガンドExplorerバージョン1.0に描かれたビオチンモデルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 /53186/53186fig4.jpg "/> 図4.代表的なCOS-7細胞は、EGF-QD800で標識し、蛍光相関とESEM-STEMで撮像した。（A）蛍光画像、（B）低倍率の概要ESEM-STEM像。 （C）150,000X倍率でBにおける矩形の位置で記録された高解像度の画像。 、モノマー、ダイマー、およびクラスタのEGFRは、EGF-QD655での標識に似て検出されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

全細胞におけるこのようなEGFRなどの膜タンパク質の空間分布と化学量論を、学ぶこと、その機能と^11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。これは、直接情報がセルまたはセル¹⁵の間の差異におけるタンパク質の局在化について失われるために一般的に使用される生化学的方法を用いて、細胞内レベルでのモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を研究するために挑戦しています。その化学量論は、個々の、無傷細胞^4-7のコンテキスト内で研究することができるように、ここに記載の標識及び顕微鏡検査方法は、数ナノメートルの長さスケールでのタンパク質複合体の可視化を可能にします。その解像度はタンパク質複合体に従事した分子を区別するのに不十分であるため、これは（超解像度）光学顕微鏡²³では不可能です。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、<アンサンブル平均化技術であります> 24 SUP、必ずしもエネルギー移動²⁵の短距離の結果として二量体およびより高次のクラスタを検出しません。近接ライゲーションアッセイ^{26は、実際}の距離を測定しないため、高タンパク質濃度での細胞領域との間を区別することができない、必然的に類似のタンパク質濃度での細胞の領域から、偶然によって検出された近接の数につながるが、タンパク質を含みますかラベルの間に明確な距離を示す複合体。タンパク質複合体の成分を可視化するために必要な高解像度透過型電子顕微鏡（TEM）によって達成されます。しかし、細胞全体の従来のTEMは、原形質膜^27、または形質膜リッピングを通してスライス又は膜のランダムに形成された小片の結果^28,29を切り離す薄いサンプル/セクションの要件によって制限されます。細胞膜は、このように欠如につながる、全体として撮像されていません可能性が極めて重要な細胞のコンテキスト情報。

細胞におけるタンパク質の化学量論の研究のための他の実験的な課題は、印加されるタンパク質標識から生じます。一般的に使用される免疫標識は、受容体と標識との間の一対一の化学量論は、唯一の一価のプローブを用いて達成され得ることが困難に耐えます。これは、一次および二次抗体が必要とされている場合ではありません。タンパク質の化学量論についての情報を得るためには、プローブは、受容体上のエピトープに固有に結合し、蛍光プローブまたは他の側の高原子番号のナノ粒子のための1つの結合部位を有することが要求されます。近隣の単一タンパク質、ホモ二量体、またはより大きなクラスタ間の差別は、少なくともではないEGFRファミリーの受容体について、現実的ではありませんように、第二に、抗体標識で達成可能な精度は、その大きなサイズ^30〜30ナノメートルのアカウントに制限されています。はるかに小さい特定のラベルは、文献およびCAで知られていますnは細胞内標識の³¹に対しても適用されるが、これらは一般的に使用されていません。全ラベル（EGF-ビオチン – ストレプトアビジンQD）の長さは、EGFRと同様の寸法のものであり、二量体を検出することができるように十分に小さいです。また、記載される二段階標識手順は、標識誘導される受容体のクラスタリングを回避します。

我々の方法は、標識されたタンパク質の蛍光顕微鏡よりもはるかに多く、非常に困難ではないではありません。ステップ数が合算とのいずれかの手順に誤りが実験で完全な故障につながる可能性があるのでしかし、実験では、細心の注意を払って行う必要があります。マイクロチップの取り扱いをお勧めしますTEMグリッドが、いくつかの訓練の空のチップの取り扱いよりも面倒ではありません。全体の水和細胞のESEM-STEMは、おそらく最も困難な側面であり、量子ドットを視覚化するために、必要に応じて3ナノメートルの周りの解像度に到達するために、少なくとも熟練したオペレータと実践の数日を必要とします。放射線ダム調査対象の試料の年齢はリスクを提示します。圧力及び温度は、慎重に水層を維持するために監視されるべきです。また、水の層の厚さは、セル間で変化してもよいです。他の場所で⁶記載のように、試料上の気体電子検出器を用いて水層の存在を監視することが望ましいです。細胞領域のみが損傷を避けるために一度か二度画像化されるべきです。

この方法の主要な制限は、超微細構造に関する高解像度情報が存在しないことです。他の技術は、例えば、クライオTEMのために、タンパク質の構造、および細胞の超微細構造^{15を研究するために}必要とされます。第二に、タイムラプス顕微鏡で生細胞内のタンパク質の複数の動的相互作用を研究することは、放射線損傷のアカウントでは不可能である、と最先端の光学顕微鏡^{23を必要とします} 。現在、私たちの方法は、L以来、二量体の絶対的なレベルを決定することはできませんabeling効率は不明であるが、我々は将来的にこのようなデータを追加する予定です。これは、二量体が存在しているかどう伝えるためにもかかわらず可能です。文献からは15％程度であっても標識効率は十分な統計的有意性³²との二量体を検出するのに十分であることが知られています。

これは、特異的抗体のビオチニル化Fab断片を介して、それらのリガンドを介して他の膜結合型受容体を研究するために容易に可能であるか、または記載される二段階標識化プロトコルを使用して、他の小さなリンカーを介して^、7。すでにQDの2つの異なる色（サイズ）を使用することができ、金ナノ粒子標識前^ワーク 6に使用したことが実証されているので、同じ実験内の複数のタンパク質種を標識することが可能と思われます。複数のタンパク質種の化学量論の研究のための重要な課題は、尊敬に得られる相対的化学量論の正規化の両種または少なくとも類似の標識効率を確保していますラベリング効率をアイブ。しかし、この研究で使用される2つの異なるQDは、（ 図2および図4を参照）標識効率に大差がないようです。量子ドットとの二段階標識、および蛍光相関顕微鏡およびESEM-STEMを含む記載された方法は、全細胞の無傷の原形質膜に膜タンパク質の複雑な相互作用を研究するための実行可能な方法を提供します。

Materials

Inverted fluorescence microscope	Leica	AF6000 + DMI6000B
ESEM	FEI Company	Quanta 400 FEG
Chemicals
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate	Gibco	31966-021
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid	Gibco	14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)	Gibco	16000-036
Cellstripper	Mediatech, Inc.	25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS	Carl Roth	1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)	Carl Roth	O163.2
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041-500G
Glycine	Carl Roth	T873.1
shoul	Molecular Probes	E3477
Sodium teraborate decahydrate	Sigma-Aldrich	S9640-500G
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10173MP
Materials
Silicon microchips with silicon nitride membranes	DENS Solutions	Custom made
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm