Изучение стехиометрии рецептор эпидермального фактора роста в интактных клетках, используя КОРРЕЛЯЦИОННЫМ микроскопия

Summary

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Abstract

Этот протокол описывает маркировку рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) на клетках COS-7 фибробластов и последующей корреляционной флуоресцентной микроскопии и окружающей сканирующей электронной микроскопии (ESEM) целых клеток в гидратированном состоянии. Флуоресцентные квантовые точки (КТ) были соединены с EGFR с помощью протокола маркировки двухступенчатого, обеспечивая эффективную и специфическую маркировку белка, избегая при этом метки, вызванной кластеризации рецептора. Флуоресцентная микроскопия при условии, обзорные изображения клеточных местах в EGFR. Электрон передачи сканирующей микроскопии (STEM) детектор для обнаружения метки QD с наноразмерной резолюции. Полученные корреляционные данные изображения обеспечивают клеточного распределения EGFR, и стехиометрии в одном молекулярном уровне в естественном контексте гидратированного интактных клетках. ESEM-STEM изображения показали рецептор присутствовать в качестве мономера, а гомодимера, и в небольших кластеров. Маркировка с двумя различными КТ,т.е., один излучающий на 655 нм и при 800 показали аналогичные результаты, характерные.

Introduction

Новый подход был введен недавно, в изображения целых клеток с мечеными белками жидком состоянии с помощью стволовых ^1-3, или корреляционный флуоресцентной микроскопии и STEM ^4-7. Эта методика может изучать пространственное распределение мембранных белков и белковых комплексов, включая их стехиометрии на уровне одной молекулы в интактных плазматических мембран целых клеток. Здесь мы опишем протокол участием двухэтапный конкретную маркировку рецепторных белков с люминесцентными квантовых точек ^(КТ) 8, и корреляционная световой микроскопии и ESEM-STEM. В качестве примера, мы изучали EGFR, мембранный белок, который принадлежит к протеинкиназы надсемейства. После связывания лиганда, рецептор активируется и затем формирует димер с другим активированным EGFR; последующее каскад сигналов приводит в клеточную пролиферацию ^9. Мутации, приводящие к аномальной экспрессией EGFR или деятельности играют центральную роль во многих видов рака ^10. Учусь вг пространственное расположение этого мембранного рецептора в целых клетках дает важную информацию о контекстное его функции и возможных изменений их ^11-14. Но он по-прежнему сложной, чтобы исследовать распределение EGFR мономеров, димеров и кластеров непосредственно на (под) клеточном уровне с biochemical- или традиционными методами микроскопии ^15. Наш метод способен визуализировать EGFRs с пространственным разрешением в несколько нанометров, что таких мест белков в комплексе может быть определена. Наиболее важно, что полученная информация о распределении стехиометрического относится к ситуации родной белка в интактной клетке.

Для достижения короткое расстояние между этикеткой и рецептором, EGFR непосредственно помечены с помощью его лиганда EGF, используя биотин-стрептавидин св зь с КТ. Эта метка может быть обнаружена как с флуоресценции, и электронной микроскопии. Мы использовали этот ярлык для корреляционного визуализации клеток в COS7жидкость заключена в камеру микрожидкостных ранее ^1,16,17. Тем не менее, из-за кратного стрептавидином молекул на QD, эта метка может вызвать рецептора кластеризации, что приводит к низкой эффективности мечения или, скорее дорогих экспериментов, а это невозможно сделать вывод о стехиометрии белка исследуемого. Этикетка индуцированной кластеризации рецептора можно избежать вовсе, используя процедуру маркировки двухступенчатый представленные здесь, в результате чего зонд, содержащий биотинилированный EGF в которых только один стрептавидин-квантовых точек (КТ СТР-) соединен. Клетки инкубируют с биотинилированным EGF, а затем фиксируется. Стадию фиксации определяет временную точку, в которой белок процессы останавливаются (в зависимости от скорости записи). СТР-КТ применяется в дальнейшем по мере второй стадии протокола маркировки. Кластеризация не происходит, так как динамическое движение мембраны из белков затруднено, как только белки являются фиксированными. Кроме того, решение СТР-КТ, которая являетсясамым дорогим компонентом эксперимента, могут быть применены в оптимизированном низкой концентрации, и этот второй этап маркировки не важно времени, т.е. КТ могут быть соединены в течение нескольких минут.

Для изучения стехиометрии EGFR, как распределены в целых клетках, сотовая образцы были готовы на кремниевых микрочипов ^18. После применения двухэтапного QD маркировку, и запись флуоресцентной микроскопии изображений, клетки были промыты чистой водой, и отображается в гидратированном состоянии с помощью ESEM-STEM ^19. Полученные корреляционные изображения предоставляют информацию о клеточном распределении EGFR и стехиометрии в их естественном контексте гидратированных клеток. Аналогичный метод был использован для изучения HER2 белков в клетках рака молочной железы в недавнем исследовании ^7.

Protocol

1. Подготовка маркировки и фиксации Реагенты Подготовка маркировки буфер (BSA-GEL-PBS) с использованием автоклавного фосфатном буферном растворе, рН 7,4 (PBS). Дополнение 1% BSA (бычий альбумин фракции V, биотин-бесплатно) и 0,2% желатина (гель, от холодной воды рыбьей кожи) и вихря / взболтать. Примечание: Можно хранить в течение ~ 5 дней при температуре 4 ° С. Приготовьте промывочный буфер (PBS-BSA) из автоклавного фосфатно-солевом буфере, рН 7,4. Дополнение 1% BSA и вихря / взболтать. Примечание: Можно хранить в течение ~ 5 дней при температуре 4 ° С. Подготовка 50 мМ боратного буфера (BB) от 200 мМ исходного раствора борной кислоты, рН до 8,3 с 200 мМ тетраборат натрия. Примечание: Можно хранить в течение ~ 12 месяцев при 4 ° С. Готовят 0,1 М какодилате буфер (CB) от 0,2 растворе какодилата фондовой М натрий, рН доводили до 7,4, с добавлением 0,1 М сахарозы. Примечание: Открытый исходный раствор можно хранить в течение ~ 5 дней при температуре 4 ° С. Подготовка 0,1 М глицин в PBS (GLY-PBS). Примечание: Можно хранить в течение ~ 2 месяцев при 4 ° С. Подготовьте 3% параформальдегида в ЦБ (3%) из PFA свежеприготовленные или вскрытия флакона 16% PFA, раствора, ЭМ класса. Примечание: Открытый исходный раствор можно хранить в течение ~ 5 дней при температуре 4 ° С. Подготовьте 2% глутарового альдегида в ЦБ (2% Г.А.) от свежеприготовленные (или открыл флакон) 25% раствор А., Е. М. класс. Примечание: Открытый исходный раствор можно хранить в течение ~ 5 дней при температуре 4 ° С. Подготовьте 300 нМ EGF-биотин решение маркировки Развести 6 мкм EGF-биотин маточный раствор в BSA-GEL-PBS, использовать объем 100-200 мкл на микрочипе. Использовать в течение нескольких часов. Подготовьте 10 нМ STR-QD маркировки решение Центрифуга стрептавидин-QD маточного раствора в течение 4 мин при 8000 мкг, принять супернатант и разбавить 1:10 в ВВ. Различные типы КТ можно использовать, например, QD655 или QD800. Разбавить до конечной концентрации БСА в-гель-PBS, использовать 75-100 мкл на микрочипе. Использовать в течениенесколько часов. 2. Подготовка нитрида кремния мембранных Микросхемы Очистить микроскопом предметное стекло, используемое для световой микроскопии, с чистой комнатной ткани и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Оценка этанола. В ламинарного потока воздуха верстак с низким уровнем пыли, открыть 100 мм диаметр чашки Петри, и лежал очищенный микроскопа стекло в чашке; оставить блюдо открытым. С чистыми пинцет, преимущественно покрытых углеродного волокна или другого покрытия, принимают 4-10 микросхем с тонкими (50 нм) из нитрида кремния мембран, один за другим, из их ящик для хранения и на стекле. Захватите микрочипов мягко по бокам и не касаясь хрупкой верхней стороне, состоящий из тонкой мембраны из нитрида кремния. Возьмите большую заботу, чтобы всегда держать мембрана стороной вверх и не прикасайтесь к ним. Примечание: микрочипы должны быть прямоугольной формы и имеют плоские края перпендикулярно их нитрида кремния покрыталицу, так что они могут быть легко сжал. Закройте крышку чашки Петри и довести его до вытяжкой. Получить новый чистый номера ткань и поместить его рядом с Петри. Приготовьте две чистые 200 мл стеклянные стаканы, заполнив один с 50-70 мл ацетона, а другой с аналогичным объемом этанола, и с помощью ВЭЖХ. Перевести микрочипов из стекло сначала на чистом помещении ткани. Из ткани, передавать Микросхемы один за другим в первом химическом стакане в ацетоне для удаления защитного слоя противостоять. Подождите 2 минуты, в то время как аккуратно движется в стакан несколько раз, чтобы гарантировать, что микрочипы хорошо промыты. Перевести микрочипов непосредственно в стакан с этанолом, не давая им высыхать. Подождите 2 минуты. Затем перенесите стакан с ламинарный поток верстаке. Получить новый чистый номера ткань. Перевести фишки на ткани и дайте им высохнуть в течение нескольких минут. Перевести микрочипов на стекло в чашку Петри, закройте блюдо,и довести его до пылесоса плазмы. Депозит в стекло с микрочипов в пылесос плазмы. Запустите программу очистки 5 мин, чтобы сделать поверхность нитрида кремния мембраны гидрофильные. Примечание: Подходящие настройки, применяемые для нашего уборщика плазмы являются: 70 мТорр, расход газа на 11,5 SCCM для O 2 и 35,0 SCCM для Ar, 50 Вт вперед радиочастотной (РЧ) цели, 5 Вт Диапазон РФ и макс. отражение РФ. Поставьте стекло с микрочипа обратно в чашку Петри, и закройте его крышкой. Позаботьтесь, чтобы сохранить микрочипов стерильной теперь. Исследуйте окно области микрочипов под световым микроскопом для возможных разрывов мембран или оставшихся частиц грязи. Принесите Петри в ламинарный поток верстаке. Поместите следующие элементы ламинарный поток верстак: трубы / бутылки, содержащие стерилизовать 0,01% поли-L-лизин решение (. PLL, мол мас 150,000-300,000, стерильно фильтруют и культура клеток испытания), ВЭЖХводу, содержащую, Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, DMEM без сыворотки, новый чистой комнате ткани, стерильной 24-луночного планшета (12-луночный планшет также может быть использован), стерильный 96- плита хорошо, стерильные наконечники пипетки, пипетки, и плоские, округлые наконечник, пинцет. Возьмите пластину 24-а, и заполнить один хорошо PLL, и две скважины с ВЭЖХ воды, использовать прибл. объеме 1 мл на лунку. Возьмите 96-луночного планшета и заполнить для каждого микрочипа две скважины с сывороткой дополненные DMEM, и один хорошо сыворотки DMEM, использовать прибл. Объем 200 мкл на лунку. Отныне использование пинцета стерильными наконечниками для обработки микрочипов. Добиться этого, например, кратко пылающий, а затем охлаждения кончики пинцета. Первая передача микрочипов из стекло на чистую комнатной ткани. Из ткани, передать до шести микросхем в ФАПЧ заполненные, инкубировать микрочипов в течение 5 мин. Нее: Для эксперимента с более микрочипов, заполните дополнительных скважин в пластине 24-а. Впоследствии промыть микрочипов, помещая их один за одним, в первую заполненный водой хорошо, а оттуда во вторую водоналивные хорошо. Не оставляйте микрочипов в воде дольше, чем примерно через минуту, чтобы избежать удаления PLL. Наконец поместите их по отдельности в DMEM, заполненных лунки 96-луночного планшета. Хранить 96-луночный планшет в инкубаторе СО2 до тех пор, пока суспензию клеток готовят. 3. Подготовка клеток на микрочипах Выполнение субкультуру клеток COS-7, чтобы подготовить клеточную суспензию с концентрацией прибл. 5 × 10 5 клеток / мл. Убедитесь, что клетки моно-разошлись. Возьмем 96-луночного планшета с микрочипами и добавить, одну каплю суспензии клеток в каждую микрочипа. Подождите 5 мин. Начните изучать оконные области микрочипов с помощью инвертированного микроскопа, чтобы чоOSE в нужный момент для передачи его в новой скважины без сыворотки DMEM. Примечание: Хорошая плотность клеток достигается с приблизительно одной ячейки в 2500 мкм 2 области, соответствующие 24 COS-7 клеток на размер окна 150 х 400 мкм. Более высокая плотность клеток имеют риск помешать максимальный уплощение клеток. Помните, что после того, как клетка поселился на SIN мембраны, она нуждается в 3-5 мин, чтобы развить достаточно адгезию к сопротивлению плавающей во время передачи в новой скважины. Передача микрочип в следующую лунку при достаточных клетки наклеена на окно. Держите микрочипы всегда с клетками вверх и избежать прикосновения этой стороны. После передачи, изучить каждое окно микрочип снова. Если слишком много клетки смывают, а оставшееся количество клеток недостаточно, повторно растирают клеточной суспензии (разбить вновь образованные скопления клеток) и повторить шаги 3.1-3.5. Когда все переданные микрочипы хватаетпридерживаясь клеток на их областях окна, передать фишки в последний скважины с бессывороточной DMEM. Поместите 96-луночного планшета обратно в СО 2 инкубатора и пусть клетки восстановить и выровнять в течение нескольких часов, лучший O / N. 4. Маркировка EGFR, фиксация и флуоресцентной микроскопии Для следующих этапов, использовать 96-луночного и 24-луночный планшет. Предварительно заполните скважин с соответствующими решениями, и использовать одну строку или столбец за микрочипа. Хорошо пластина 24- используется под вытяжкой для фиксации этапов с CB, PFA и GA. Всегда передавать микрочипы с клетками, с которыми сталкиваются и избежать прикосновения этой стороны. Промыть микрочипы путем размещения микрочипов в скважине со свежим BSA-PBS Гель-, затем поместить 96-луночный планшет в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Инкубируют 300 нМ EGF-биотин раствор в течение 3 мин при 37 ° С. Поскольку клетки начнут эндоцитоз ЭФР-меченых EGFRs, действуйте быстро, как это возможно, чтобы Steр 4.4. Промыть 3 раза ЗФР, и 1 раз с СВ (в настоящее время 96-луночный планшет снова при комнатной температуре). Инкубируют в 3% PFA в течение 10 мин. Промыть чипы 1 раз с ЦБ, и 3 раза PBS. Инкубируют в Gly-PBS в течение 2 мин, промыть 2 раза 1 раз PBS. Инкубируют в 10 нМ STR-QD в течение 10 мин. Промыть 4 раза BSA-PBS. Погрузитесь микрочип в стеклянным дном 35 мм блюдо предварительно наполненной BSA-PBS при комнатной температуре. Приобретать дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений и флуоресцентные изображения QD-меченых клеток. Используйте воздуха цель 40X для обзорных изображений клеток, меченных QD655. Используйте масло погружения цели (например, 63x), чтобы наиболее эффективный сбор испускаемого света флуоресценции; Это особенно необходимо при визуализации клеток, меченных QD800. Используйте куб фильтра, который предоставляет КТ в свете возбуждения флуоресценции между 340 и 380 нм, и позволяет сбор испускаемого света выше 420 нм Suiстол для большинства КТ (Фильтр кубик в этом случае). Минимизировать интенсивность света, чтобы избежать слишком интенсивный свет, что может привести к повреждению образца. Установите время экспозиции, по крайней мере 300 мс, так что сигналы всех КТ будут захвачены, отметив, что флуоресценция квантовых точек с мигающим поведение. Отрегулируйте интенсивность света, и усиление, чтобы обеспечить яркие изображения без видимого шума изображения, в то время как свести к минимуму интенсивность света. Примечание: В качестве альтернативы, короче время экспозиции может быть использована, если серия изображений взяты из той же области. Эти ряды могут быть обработаны с получением максимальной проекции изображения, что приводит к усреднения и, таким образом уменьшение шума в результирующем изображении. Поместите отображаемого микрочип назад (клетки вверх) в лунку 96-луночного планшета, заполненной BSA-PBS. Промыть Микросхемы 1 раз в ЦБ. Инкубируют в 2% GA в течение 10 мин. Промыть 1 раз в ЦБ, и в 3 раза с BSA-PBS. Храните микрочипы до ESEM Imaging, в BSA-PBS предварительно заполненный скважин нового 96-луночного планшета. Для каждого микрочипа заполнить ряд из четырех скважин с ВЭЖХ-класса воды. Примечание: Образцы можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель, однако, наилучшие результаты достигаются, когда полная серия изображений выполняется в течение двух дней. КТ медленно начинают отделяться от образца, поэтому оно не рекомендуется ждать более 10 дней, прежде чем изображения ESEM делается. Примечание: Флуоресцентные изображения сохраняются для последующего анализа. Позиции клеток в изображениях можно легко соотносится с электронно-микроскопических изображений с помощью локализации углы окна SiN и измерения позиции по отношению к углам. Примечание: Желательно, чтобы напечатать флуоресцентные изображения высокого качества и использовать их для целей ориентации при записи изображения Esem. 5. Влажные ESEM-STEM целых клеток Подготовка Esem для влажной STEM Установите газообразного вторичного электронного Detector (GSED), и стадия Пельтье, содержащий детектор шток (расположен под образца). Начало поток охлаждающей воды через стадию, и установить температуру на 3 ° C. Установите этап ху координаты к нулю, и отрегулируйте рабочее расстояние приблизительно 6 мм. Во время визуализации ESEM, держать 96-луночного планшета с микрочипы остыть, например, на замороженных охлаждающих элементов, в пенополистирола коробки. Для загрузки образца в предварительно охлажденной стадии ESEM-STEM, взять 96-луночного планшета из контейнера охлаждения и поместите его рядом с открытой сцене ESEM. Положите новую чистую комнату ткани рядом с ним. Быстро промыть микрочип (с клетками вверх) путем погружения его в четыре раза, каждый раз примерно на одну секунду, в колодец наполненный ВЭЖХ-класса воды. Пятно заднюю микрочипа кратко на чистой ткани комнатной и поместите микрочип в предварительно охлажденной стадии. Убедитесь, что клетки остаются влажными, это может бытьпризнан отражающей поверхности (сушки результатов в скучной поверхности). Смочите поверхность образца с 3 мкл охлажденного ВЭЖХ-класса воды (убедитесь, что не прикасаться к поверхности кончиком пипетки), и зафиксировать образец в сцене. Поместите три дополнительных капель 3 мкл воды на стадии, близкой к образцу. Закройте образца камеру Выпустите образца камеру на велосипеде давление в пять раз между 800 и 1500 Па. Конец велосипеде с 800 Па. Переключатель электронного пучка (30 кВ) и рассмотрим то образец под низкой увеличении с обоих детекторов, т.е. GSED и детектора STEM искать расположения окна микрочип. Примечание: Если слой воды слишком толстая, то окно может быть не видна. В этом случае, начать снижение давления до 760 Па и ждать несколько минут. Окно впервые становится видна с GSED. Расположите мембранный окно грех в центре изображения, перемещая specimан сцене и уменьшить давление на 750-720 Па. Примечание: Когда водный слой достаточно тонок, то окно также становится видимым с детектором STEM. Отныне использовать темную сегмент поля детектора STEM записывать изображения. Во-первых, приобрести один или два изображения, показывающие все клетки на всю площадь окна. Сравните эти изображения Esem с световой микроскопии изображений, найдите углы окна грех. Корреляция рамках обеих модальностей микроскопии координат путем сравнения увеличения, поворот и зеркальное возможное. Расположить те же клетки на обоих изображениях. Выберите очень маленькие частицы грязи или региона клеток с мелкими чертами, чтобы настроить параметры визуализации, такие как eucentric высоте, тонкой фокусировки и коррекции объектива честолюбия. Работа на увеличении, по крайней мере 50.000X, используйте ток электронно-зондового около 0,6 нА, с точностью до пиксела задержки времени 30 мкс, и размер изображения 1024 х 884 пикселей. Примечание: Другие параметры могут также бе использован при условии, что на электронном дозы можно избежать. Примечание: Даже при работе очень чистый, поверхности чипа будет на практике всегда содержат некоторые частицы грязи, потому что протокол не выполняется в чистой окружающей среде комнаты. Для записи STEM изображения с КТ-меченых клеток, относятся к флуоресценции изображений и выберите ячейку интерес. Примечание: Лучше всего начать с ячейки, показывая сильные сигналы QD. Запишите обзор STEM изображения этой ячейки. Перейти к периферийной области, где границы ячейки видна и увеличить, чтобы достичь 50.000X увеличения. Запись изображения, показывающие отдельные КТ, использовать пиксельные раз останавливаться на 20-30 мкс. Для того, чтобы избежать радиационного повреждения, изображения каждый регион только один раз с большим увеличением. Примечание: Как правило, на этом этапе как, фокус и коррекции честолюбия, нужна тонкую регулировку. После записи в достаточном количестве большом увеличении изображения, зум-выход, и переменного токадесть другой обзор STEM изображения, изображая регионы просто записанные с высоким увеличением, как темные прямоугольники. Примечание: Эти изображения Обзор позже служить соотнести Esem и флуоресцентные изображения и определения точного местоположения из изображений с высоким увеличений в сотовой связи. Перейдите к следующей ячейке интересов, начать с обзорной изображения, записывать серию изображений с большим увеличением, а в конце обзорной изображения. В конце сессии формирования изображения ESEM, увеличить давление на 850-900 Па перед началом, чтобы выразить камеру. Примечание: Это увеличение давления повышает шанс восстановления микрочипа с еще влажной поверхности; Однако, это может не всегда быть достигнуто. Образец, который никогда не высохла могут быть восстановлены в BSA-PBS, и, при желании, исследована заново в ESEM в более поздний момент времени.

Representative Results

На фиг.1 и 2 показан представительные изображения QD655 маркированный мембраной EGFR визуализированы в интактных, полностью гидратированные COS-7 клеток. ОПК изображения На фиг.1 дает впечатление мембранного топографии клеток, и соответствующий флуоресценции изображения на фиг.1b изображает распределение EGFR через 3 мин ЭФР-биотин инкубации. Фиг.1А и В каждый сшиты вместе с двух Изображения, записанные с воздуха цели 40Х. ЭФР активирована EGFR распределяется по всей клеточной поверхности. В большинстве клеток небольшое усиление флуоресценции (Фиг.1В) можно увидеть на клеточных краев, что указывает на повышенную локально возникновение EGFR 20. Контрольные эксперименты, проведенные с использованием протокола проверяется подобное конкретное EGFR маркировки (данные не показаны). Эти элементы управления включены: 1) контроль маркировки без предварительного инкубирования CEзаполняет с EGF-биотин, т.е. только инкубации с STR-КТ, и 2) инкубации с небиотинилированного EGF и STR-КТ. Три ячейки, помеченные прямоугольниками были исследованы с еще ESEM-STEM. В ESEM-STEM изображения, изображенные на рисунке 1С – Е показать низкой кратности обзоры этих клеток. Эти изображения отражают передачи целых клеток в гидратированном состоянии с тонким слоем воды, проживающих по ячейке размещается на кремниевой микросхемы с нитрида кремния (SIN) смотровое окно. Вакуумная камера в микроскоп, содержащиеся паров воды, а баланс между температурой образца и давление доводили поддерживать тонкий слой жидкости над клетками. Отдельные клетки могут быть легко узнаваемы из-за их формы и расположения в окне мембраны грех. В низкий увеличивающим ESEM-STEM изображения показывают тонкие структуры, такие как филоподий, простирающейся от края ячейки к соседним клеткам, и некоторые структурывнутри тонких областях клеток. Толстые центральные сотовые регионов, включая ядро ​​появляются белые, потому что передача через образец не представляется возможным для электронов используемого энергии (30 кэВ). Высокое разрешение ESEM-STEM изображения были записаны в более тонких, периферийными регионами. Пространственное разрешение для ESEM-STEM наночастиц в тонких областях клеток в тонким слоем жидкости определяется в предыдущем исследовании 6 составит до 3 нм. Четыре изображения с высоким разрешением, показанные на рисунке 2А – D были записаны на местах малых прямоугольников на рисунке 1С – Е. использоваться увеличения было достаточно, чтобы разглядеть отдельные КТ, появляясь как яркие, пуля-образный стержней, каждый связан с лица EGFR. QD655 имеет характерные размеры 6 х 14 нм 2. 2А (соответствует прямоугольной области указано на ячейку в FIGURe 1С) показывает, QD ​​этикетки на мембрану свернуть по диагонали пересекая изображение. Эта структура мембраны имеет более высокую плотность, чем EGFR окружающей мембраны регионов. В нескольких местах, две метки были на непосредственной близости. Два примера с расстояния 20 и 24 нм указаны с наконечниками. Эти пары меток интерпретируются как принадлежащие к EGFR димеров. 2В показывает пример от края ячейки (рис 1D, левый прямоугольник), EGFR мономеров и димеров можно рассматривать как хорошо. Фиг.2С (рис 1С, правильно прямоугольник) был записан в области с более низким флуоресцентного сигнала, т.е. меньшую плотность EGFR. Тем не менее, EGFR был также найден здесь, в димеры, а также. Кроме того, два кластеры 10 или 11 EGFRs присутствовали (см эллипсы). Рисунок 2D показан другой пример мембранной раза (рис 1E) с небольших кластеров, включая 5-6 EGFRs, в дополнение к ряду мономерови димеры. В качестве примера такого рода информацией, которая может быть получена из этих данных, пара корреляционная функция 21 г (х) определена для всех позиций этикеток на рисунке 2. Обратите внимание, что этот анализ не является частью данного протокола и порядок был описан в других местах 6,7. г (х) является мерой случайно частицы можно найти в определенном радиальном расстоянии х от опорного частицы. г (х) = 1 представляет собой случайное распределение, и большее значение свидетельствует кластеризации. Позиции в общей сложности 210 этикеток автоматически обнаружен в четырех изображений по фиг.2A-D, и г (х) была рассчитана с использованием размер бункера 5 нм и сглаживающий фильтр с полосой пропускания от 10 нм. Г (х) кривой (рисунок 3) показывает предпочтительный центра до центра QD расстояние 25 нм. EGFRs, таким образом, не ориентированы случайным образом, но значительная часть из них находится в этом предпочтительном расстоянии. С approximatе Молекулярная модель 6 (рисунок 3 вставка) мы считаем, что расстояние от центра до центра между КТ и связывающего кармана EGF составляет ~ 14 нм, и от центра до центра расстояние между двумя КТ, подключенных к EGFR димера будет ~ 27 нм (эта величина может варьироваться в зависимости от нескольких нанометров из-за гибкости линкера). Удобнее расстояние этикетки, таким образом, в соответствии с ожидаемым расстоянии этикетки для EGFR димера в пределах точности метода. Г (х) кривой больше единицы для расстояния до 300 нм, что указывает на наличие кластеров, в соответствии с данными. Это анализ показывает, что стехиометрия EGFR могут быть изучены с нашего метода. На фиг.4 показан аналогичный результат, как рисунке 2, за исключением того, что маркировка проводили с EGF-QD800, и 63X масла иммерсионный объектив был использован для флуоресцентного изображения. Эти данные подтверждают, что эти типичные результаты также установлены, когдаРЭФР наклеивания этикеток с КТ, которые испускают в ближайшее красного спектра. 4А является флуоресценция изображение представительного клетки, 4Б показан тот же ячейку в ESEM-STEM режиме обзора и рис 4С 150000-кратное увеличение изображения, записанные на верхней границе мембраны клетки (см прямоугольник на фиг.4В). Подобно Рисунок 2A и D, изображения захвата КТ-меченого EGFR на мембранный раз и показывает, мономерные, димерные и кластерных рецепторов. Обратите внимание, что электрон плотные КТ ядро выглядит несколько меньше и круглее, чем ядер квантовых точек, излучающий на 655 нм, в соответствии с их меньшим размером ядра 22 ~ 5 нм. Рисунок 1. Корреляционный ДВС, флуоресценции и ESEM-STEM ЭФР-QD655 помечены EGFR на полностью гидратированных COS-7 клеток </stРонг>. (А) ДВС изображения клеток, выращенных на площади окна мембраны грех, давая топографическую впечатление плазматической мембраны. (В) флуоресценции изображение, показывающее клеток на расположенной в центре окна SiN мембраны (отмечены пунктирной прямоугольника). (С – Е) Три ESEM-STEM низкой кратности изображения из клеток, отмеченных прямоугольниками А и В. Эти клетки Обзор изображения служат для определения точного местоположения впоследствии записанных изображений с высоким разрешением. Расположение четырех изображений с высоким разрешением (показанных на рис 2А-D) отмечены белыми прямоугольниками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <stroнг> Рисунок 2. Высокое разрешение ESEM-STEM изображения, изображающие Мембраносвязанные EGFRs. (А) Микрофотография при увеличении 75,000X области отмечены на рисунке 1В. Многие мономеры могут видеть. Несколько димеры указаны с наконечниками. (В) и (С) изображения, полученные при 50000 увеличении слева соответственно правый, мембранные области, помеченные на рисунке 1C. Кластеры EGFRs изложены. (D), изображение, записанное с увеличением 50000 на месте отмеченной на рисунке 1D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Парная корреляционная функция г (х), как функция радиального расстояния х определяется для интер-Партией НКУ расстояния всех 210 этикеток, обнаруженных на рисунке 2А-D. Пик при 25 нм показывает, что КТ расстояние от центра до центра имеет гораздо больше шансов на происходящие чем случайная, в результате чего AG (х) = 1 указывает на случайный шанс. Пунктирная линия представляет собой руководство для глаз, представляющий г (х) случайного распределения. На вставке показан приблизительный молекулярный модель EGFR димера с связанного EGF и покрытых стрептавидином КТ прикрепленных с помощью биотина. Модели стрептавидином, ЭФР и EGFR были получены от СРК моделей 1stp (стрептавидин), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO и 2GS6 (EGFR), структуры в RCSB белка белка банк данных, созданный Jmol Версия 12.2.15. Биотин модель, как обращается в RCSB лиганда Explorer версии 1.0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. /53186/53186fig4.jpg "/> Рисунок 4. Примерная COS-7 клеток помечены EGF-QD800 и полученную с корреляционного флуоресценции и ESEM-STEM. (А) флуоресценции изображение, (б) низкий обзор увеличения ESEM-STEM изображения. (С) с высоким разрешением изображения, записанного на месте прямоугольника в б в 150,000X увеличения. Мономерные, димерных и кластерные EGFRs обнаружены похож на маркировке с EGF-QD655. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Изучение пространственного распределения и стехиометрии мембранных белков, таких как EGFR, в целых клетках дает важную информацию о контекстное его функции и возможных изменений их ^11-14. Это вызов для изучения распределения мономеров, димеров и кластеров непосредственно на субклеточном уровне, используя обычно используемые методы, биохимические, информация о которых теряется о локализации белка в клетке или различия между клетками ^15. Маркировке и микроскопии методы, описанные здесь, позволяют визуализировать белковых комплексов на масштабе длины в несколько нанометров, так что его стехиометрия могут быть изучены в контексте отдельных, интактных клеток ^4-7. Это не возможно с (резолюция супер) световой микроскопии ^23, потому что его разрешение недостаточно, чтобы различить молекулы участвуют в белковом комплексе. Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) является метод усреднения ансамбль <SUP> 24, и не обязательно обнаружить димеры и высшие кластеров порядка как следствие короткого диапазона передачи энергии ^25. Расстояние Лигирование анализы ²⁶ на самом деле не измерять расстояния и, таким образом, не способна различать между сотовым области с высокой плотностью белка, неизбежно приводит к ряду обнаруженных близостей по случайности, с сотового области с аналогичной плотностью белка, но содержащий белок комплексы, обладающие различные расстояния между метками. Требуемое высоким разрешением визуализировать составляющие белковых комплексов достигается методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Тем не менее, обычные ПЭМ целых клеток ограничена требованием тонких образцов / секций нарезки через мембрану плазмы ^27, или плазматической мембраны рыхлением или разрыва ^28,29 результате чего случайным образом сформированных маленьких кусочков мембраны. Плазма мембраны таким образом, не отображаемого в целом, приводит к недостаточнойиз, возможно, решающее значение сотовой контекстная информация.

Другие экспериментальные задачи по изучению белка стехиометрии в клетках возникают из-прикладного мечения белков. Обычно используется иммуномечение несет трудности, с которыми один на один стехиометрии между рецептором и этикетки могут быть достигнуты только с одновалентной зонда; это не тот случай, когда первичные и вторичные антитела требуется. Чтобы получить информацию о белка стехиометрии, требуется, чтобы зонд связывается однозначно одним эпитопом на рецепторе и имеет один сайт связывания флуоресцентного зонда или большим числом наночастицы атомной на другой стороне. Во-вторых, точность достижима с антителами маркировки ограничено из-за их большого размера ^{от 30 до} 30 нм, так что дискриминация между соседними одиночными белков, гомодимеров, или более крупных кластеров не представляется возможным, по крайней мере, не для рецепторов семейства EGFR. Значительно меньшие специфические метки известны в литературе и САп применяться даже для внутриклеточного маркировки ^{31, но} те, которые обычно не используются. Длина всей этикетки (EGF-биотин-стрептавидин-QD), имеет такой же размерности, что EGFR, и достаточно мал, чтобы быть в состоянии обнаружить димер. Кроме того, описано двухступенчатая процедура маркировки позволяет избежать маркировки индуцированной кластеризации рецептора.

Наш метод не очень сложно, не намного больше, чем флуоресцентной микроскопии меченых белков. Однако эксперимент должен проводиться с большой осторожностью, поскольку число шагов складывает и ошибка в одном из шагов может привести к полного отказа в эксперименте. Обращение микрочипов не более утомительным, чем обращения ТЕМ сетей, но некоторые учебные пустых чипов рекомендуется. ESEM-STEM целых клеток гидратированных является, вероятно, самым трудным аспектом, и требует, по крайней мере квалифицированного оператора и несколько дней практики для того, чтобы достичь разрешения около 3 нм, необходимо визуализировать КТ. Радиационная плотинывозраст образца под следствием, представляет риск. Давление и температура должны быть тщательно наблюдали, чтобы поддерживать водный слой. Кроме того, толщина слоя воды может изменяться между клетками. Желательно, чтобы контролировать наличие слоя воды с помощью газообразного электронный детектор над образцом, как описано в другом месте ^6. Сотовые регионы должны быть отображены только один или два раза, чтобы избежать повреждений.

Ключевой ограничение метода в том, что высокое разрешение информация о ультраструктуры отсутствует. Другие методы, например, крио ТЭМ, необходимо изучить структуру белка и клеточный ультраструктуры ^15. Во-вторых, изучая динамическое взаимодействие, кратную белков в живой клетке в покадровой микроскоп не представляется возможным из-за радиационного повреждения, и требует состоянии современных световой микроскопии ^23. В настоящее время наш метод не способен определить абсолютный уровень димеров после лЭффективность abeling неизвестно, но мы ожидаем, чтобы добавить эти данные в будущем. Тем не менее можно сказать, если димеры или нет. Из литературы известно, что даже эффективность маркировки около 15% достаточно, чтобы обнаружить димеры с достаточной статистической значимости ^32.

Это легко можно изучать другие мембраносвязанных рецепторов с помощью их лигандов, с помощью биотинилированных Fab фрагментов специфических антител, или через других мелких линкеров ⁷ с использованием описанного протокола двухэтапного маркировки. Так как мы уже доказали, что два различных цвета (размеры) КТ можно использовать и наночастиц золота маркировки использовалась в предшествующей работе ^6, представляется целесообразным, чтобы маркировать несколько видов белка в том же эксперименте. Ключевой задачей для изучения стехиометрии нескольких видов белка является обеспечение аналогичный эффективность маркировки для обоих видов или, по крайней мере нормализации полученного относительной стехиометрии на уваженииив эффективность маркировки. Тем не менее, два различных КТ, используемые в данном исследовании, похоже, не сильно отличаются по эффективности маркировки (см рисунки 2 и 4). Описанный метод вовлечения двухступенчатый маркировку с КТ и корреляционный флуоресцентной микроскопии и ESEM-STEM представляет жизнеспособный способ для изучения сложной взаимосвязи мембранных белков в интактных плазматических мембран целых клеток.

Materials

Inverted fluorescence microscope	Leica	AF6000 + DMI6000B
ESEM	FEI Company	Quanta 400 FEG
Chemicals
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate	Gibco	31966-021
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid	Gibco	14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)	Gibco	16000-036
Cellstripper	Mediatech, Inc.	25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS	Carl Roth	1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)	Carl Roth	O163.2
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041-500G
Glycine	Carl Roth	T873.1
shoul	Molecular Probes	E3477
Sodium teraborate decahydrate	Sigma-Aldrich	S9640-500G
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10173MP
Materials
Silicon microchips with silicon nitride membranes	DENS Solutions	Custom made
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm